miR-146a通過TGF-β1/SMAD通路調控脊柱結核進展的分子機制

李小鵬 厲鋒 董陽 張揚 趙曉棟 張驍 孫泉 王軍 陳高揚

脊柱結核是最常見的肺外結核，可破壞病人椎體與椎間盤，進而形成流注膿腫，常并發脊柱畸形與截癱，甚至導致死亡，嚴重影響了人們的生活質量［1-3］。脊柱結核最重要的特征性改變是椎間盤破壞［4］，但其破壞機制不明確。轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是調控椎間盤代謝的重要因子，可通過上調基質金屬蛋白酶的表達促進膠原蛋白的降解，導致椎間盤破壞，同時對椎間盤細胞基質的合成與增殖起重要調節作用［5-6］。在脊柱結核的相關研究中，有學者報道TGF-β1能夠促使細胞內結核桿菌大量繁殖，降低單核巨噬細胞的吞噬能力，其大量聚集時可導致細胞外基質及骨質破壞、空洞和纖維化［7］?？梢奣GF-β1 在脊柱結核破壞的病理過程中起著重要的作用，但導致TGF-β1在脊柱結核中表達失衡的機制尚不明確。

微小RNA（miRNA）被認為是轉錄后水平關鍵調控因子，其可通過調控目標mRNA 的水平參與轉錄后調控，進而影響生理和病理過程［8-9］。近年來，miR-146a被證實是重要的調控性非編碼RNA，其在調節免疫炎癥反應、腫瘤、骨與軟骨代謝中發揮重要調控作用［10］。有研究提示miR-146a 通過靶向母親抗肢癱同系物4（SMAD4）調節TGF-β1表達，調控疾病進展［11-12］。TGF-β1 主要通過與其特異性受體結合激活SMAD 同系物2（SMAD2）、SMAD 同系物3（SMAD3）蛋白進入細胞核，且通過SMAD4、SMAD同系物7（SMAD7）蛋白的調控激活或抑制目的基因轉錄從而發揮生物學作用，研究顯示SMAD4在TGF-β1/SMAD信號通路占據著核心地位，是信號傳導過程中共同需要的介質［7］。因此，我們提出假設：miR-146a 通過結合SMAD4 調控TGF-β1/SMAD 通路，進而調控脊柱結核進展。

在本文中，我們擬探究miR-146a是否通過介導TGF-β1/SMAD通路調控脊柱結核進展，以期為深入了解脊柱結核發生發展提供新的見解，以及為脊柱結核的防治提供新的策略。

材料與方法

一、標本收集

試驗對象為在濰坊市人民醫院脊柱外科行脊柱結核病灶清除手術及脊柱外傷手術可取得的髓核及血液標本的病人，遵循其知情同意。在取得病人的知情同意書后方能入組，其中結核組病人10 例，男5，女5，年齡為（34.2±10.3）歲；外傷對照組病人10例，男5，女5，年齡為（32.1±14.0）歲。

入組標準：結核組根據術前影像學（圖1）及臨床癥狀，術后的組織病理檢查等明確診斷，排除其他疾病。對照組病人排除脊柱其他感染性疾病、腫瘤及免疫學疾病等。本實驗所有臨床標本均根據《赫爾辛基宣言》經病人及家屬同意后采集，研究方案獲得濰坊人民醫院倫理委員會批準（倫理批號：KYLL20190412-1）。

圖1 CT 檢查矢狀位（a）和水平位（b）所示結核感染椎間盤及椎體骨破壞

二、試劑與儀器

由武漢普諾賽生命科技有限公司購得人椎間盤髓核細胞完全培養基，由中國漢恒生物科技有限公司購得miR-146a 的抑制劑（inhibitor，序列為：5'-AACCCAUGGAAUUCAGUUCUCA - 3'）、模 擬 物（mimics，序列為：5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3'，5'-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU-3'）以及野生型和突變型（miR-146a 結合位點突變）SMAD4序列的螢火蟲熒光素酶報告基因質粒，由日本TAKARA 公司購得PrimeScript RT 試劑，由中國碧云天購得RIPA 裂解緩沖液、PBS 溶液、ELC 顯色液，由美國Invitrogen 購得liposome 2000、Trizol 試劑和蛋白第二抗體，由上海生工生物技術有限公司設計合成熒光定量PCR 引物（表1），由美國Signalway Antibody 公司購得蛋白提取試劑盒，由英國Abcam公 司 購 得GAPDH（ab9485；1∶5 000）、SMAD2（ab280888；1∶1 000）、SMAD3（ab40854；1∶1 000）、SMAD4（ab40759；1∶1 000）、SMAD7（ab216428；1∶1 000）抗體。由美國菌種保藏中心購得293T細胞，由美國Applied Biosystems 購得StepOne Plus 熒光定量PCR儀，由美國ThermoFisher公司購得酶標儀，由德國Leica公司購得倒置熒光顯微鏡。

