微波輔助提取紫甘藍中花青素工藝優化的研究

李艷秋，劉宇欣，李紅利

（1.漯河職業技術學院食品學院，河南漯河 462002；2.河南工業大學漯河工學院，河南漯河 462002；3.河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州 450001）

紫甘藍也叫紅甘藍，俗稱紫包菜，是蕓苔屬十字花科中的一個植物。甘藍是歐洲地中海海岸的一種蔬菜[1]，栽培史長達數十年。紫甘藍進入中國的時間相對較短，只有100 余年的歷史。紫甘藍營養價值較高，含有B 族維生素、葉酸、維C、維E、纖維素等。此外，紫甘藍中還含有豐富的花青素，花青素是一種在水中溶解性較大的細胞色素[2]，主要見于花、果、葉等中，是一種生物類黃酮物質[3]，遇酸堿時會發生變化，當細胞液為酸性時花青素溶液會偏紅，細胞液呈堿性則花青素溶液又變為藍色[4]?；ㄇ嗨卦谑称分?、化妝品、染料、醫藥等方面應用廣泛。

花青素抗氧化功能較好，是一種極好的自由基清除劑及脂質過氧化抑制劑[5]。據調查，花青素的抗氧化能力是普通抗氧化劑能力的數十倍，在醫藥、食品、化妝品等領域有非常重要的應用價值。大量資料顯示，花青素在某些方面有抗腫瘤的效果；許多科學家也從不同的研究發現花青素對預防和治療直腸癌、前列腺癌、胃癌、食道癌、皮膚癌等都有很好的療效?；ㄇ嗨乜梢酝ㄟ^提高人體的抗氧化能力，調節血清甘氨酸甘油三酯、總膽固醇和高低密度脂蛋白等功能來達到降低血糖和血脂的作用，如紫薯花青素、葡萄花青素、菊花花青素等[6]。大量的數據顯示，花青素除了具有以上作用之外，還具有保護肝臟、對睪丸的靶向作用[7]及保護視力等作用。還有報道稱其具有延緩細胞衰老、增強人體免疫、抗炎、抗疲勞及抗菌等多種功能[8]，但這些作用機制至今還不清楚，有待進一步的研究。

近年來，花青素的上述多種功效引起了廣大科研者的關注?；ㄇ嗨氐奶崛》椒ㄖ饕形⒉ㄝo助提取法、超聲波輔助提取法、酶輔助提取法、有機溶劑提取法、水浴提取法等。微波輔助提取法是最經濟、快捷、最有價值的一種提取工藝[9]。然而，微波輔助提取法也存在一些弊端，其提取設備比較昂貴，并且所選擇的溶劑也有很大的限制。欒娜等人[10]在超聲輔助提取紫甘藍中原花青素工藝的優化試驗中，在提取原花青素時，超聲波萃取對花青素浸出率影響最大的是料液比。超聲波輔助提取法的優點是提取效率較高，提取原料范圍較廣泛，提取后所得雜質較少等；缺點是對提取設備要求較高，提取時間較微波比略高等。利用生物酶萃取相對來說是一種比較省事、效率高、溫和且環保的提取方法[11]。采用生物酶輔助提取工藝具有條件溫和、操作環境安全、對環境污染比較小、提取效果高效的特點；缺點是對溫度有著較高的要求、提取成本比較高等。有機溶劑提取法是目前世界上應用最廣的一種提取花青素的方法。該方法相對來說對儀器要求比較低，操作比較簡單；但也有很多不足之處，其中最嚴重的就是大多數有機溶劑的毒副作用大，會對人體健康造成危害，并且產物提取率低。

在查閱大量文獻的基礎上以紫甘藍為研究對象，利用微波法從紫甘藍中提取花青素。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 試驗材料

新鮮紫甘藍，購自當地超市。

1.1.2 試驗試劑

將無水乙醇配制為體積分數為60%乙醇，檸檬酸配制質量分數為10%的檸檬酸溶液。

無水乙醇500 mL，天津市富宇精細化工有限公司提供；檸檬酸500 g，天津市科密歐化學試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設備

UV-2600 型紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司產品；FA2004 型電子分析天平，上海上平儀器有限公司產品；TGL-16G 型離心機，上海安亭科學儀器廠產品；HH-8 型數顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司產品；DHG-9101.1SA 型電熱鼓風恒溫干燥箱，上海三發科學儀器有限公司產品；EG823LA3-NR 型微波爐，佛山市順德區美的微波電器制造有限公司產品；FW177 型高速萬能粉碎機，北京市永光明醫療儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

以檸檬酸與乙醇混合溶液為提取劑，對紫甘藍中的花青素通過微波輔助提取法進行提取，并根據吸光度來確定花青素含量，并對紫甘藍花青素的穩定性進行了探討。

1.3.1 預處理

將采購的新鮮紫甘藍清洗切碎，放入60 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干，再打碎成粉，用60 目網篩過篩，過濾后的粉末放入密封袋內，密閉保存。

