mRNA 治療用納米載體研究新進展

石立旺，張楠，祝綸宇，王穎，郭敏，杜超

基因藥物治療是以 mRNA 作為橋梁，將 DNA 的遺傳密碼傳輸到核糖體中進行蛋白質表達，恢復人體內缺失的蛋白質或創造新的蛋白質來達到治療疾病的目的。理論上，mRNA 擁有能夠合成“任意一種蛋白質”的潛力，將mRNA 制成疫苗或者藥物，相當于送出一張可以在人體內生成藥物工廠的“施工圖紙”，根據這張“圖紙”，mRNA 可以在細胞內翻譯表達而無需進入細胞核，因此相比于 DNA藥物或傳統的功能性生物分子，mRNA 療法具有獨特的優勢。首先，mRNA 不會整合到宿主的基因組中，避免基因突變的風險。其次，mRNA 免疫源性低，不易觸發機體免疫反應，半衰期短、代謝產物純天然，沒有持續累積毒性的風險。再次，負載 mRNA 的疫苗可以誘導 T 細胞和自然殺傷細胞攻擊癌細胞，還能夠激活 toll 樣受體和視黃酸誘導基因 I，在體內產生免疫腫瘤的微環境[1-2]。最后，mRNA很容易通過體外轉錄過程合成，這個過程相對廉價，并且可以快速應用于各種療法。因此，從制藥行業的角度來看，mRNA 是一種非常有潛力的候選藥物，可以滿足基因治療、癌癥治療以及開發疫苗等需求。盡管 mRNA 在治療疾病方面具有獨特的優勢，但由于其很容易被酶降解，不容易被靶細胞攝取，因此如何高效穩定地將其進行細胞內傳遞是臨床應用中面臨的主要問題。為了克服這一障礙，人們已經開發出病毒載體和非病毒載體用于遞送 mRNA。病毒載體可能引起嚴重的不良反應甚至死亡，臨床應用十分有限。而非病毒載體，包括脂質納米顆粒、病毒樣顆粒、聚合物納米顆粒、無機納米顆粒和外泌體，具有安全性高、靶向性強的優點，是臨床研究的熱點（圖 1）。本文介紹了 mRNA 藥物的發展歷程、治療過程、設計原則、遞送體系及其生物醫學應用中的研究熱點，討論了基于 mRNA 的治療方法存在的種種挑戰和應用前景。

圖1 目前基因治療常用的非病毒載體（脂質納米顆粒、聚合物納米顆粒和無機納米顆粒先進入核內體，然后進入溶酶體和細胞。病毒樣顆粒先進入核內體，再進入細胞。外泌體和仿生納米顆粒通過膜融合和各種內吞途徑進入細胞[3]）

1 mRNA 療法的發展歷程

從 1961 年首次發現 mRNA 到 mRNA 藥物或疫苗首次在臨床應用歷經了半個世紀。1978 年，Dimitriadis 成功地用脂質體將外源性 mRNA 轉染到小鼠淋巴細胞中[4]。同年，Ostro 等[5]將 mRNA 轉染到人細胞。1984 年，Krieg和 Melton[6]成功合成具有生物活性的 mRNA 并將其注射到青蛙卵中，證實了人造 mRNA 的功能與內源性 mRNA相似。Malone 等[7]于 1989 年首次提出 mRNA 疫苗的概念。與此同時，以陽離子脂質體為載體的 mRNA 遞送系統“lipofectin”被商業化。1995 年，科研人員首次將 mRNA編碼的癌癥抗原注射到體內，以進行癌癥免疫治療研究，但是基于當時的技術條件，mRNA 的安全性、穩定性以及藥物遞送等方面需進一步驗證，臨床試驗并沒有取得太大的進展[8]。到了 21 世紀，隨著醫學研究技術的進步，mRNA 的合成、修飾和遞送技術有了新的進展，mRNA 療法得到研究人員和一些生物制藥公司的關注。2011 年，轉錄激活因子樣效應物核酸酶技術被開發用于基因編輯[9]，為 mRNA工程提供了強有力的工具。此外，SARS-COV-2 的爆發加速了 mRNA 疫苗的開發。2020 年 12 月 11 日，輝瑞公司的疫苗 BNT162b2 獲得了 FDA 的緊急授權，成為首個用于人類的 mRNA 藥物。