表1 本研究中使用的引物序列

三、細胞分離與培養

結核組病人和對照組病人椎間盤髓核細胞的分離方法參照前期文獻［13］，細胞培養在人椎間盤髓核細胞完全培養基中，放置于細胞培養箱中（5%CO2，37 ℃），每3天更換培養液，待貼壁細胞擴增至80%，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

四、構建miR-146a的抑制劑和模擬物及細胞轉染方法

由漢恒生物構建miR-146a 的抑制劑（inhibitor）和模擬物（mimics），用于細胞水平敲低和過表達miR-146a。細胞轉染步驟簡述如下：將脊柱結核病人髓核細胞均勻鋪種于12孔板或96孔板，待細胞密度達50%，更換培養基為無血清培養基，應用liposome 2000 將miR-146a mimics（mimics 組）和miR-146a inhibitor（inhibitor 組）轉染進入脊柱結核病人髓核細胞，同時設置control組，6小時后更換為正常培養基，每個實驗重復3次。

五、增殖實驗

將結核組和對照組髓核細胞、敲低/過表達miR-146a 脊柱結核病人髓核細胞鋪種于96 孔板（100 μL/孔），然后將培養板放在培養箱中預培養。24小時后向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，將培養板置于培養箱內孵育1～4 h 后，上清液轉入新的96 孔板中，應用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度，每個實驗重復3次。

六、遷移實驗

將結核組和對照組髓核細胞、敲低/過表達miR-146a脊柱結核病人髓核細胞鋪種于12孔板，待細胞貼壁后，應用直尺和20 μL槍頭均勻地劃橫線，寬度約500 μm，PBS 清洗劃除的細胞后，培養皿放置于37 ℃，2%CO2細胞培養箱中。培養24、48 h后拍照并計算劃痕處細胞相對位移，每個實驗重復3次。根據位移計算細胞遷移能力，細胞遷移率=（初始劃痕寬度-24/48小時后劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。

七、RNA表達檢測

應用TRIZOL 法提取結核組病人和對照組病人髓核組織及外周血、敲低和過表達miR-146a脊柱結核病人髓核細胞的總RNA，然后應用逆轉錄試劑逆轉錄為cDNA。使用StepOnePlus定量PCR系統通過熒光定量PCR 擴增cDNA。U6 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）分別用作miRNA 和mRNA 的內部參考基因。

八、Western blot檢測蛋白表達

使用蛋白提取試劑盒提取結核組病人和對照組病人髓核組織、敲低和過表達miR-146a脊柱結核病人髓核細胞的總蛋白，將變性蛋白在SDS-PAGE 凝膠上分離，然后轉移到PVDF 膜上。接下來，將PVDF 膜 與GAPDH（ab9485；1∶5 000）、SMAD2（ab280888；1∶1 000）、SMAD3（ab40854；1∶1 000）、SMAD4ab40759；1∶1 000）、SMAD7（ab216428；1∶1 000）抗體在4°C下孵育過夜后，將PVDF膜與相應的第二抗體（A32731）在25 ℃下培養1小時。最后，將ECL顯色溶液添加到PVDF膜中以顯示蛋白質帶。

九、熒光素酶報告基因實驗

將293T 細胞接種到96 孔板，由漢恒生物構建野生型和突變型（miR-146a 結合位點突變）SMAD4序列的螢火蟲熒光素酶報告基因質粒，將上述質粒分別與miR-146a mimics 或mimics control 轉染入293T細胞，設置單純轉染螢火蟲熒光素酶報告基因質粒為對照組。同時，向每組中加入等量海參熒光素酶報告基因質粒為參照。轉染48小時后，應用酶標儀檢測兩種熒光活性，并計算相對熒光活性。

十、統計學分析

數據描述為均值±標準差，通過GraphPad Prism 7.5（GraphPad Software，美國）進行分析和可視化。使用學生Student t檢驗比較兩組之間的差異，P＜0.05 提示差異有統計學意義。使用Pearson 相關系數分析分子之間表達的相關性。