1.3.2 繪制標準曲線

（1）配制0.8%鹽酸-乙醇混合溶液。在250 mL容量瓶中用移液管準確移入2 mL 的濃鹽酸，用無水乙醇定容。

（2）配制標準溶液。將矢車菊-3-O-葡萄糖苷標準品在10 mL 的棕色容量瓶中精確稱量2 mg，用0.8%鹽酸-乙醇混合溶液定容。

（3）所使用標準溶液。在10 mL 棕色容量瓶中分別移取0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL 的標準溶液，用0.8%的鹽酸-乙醇溶液進行定容，最終得到的質量濃度為4，6，8，10，12 μg/mL 的溶液。

（4）測定標準曲線。取所使用標準溶液分別于比色皿中，以乙醇-鹽酸混合溶液為空白，于波長520 nm 處測定其吸光度。3 組平行試驗也在同一時間進行。以矢車菊-3 -O-葡萄糖苷的質量濃度為橫坐標，所對應的吸光度為縱坐標，繪制了矢車菊-3-O-葡萄糖苷的標準曲線，最終得出其回歸方程。標準曲線的回歸方程為：Y=0.050 5X+0.034 2（R2=0.999 2）。

標準溶液的吸光度見表1，標準曲線見圖1。

圖1 標準曲線

表1 標準溶液的吸光度 /μg·mL-1

1.3.3 花青素的提取及含量的計算

在電子分析天平上準確稱取2.000 0 g 紫甘藍粉末于錐形瓶中，用所選擇的料液比將乙醇和檸檬酸混合，然后在設定的提取時間和提取功率下進行提取。以轉速4 000 r/min 離心20 min，將0.4 mL離心后的上清液置于10 mL 容量瓶中，用提取劑稀釋25 倍并定容。同時，做3 組平行試驗，測定其吸光度，采用公式計算了其含量?；ㄇ嗨睾坑嬎愎饺缦拢?/p>

式中：C——測定吸光度所對應的花青素質量濃度，μg/mL；

V——提取劑體積，mL；

M——所取紫甘藍粉末的質量，g；

X——稀釋倍數。

1.4 單因素試驗

1.4.1 乙醇與檸檬酸體積比

在錐形瓶中分別準確稱取5 份2.000 0 g 樣品，再分別加入體積比為3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3 的乙醇和檸檬酸混合物，在微波功率為240 W，料液比為1∶20（g∶mL），提取時間為3 min 條件下進行提取。以轉速4 000 r/min 離心20 min，在10 mL棕色容量瓶中置于0.4 mL 上清液，稀釋25 倍，定容，搖晃均勻后測定吸光度，并根據上述公式計算出花青素含量，從而確定最佳體積比。

1.4.2 料液比

在錐形瓶中分別準確稱取5 份2.000 0 g 樣品，將料液比分別確定為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g∶mL）并固定最佳體積比，設置微波功率為240 W，提取時間為3 min 提取。以轉速4 000 r/min離心20 min，在10 mL 棕色容量瓶中置于0.4 mL 上清液，使其稀釋25 倍，定容，通過測量吸光度計算出花青素含量，最后得出最佳料液比。

1.4.3 提取時間

在錐形瓶中分別準確稱取5 份2.000 0 g 樣品，固定最佳料液比和體積比，按照微波功率為240 W，分別在微波爐中提取1，2，3，4，5 min。以轉速4 000 r/min 離心20 min，在10 mL 棕色容量瓶中置于0.4 mL 上清液，使其稀釋25 倍，定容，通過測量吸光度來計算出花青素含量，最后得出最佳提取時間。

1.4.4 微波提取功率

在錐形瓶中分別準確稱取5 份2.000 0 g 樣品，固定最佳料液比、體積比和提取時間，分別在微波爐中以80，240，400，640，800 W 的功率下提取。以轉速4 000 r/min 離心20 min，收集上清液，在10 mL 容量瓶中加入0.4 mL 上清液，使其稀釋25 倍，定容，通過測定吸光度計算出花青素含量，最終確定最佳微波提取功率。

1.5 正交試驗設計

通過以上的單因素試驗結果可知，料液比、提取功率、乙醇和檸檬酸的體積比、提取時間這4 個因素對花青素的提取率影響最大。因此，設計這4 個因素做四因素三水平正交試驗。以紫甘藍中花青素含量為參考，研究出提取紫甘藍花青素的最佳工藝條件。當正交試驗方法得出的最佳組合與極差分析結果不同時，必須進行驗證試驗。

正交試驗因素與水平設計見表2。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 乙醇與檸檬酸體積比對紫甘藍花青素含量的影響