2 mRNA 療法的治療過程

mRNA 藥物在體內發揮作用大體可分成六個步驟：第一步，注射的 mRNA 藥物被抗原呈遞細胞內吞；第二步，mRNA 進入胞質后，由核糖體翻譯成蛋白質，翻譯的抗原蛋白通過多種途徑激活免疫系統；第三步，細胞內抗原被蛋白酶體復合物分解成較小的片段，片段通過主要組織相容性復合體（MHC）I 類分子遞送給細胞毒性 T 細胞；第四步，活化的細胞毒性 T 細胞通過分泌穿孔素、顆粒酶等細胞因子殺死感染細胞；此外，分泌的抗原可被細胞攝取，在核內體降解，并通過 MHC II 類分子遞送給輔助 T 細胞；最后，輔助 T 細胞刺激 B 細胞產生抗體，并通過炎性細胞因子激活吞噬細胞，清除病原體（圖 2）。

圖2 mRNA 療法的治療過程[10]

3 mRNA 的設計原則

mRNA 疫苗或藥物是用合成的 mRNA 分子生產抗原，從而引發機體免疫反應。mRNA 分子的序列設計主要模仿了內源性 mRNA 的五個結構部分，分別是：5' 帽子、5' 非翻譯區（5'UTR）、開放閱讀框（ORF）、3' 非翻譯區（3'UTR）和多尾 A（圖 3）。如果是自我擴增的 mRNA，還會含有 RNA 聚合酶的基因，這種 RNA 聚合酶在細胞內擴增 mRNA，從而生產較多的抗原。

圖3 體外轉錄 mRNA 的關鍵結構：5' 帽子、5'UTR、ORF、3'UTR 和多尾 A[11]

科研人員根據 5' 末端第一個或第二個核苷酸的羥基上是否有甲基化的核糖，把 5' 帽子分為 O 型、I 型和 II型。5' 帽子不僅可以阻止細胞質傳感器的識別，從而防止錯誤的免疫反應，而且能夠在空間上保護 mRNA 不被核酸外切酶降解。另外，5' 帽子可以和多尾 A、多尾 A 結合蛋白以及翻譯起始因子協同工作，從而環化 mRNA 并募集核糖體進行轉錄。

5'UTR 的主要功能是幫助 mRNA 與核糖體結合。早期研究表明，鳥嘌呤和胞嘧啶含量高的 5'UTR 可以抑制mRNA 翻譯。因此，在設計 5'UTR 時應減少鳥嘌呤和胞嘧啶的數量。此外，由于 AUG 會破壞 ORF 的翻譯，在設計 5'UTR 時應避免使用 AUG 作為起始密碼子[12]。

ORF 作為抗原-蛋白編碼區，其翻譯效率至關重要。富含鳥嘌呤和胞嘧啶的 ORF 具有更高的翻譯效率。有研究表明，在不改變編碼蛋白氨基酸序列的情況下，將宿主體內罕見的密碼子改變為常見的密碼子，可以提高蛋白的表達水平[13]。此外，科研人員有時會通過 ORF 區的內部修飾（N6-腺苷酸甲基化、胞嘧啶羥基化、尿苷酸甲基化或假尿苷）來加強翻譯。這是因為所有原生 mRNA 都包含修飾核苷，所以免疫系統會識別無修飾的單鏈 RNA，然后產生干擾素，阻止 mRNA 翻譯。使用修飾核苷可以防止被識別，從而保證翻譯足夠的蛋白質。

3'UTR 和多尾 A 是 mRNA 必需的序列，長度與翻譯效率成正比。3'UTR 具有調節 mRNA 翻譯、半衰期和亞細胞定位的功能。多尾 A 的長度大于 100 bp 是治療性mRNA 的最佳選擇；長度在 100 ～ 150 bp 能夠與多尾 A 結合蛋白形成起始轉錄的復合體，保護 5' 帽子不被酶降解。

4 非病毒載體遞送系統

mRNA 必須進入宿主細胞并表達才能發揮功能，帶負電荷的 mRNA 很難穿過細胞膜上的陰離子磷脂雙分子層，且容易被免疫系統中的細胞吞噬和核糖核酸酶降解。因此，mRNA 遞送系統不僅要提高宿主細胞的攝取，還要保護mRNA 不被降解。目前，能夠達成這個目標并且臨床效果較好的是非病毒載體。下面將介紹非病毒載體遞送系統的開發和應用。