結 果

一、結核感染椎間盤細胞增殖和遷移能力變化

通過劃痕實驗發現，結核組病人的髓核細胞24 h和48 h 的遷移率顯著低于對照組病人的髓核細胞（圖2 a、b），同時CCK-8實驗提示結核組病人髓核細胞的增殖活性顯著低于對照組病人（圖2 c）。上述結果提示結核感染可導致髓核細胞的遷移及增殖活性顯著減弱。

圖2 結核組病人的髓核細胞增殖（a、b）和遷移能力（c）顯著減低，和對照組比較，***P＜0.001

二、miR-146a在結核病人組織中表達量鑒定

miR-146a 在脊柱結核病人的髓核組織中表達量顯著低于對照組（差異倍數：0.55±0.24，P＜0.001，圖3 a），miR-146a 在脊柱結核病人的外周血中的表達量顯著低于對照組（差異倍數：0.56±0.36，P＜0.05，圖3 b），提示miR-146a表達量與脊柱結核的進展呈負相關。

圖3 miR-146a在脊柱結核病人髓核組織（a）和外周血（b）中表達量顯著減低，和對照組比較，*P＜0.05，***P＜0.001

三、SMAD 通路在髓核組織中的表達水平與miR-146a表達量相關性檢測

我們進一步檢測了Smad 通路關鍵基因及蛋白在結核組病人和對照組病人髓核組織中的表達量，PCR 結果發現髓核組織中SMAD2（差異倍數：2.58±2.19，P＜0.05）、SMAD3（差異倍數：9.69±4.44，P＜0.001）、SMAD4（差異倍數：10.11±6.48，P＜0.001）、TGF-β1 mRNA（差異倍數：5.26±1.66，P＜0.001）在脊柱結核病人髓核組織中的表達量顯著增高，而SMAD7 mRNA（差異倍數：0.47±0.33，P＜0.01）表達顯著減低（圖4 a），Western blot結果提示蛋白表達趨勢與qPCR一致（圖4 b、c）。上述結果提示miR-146a表達量與SMAD2、SMAD3、SMAD4、TGF-β1 顯著負相關，而與SMAD7呈顯著正相關。以上結果提示在髓核組織中，SMAD 通路活性與miR-146a 顯著負相關，在髓核細胞中miR-146a對SMAD 通路可能具有抑制作用。

圖4 SMAD通路關鍵基因mRNA（a）和蛋白（b、c）在脊柱結核髓核組織中表達量鑒定，和對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

四、miR-146 靶向Smad4 調控SMAD/TGF-β1 通路鑒定

已有研究提示miR-146a可靶向結合SMAD4 3’-UTR 端進而抑制其表達，我們在實驗中構建了包含SMAD4 3’-UTR端野生型或突變型序列的熒光素酶報告基因質粒（圖5 a），并與miR-146a mimics共同轉染293T 細胞，結果提示：與對照組相比，SMAD4 3’-UTR 端野生型熒光素酶報告基因質粒與miR-146a mimics共同轉染時，熒光活性顯著減低，而SMAD4 3’-UTR 端野生型熒光素酶報告基因質粒與mimics 對照組，以及SMAD4 3’-UTR 端突變型熒光素酶報告基因質粒與miR-146a mimics 或mimics 對照組熒光活性無明顯變化，提示miR-146a mimics可靶向識別SMAD4 3’-UTR 端（圖5 b）。為了進一步明確miR-146a 在髓核細胞中對SMAD 通路的調控作用，我們通過體外實驗在脊柱結核病人髓核細胞中過表達或敲低miR-146a（圖6 a），并檢測SMAD/TGF-β1 通路表達變化，結果提示過表達miR-146a 可顯著下調SMAD2、SMAD3、SMAD4和TGF-β1 mRNA及蛋白表達水平，但可上調SMAD7表達水平；相反，敲低miR-146a 可顯著上調SMAD2、SMAD3、SMAD4 和TGF-β 1 mRNA 及蛋白表達水平，但可下調SMAD7 表達水平（圖6 b～d）。上述實驗結果進一步證實miR-146a在髓核細胞中可調控SMAD/TGF-β1通路。