乙醇與檸檬酸體積比對花青素含量的影響見圖2。

圖2 乙醇與檸檬酸體積比對花青素含量的影響

由圖2 可知，在研究體積比這一因素時，當固定其他因素不變時，隨著乙醇體積分數的不斷增加和檸檬酸質量分數的不斷下降，紫甘藍中花青素含量大體保持降低。其中在二者體積比從3∶7 變為4∶6 的過程中，紫甘藍花青素含量保持上升，在乙醇和檸檬酸體積比為4∶6 時，紫甘藍中花青素含量達到最大。超過這一比例，花青素含量又繼續降低。這是因為乙醇體積分數過高會破壞花青素結構，從而使得測得花青素含量變低。因此，選擇乙醇與檸檬酸最佳體積比為4∶6。

2.1.2 料液比對紫甘藍花青素含量的影響

料液比對花青素含量的影響見圖3。

圖3 料液比對花青素含量的影響

由圖3 可知，在料液比這一因素中，當固定其他因素不變時，隨著料液比的不斷升高，紫甘藍花青素含量持續升高，在料液比為1∶25 時，其含量最高，過此峰值后，紫甘藍中花青素含量又在逐漸下降。這一現象產生的原因可能是隨著料液比的增加，紫甘藍中的其他雜質也隨之增多，從而使得所提取出來的花青素含量降低，在料液比為1∶25 時，花青素含量最多。因此，選擇1∶25 為最佳料液比。

2.1.3 提取時間對紫甘藍花青素含量的影響

提取時間對花青素含量的影響見圖章4。

由圖4 可知，在選定最佳乙醇和檸檬酸體積比和料液比情況下，固定微波提取功率時，花青素提取時間越長，花青素含量先增后減。在提取3 min 時所提取出的花青素含量達到最高。其主要原因可能是由于提取時間過短時，未充分萃取花青素，而隨著提取時間的繼續延長，長時間加熱又會破壞花青素的結構，并且對花青素的穩定性也會產生一定的損害。因此，選擇3 min 為最佳提取時間。

圖4 提取時間對花青素含量的影響

2.1.4 微波功率對紫甘藍花青素含量的影響

微波功率對花青素含量的影響見圖5。

圖5 微波功率對花青素含量的影響

由圖5 可知，在選定最佳乙醇和檸檬酸體積比、最佳提取時間、最佳料液比的前提下，在微波功率為80～240 W 時，紫甘藍花青素含量升高，并且在240 W時，花青素含量達到最高。在之后更高的微波提取功率下，花青素含量又突然持續下降。這是因為花青素不耐熱，對熱非常敏感，溫度升高會使花青素的結構發生變化，使花青素含量大幅度降低。因此，選擇240 W為最佳微波提取功率。

2.2 正交試驗結果分析

在單因素試驗的基礎上，進行了L9（34）正交試驗。

正交試驗結果見表3，方差分析見表4。

表3 正交試驗結果

表4 方差分析

由表5 可知，A1B2C2D2是9 組正交試驗最佳組合，即微波功率為240 W，乙醇和檸檬酸體積比為3∶7，提取時間為3 min，料液比為1∶25。對紫甘藍花青素提取含量結果影響的主次順序為乙醇和檸檬酸體積比（A）＞微波功率（D）＞提取時間（C）＞料液比（B）。

表5 正交結果和方差分析得到的花青素含量 /mg·g-1

由表6 可知，乙醇與檸檬酸體積比（A）、料液比（B）、提取時間（C）、微波功率（D）對紫甘藍花青素提取結果均有極顯著影響。

2.3 驗證試驗

正交結果和方差分析得到的花青素含量見表5。

由表7 可知，用正交試驗和極差分析得出的結果是不同的，所以必須進行驗證試驗。以A1B2C2D2為最佳的正交試驗方案，并進行3 組平行試驗，再計算花青素含量，取平均值。A1B2C2D3是極差分析得出的最優組合，做3 組平行試驗，取平均值。將兩者所得的結果進行比較可知，極差分析得出的組合花青素含量較高，所以A1B2C2D3即料液比為1∶25，乙醇與檸檬酸體積比為3∶7，微波提取功率為400 W，提取時間為3 min 為最優提取組合。

3 結論

采用微波法，以乙醇檸檬酸混合溶液為提取劑，提取紫甘藍中的花青素。通過單因素試驗得出各個因素對紫甘藍花青素含量的影響，在單因素的基礎上又設計了正交試驗。通過正交試驗和極差分析得到了2 種不同的最優組合，最后又通過驗證試驗得出最優組合為A1B2C2D3。該方法具有操作簡便、時間短、環境友好等優點。紫甘藍花青素作為一種安全無毒的天然色素，其在食品、化妝品和醫藥等方面有很好的前景。相信在未來隨著提取方法的不斷發展，紫甘藍花青素將會應用在更多的領域，更好地為人類服務。