4.1 脂質納米顆粒遞送系統

脂質納米顆粒（LNPs）通常由四種成分組成：可電離脂質、膽固醇、聚乙二醇化磷脂和輔助脂質，它們共同包裹mRNA，保護其不被降解?？呻婋x脂質能夠促進 mRNA 的封裝和釋放。膽固醇嵌入磷脂分子之間，調節磷脂膜的流動性，降低膜的滲透性，減少 mRNA 滲漏。此外，它可以保持脂質膜的柔韌性，調節磷脂的相變，防止氧化，增強 LNPs抵抗外部條件變化的能力。聚乙二醇化磷脂可以使 LNPs表面覆蓋親水性保護膜，防止其被免疫系統中的細胞清除。輔助磷脂可以提高 LNPs 整體的相變溫度和穩定性。飽和輔助脂質（例如二硬酯酰磷脂酰膽堿）最適合遞送短鏈RNA（例如 siRNA），不飽和輔助脂質（例如二油酰磷脂酰乙醇胺）最適合遞送 mRNA。

LNPs 作為 mRNA 的載體有非常廣泛的應用。例如，根特大學的研究人員制備了在生理條件下可降解的 1,2,4-三唑啉-3,5-二酮綴合物并成功包裹 mRNA，用于提高多種細胞的 mRNA 轉染效率[14]。COVID-19 mRNA LNPs 疫苗在不同人群中顯出優異的保護效果[15]。盡管 LNPs 作為遞送 mRNA 的平臺表現出優異的預防和治療疾病效果，但LNPs 有潛在的毒理學作用，會誘導免疫反應，促進中性粒細胞浸潤，從而導致炎癥。此外，已有報道 LNPs 能夠引起疼痛、紅腫和發燒等副作用[16]。因此，LNPs 給藥系統的細胞毒性和免疫原性尚有待進一步探索。

4.2 病毒樣顆粒遞送系統

病毒樣顆粒（VLP）是由一種或多種病毒結構蛋白通過自組裝而形成的納米級顆粒，直徑 20 ～ 200 nm，形態上類似于天然病毒，但通常不包含親代病原體遺傳物質。通過病毒工程技術將 mRNA 與 VLP 衣殼蛋白特異性識別，可以形成 VLP-mRNA，再利用 VLP 的粒徑優勢和衣殼蛋白，使 mRNA 很容易地進入相關免疫細胞中，瞬時感染細胞，有效降低脫靶效應（圖 4）[17]。上海交通大學的研究人員使用攜帶 mRNA 的慢病毒顆粒直接靶向 I 型單純皰疹病毒（HSV-1）基因組，該顆粒有效地阻止了 HSV-1 復制和皰疹性基質性角膜炎的發生[18]?；羧A德·休斯醫學研究所設計了一種人鼠逆轉錄病毒樣蛋白，并將其制作成 VLP 用來遞送特定的 mRNA，極大地拓展了核酸治療的應用范圍[19]。作為一種天然可生物降解納米材料，VLP 避免了由逆轉錄病毒引起的基因組缺失。隨著基因技術的進一步發展，VLPs 作為安全有效的疫苗和基因編輯傳遞工具逐漸得到研究開發。

圖4 病毒樣顆粒遞送系統（病毒樣顆粒從血管進入體內，在躲避巨噬細胞吞噬的同時觸發靶細胞內吞，然后釋放 mRNA 藥物[17]）

4.3 仿生納米顆粒遞送系統

仿生納米顆粒（CM-NPs）主要由功能性納米顆粒和具有生物活性的細胞膜涂層組成，其中功能性納米顆粒攜帶化療藥物、基因藥物等，發揮治療作用。細胞膜涂層包括紅細胞、白細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞、細菌以及各類工程化細胞，發揮包封、遞送、保護、靶向和長循環作用（圖 5）。鑒于腫瘤細胞和細菌表面的特定蛋白質能夠激活免疫系統和提高黏附性，CM-NPs 在 mRNA 藥物的功能傳遞上比傳統納米載體更加多樣化。例如，甲型流感病毒表面的血凝素（HA）蛋白在體內 pH 值下將病毒包膜與周圍膜融合，輕松地將其遺傳物質傳遞到宿主細胞的細胞質基質中。受此啟發，加州大學圣地亞哥分校的研究人員使用細胞膜涂層制造能夠體內逃逸的仿生納米顆粒，并使其表達 HA。在體內和體外評估中，這些納米顆粒能夠將 mRNA 有效傳遞到靶細胞的細胞質基質中，并顯著提高蛋白質的表達水平[21]。此外，利用細胞膜上的特異性識別蛋白可以實現靶向給藥，從而大大改善治療效果。同濟醫院的研究人員設計了一種腫瘤靶向肽（cRGD）修飾的癌細胞膜包被的碳酸鈣納米顆粒，用于遞送 IL-12 mRNA。cRGD 修飾的 CM 作為外殼可以賦予納米顆粒在腦腫瘤微環境中的靶向作用。載有 IL-12 mRNA 的碳酸鈣納米顆?？梢灾委熡蓧乃佬缘蛲稣T導的免疫反應[22]。盡管 CM-NPs 在遞送 mRNA 方面具有明顯的優勢，但現有的制備技術仍然不完善。因此，在實現臨床應用前仍有許多工作需要開展。