圖5 SMAD4 3’-UTR端miR-146a結合位點預測（a）及熒光素酶報告基因實驗驗證（b），和對照組比較，***P＜0.001

圖6 敲低/過表達miR-146a（a）對SMAD通路關鍵基因mRNA（b）和蛋白（c、d）表達影響，和對照組比較，*P＜0.05，***P＜0.001

五、miR-146a調控脊柱結核髓核細胞增殖及分化作用及機制鑒定

我們同時驗證了過表達或敲低miR-146a 對脊柱結核病人髓核細胞增殖、凋亡及遷移的影響，結果提示：相較于control組，過表達miR-146a（mimics組）可顯著促進髓核細胞增殖及遷移活性并降低其凋亡活性，而敲低miR-146a（inhibitor 組）可顯著降低髓核細胞增殖及遷移活性并促進其凋亡活性（圖7 a～c），上述結果提示miR-146a是促進髓核細胞增殖及遷移活性的關鍵因子。

圖7 敲低/過表達miR-146a對結核髓核細胞遷移（a、b）和增殖（c）影響，和對照組比較，**P＜0.01，***P＜0.001

討 論

脊柱是全身骨關節結核最易發生的部位，其中以椎體結核占大多數［3］。研究表明，結核感染可致椎間盤髓核破壞，是造成椎間盤破壞的重要因素［14］。

miR-146a 的編碼基因位于人類5 號染色LOC285628 基因上的第二外顯子，miR-146a 功能極其強大，是首個具有免疫系統調節作用的miRNA，其主要作用是負性調節免疫炎癥反應，包括類風濕性關節炎、紅斑狼瘡等多種免疫性疾?。?5-16］。在我們的研究中發現miR-146a 表達量在脊柱結核中顯著減低，提示其可能與脊柱結核進展相關，但其可能參與的機制仍鮮有研究報道。

有研究發現全反式維甲酸可誘導miR-146a通過靶向SMAD4調節急性粒細胞白血病細胞的增殖［17］。Liu等［18］的研究發現miR-146a通過靶向調控SMAD4進而調節TGF-β1 誘導人上皮成纖維細胞分化。上述所有的文獻均揭示了SMAD4 是miR-146a 的標靶蛋白。TGF-β1/SMAD 通道是脊柱結核椎間盤破壞發生發展的關鍵信號通路，研究報道高劑量TGF-β1可通過結合特異性受體激活SMAD2、SMAD3蛋白進入細胞核，進而通過調控髓核細胞代謝促進髓核退變［5，19-20］。SMAD4在TGF-β1/SMAD信號通路占據著核心地位，SMAD4 是促進SMAD2/3 蛋白入核過程中的關鍵介質，而SMAD7 在此過程中發揮抑制作用［5，19-20］。同時，目前已有證據證明SMAD4 與椎間盤退變密切相關，在椎間盤退變組織中的表達明顯高于正常椎間盤組織［21］，而miR-146a 是SMAD4 的關鍵抑制劑，因此我們推測miR-146a在脊柱結核中是否可通過TGF-β1/Smads 通路調控脊柱結核髓核退變（圖8）。

圖8 miR-146a調控TGF-β1/SMAD通路示意圖（繪圖作者：陳高揚）

在我們的研究中，我們首先通過相關性分析證實miR-146a 表達量與SMAD2、SMAD3、SMAD4 和TGF-β1 表達量呈顯著負相關，而與SMAD7 呈正相關，提示miR-146a 對TGF-β1/SMAD 通路具有抑制作用。進一步體外細胞實驗證實，過表達miR-146a可顯著抑制TGF-β1/SMAD 通路活性并促進髓核細胞增殖、遷移并抑制凋亡，而敲低miR-146a 結果相反，進一步證實miR-146a可通過抑制TGF-β1/SMAD通路促進髓核細胞增殖及遷移活性。

當然，本研究仍存在一定的不足。一方面，本研究僅用PCR 法檢測了miR-146a 在結核病人外周血及滑膜組織中的表達量，未能在組織水平對miR-146a進行免疫熒光原位雜交定位，以及miR-146a與組織標本中相關分子免疫組化的關聯研究；另一方面，本研究基于樣本檢測解釋了miR-146a在脊柱結核組織中的表達趨勢，并通過體外細胞實驗證實了miR-146a 對TGF-β1/SMAD 通路活性及髓核細胞增殖及遷移活性的調控作用，但由于脊柱結核動物模型造模難度較大，因此并未能從動物水平闡明miR-146a對脊柱結核的治療功效。因此，未來仍需開展動物實驗探討miR-146a 在治療脊柱結核中的應用前景。

綜上所述，通過本研究，我們發現miR-146a 是脊柱結核進展的關鍵調控因子，其可通過抑制TGFβ1/SMAD 通路活性進而調控髓核細胞增殖及遷移活性，本研究為深入了解脊柱結核發生發展的分子機制提供了新的見解，同時為脊柱結核的治療提供新思路。