圖5 通過共擠壓法獲得多種仿生納米顆粒[20]

4.4 聚合物納米顆粒遞送系統

聚合物納米顆粒遞送體系由陽離子聚合物、樹枝狀聚合物或多糖聚合物組成。陽離子聚合物易于合成和改性，可以通過靜電吸引和疏水相互作用與 mRNA 締合，有助于形成更穩定的多聚體[23]。經化學改性的聚乙烯亞胺毒性低，傳遞效率高，是常用的陽離子聚合物。

樹枝狀聚合物是一種柔性大分子，直徑在 2 ～ 20 nm，由中心分子和樹突狀的側鏈部分組成，側鏈中的官能團可以被修飾以改善聚合物的溶解度、組織結合和藥代動力學等性質。德克薩斯州立大學的研究人員開發了基于樹枝狀聚合物的納米遞送系統。該系統可以成功將多種 mRNA 運送到腫瘤組織，并通過近紅外成像標志腫瘤區域，同時發揮診斷、檢測和治療作用[24]。

多糖包括殼聚糖、海藻酸鹽、右旋糖苷和透明質酸，主要來源于高等植物、動物、微生物、地衣和海藻中，具有毒性低，生物相容性高的特性，經化學改性后可作為載體材料。天津大學的研究人員開發了一種殼聚糖納米機器，它具有程序化捕獲、無需冷凍條件長期儲存以及在細胞中有效遞送mRNA 的功能[25]。勃蘭登堡再生治療中心的研究人員用膠原蛋白-透明質酸水凝膠封裝血管內皮生長因子（VEGF）的mRNA 來調節 VEGF 和促血管生成素的分泌[26]。

這三種聚合物可以結合使用以獲得更高的遞送效率和安全性。此外，有些聚合物不屬于上述三種類型。例如，伊朗大不里士醫科大學的科研人員開發了聚乳酸-羥基乙酸共聚物/聚乙烯亞胺納米顆粒遞送編碼綠色熒光蛋白的mRNA[27]。東京大學的科研人員設計了由 PEG 和 mRNA組成的遞送體系。該遞送系統顯示出強大的 RNA 酶抗性和優秀的蛋白表達效率[28]。

4.5 無機納米顆粒遞送系統

無機納米顆粒具有良好的存儲穩定性、優異的生物相容性和易于制備等特點。目前，常用的無機納米顆粒包括量子點、二氧化硅納米顆粒、磁性氧化鐵納米顆粒和金納米顆粒。首爾大學的研究人員合成了 N 摻雜石墨烯量子點，用于轉染多種 mRNA 和質粒脫氧核糖核酸[29]。中科院納米所的研究人員開發了介孔二氧化硅納米顆粒，能夠在小鼠體內傳遞熒光素酶 mRNA 的同時實現高效的細胞攝取[30]。氧化鐵納米顆粒是一種以鐵基氧化物為主要成分的納米級磁性材料，具有超順磁性，已被廣泛應用于生物醫學研究。華盛頓大學的研究人員將 mRNA 和超順磁性氧化鐵納米顆粒復配在一起，開發了一種用于預防新冠病毒（SARS-CoV-2）的mRNA 疫苗。該疫苗在 4 ～ 25 ℃ 能穩定存在長達 3 個月，臨床試驗結果良好，有望成為 SARS-CoV-2 病毒疫苗[31]。盡管這些無機納米材料具有優異的載體特性，但是其在體內無法降解或清除，因此需要開展詳細的毒理學研究，以評估體內積累而導致的毒性問題。

4.6 外泌體納米顆粒遞送系統

外泌體是由細胞產生的一種進行細胞間通訊的胞外小泡，直徑為 30 ～ 150 nm，能夠攜帶核酸、蛋白質、脂類和酶，并在細胞間進行傳遞（圖 6）。天然外泌體遞送 mRNA具有兩個明顯優勢。第一，由于外泌體體積小，可減少免疫系統的清除作用，從而將更多的藥物運輸到病變部位。北卡羅萊納州立大學的研究人員開發了可吸入外泌體，將 mRNA遞送至嚙齒動物和非人靈長類動物的肺部[32]。第二，外泌體可以輕易穿過血腦屏障，將藥物輸送到大腦。俄亥俄州立大學的研究人員制備了大量含有治療性 mRNA 的外泌體，用于腦膠質瘤治療。將靶向肽修飾到外泌體膜蛋白 CD47的 N 端，可以增強膠質瘤細胞對外泌體的攝取，減少對其他組織的副作用[33]。此外，外泌體的表面功能化可以實現靶向傳遞。例如，通過在外泌體表面蛋白 Lamp2b 的 N 端融合軟骨細胞親和肽構建靶向軟骨細胞的外泌體，用于封裝CRISPR/Cas9 質粒并遞送至嵌入關節軟骨中的軟骨細胞，減輕軟骨損傷[34]。由于外泌體表面的抗原能夠增強患者的細胞免疫反應，因此，外泌體可以作為腫瘤和新冠病毒疫苗的載體。在疫苗的研發中，外泌體疫苗能夠裝載和遞送更多的 mRNA，顯著誘導人體長期免疫應答并且沒有任何毒副作用[35]。

圖6 外泌體將基因藥物遞送至靶細胞，通過翻譯蛋白質、RNA 干擾和基因組編程治療疾病[3]

5 研究熱點

mRNA 分子量大，帶負電荷，在到達細胞內目標位點前必須跨越多個組織和細胞屏障。因此，需要用載體將mRNA 保護起來，使其更易進入目標位點。目前常用的載體有 LNPs、VLP、CM-NPs、聚合物納米顆粒、無機納米顆粒和外泌體。這些載體在臨床應用及科學研究中往往存在以下問題：①LNPs、聚合物納米顆粒和無機納米顆粒在注射入體內后主要積聚在肝臟中，不能精確地將足夠的mRNA 遞送到靶細胞；②生產外泌體的主要方法是細胞培養和生物反應器，但其生產規模較小，經濟成本較高，不適合臨床應用。以下將探討目前所面臨的主要問題及可能的解決方案。

5.1 靶向納米顆粒

靶向納米顆粒能夠將 mRNA 選擇性地運送到目標位點，減少運送過程中損耗，提升傳遞效率，加強免疫反應的持續時間，因而廣泛受到研究人員的青睞。目前，制備靶向顆粒的主要方法有：優化納米顆粒配方、添加選擇性器官靶向（SORT）分子、修飾能夠與細胞膜受體特異性結合的蛋白質。例如，在脂質結構中，季銨比伯胺表現出更強的質子海綿效應，長鏈烷基的不飽和雙鍵使膜具有更高的流動性，這有助于改善 mRNA 體內逃逸，增加 mRNA 的翻譯?；谏鲜鲈?，麻省理工大學的研究人員用含有季銨和炔烴的二油酰磷脂酰膽堿與脂質、膽固醇、DMG-PEG 共同制備了靶向肝臟的 LNPs[36]。德克薩斯大學西南醫學中心的研究人員通過添加選擇性 SORT 分子，系統設計了選擇性靶向肺、脾臟和肝臟的無機納米顆粒，以選擇性編輯和治療多種細胞[37]。塔爾圖大學的研究人員將細胞穿透肽修飾到聚合物納米顆粒表面，從而將 mRNA 選擇性遞送到脾臟中[38]。

5.2 外泌體的工業化生產

外泌體具有較高的生物相容性、生物利用率和跨生物屏障能力，因此被認定為極具作為 mRNA 藥物遞送載體的潛力。隨著未來對外泌體載體的研究更加全面透徹，其需求量也會逐漸增加。俄亥俄州立大學的科研人員報道了一種細胞納米穿孔方法，用于生產大量含有治療性 mRNA 和靶向肽的外泌體。他們用質粒 DNA 轉染各種細胞，并施加局部和瞬時電刺激，促進其釋放攜帶 mRNA 和靶向肽的外泌體。與其他外泌體生產策略相比，細胞納米穿孔法可產生高達 50 倍以上數量的外泌體[39]。此外，來自于紅細胞的外泌體不含有細胞核和線粒體，不會傳遞基因，但仍能夠參與大部分病理過程，而來自于植物的外泌體不會引起細胞毒性，能夠調節腸道微生物群，刺激腸道組織更新。因此，紅細胞外泌體和植物外泌體特別適合作為低成本的商品化外泌體來滿足市場需求[40-41]。

6 結論與展望

雖然 mRNA 藥物或疫苗在預防和治療腫瘤、自身免疫疾病和呼吸系統疾病方面取得了重大進展，但研究仍然處于早期階段，多重困難阻礙了 mRNA 療法的發展。例如，LNPs 易氧化、降解，難以實現大規模工業化生產，LNP 遞送系統中的脂質成分會導致小鼠產生炎癥和過敏反應[16]。病毒樣顆粒、仿生納米顆粒、聚合物納米顆粒和無機納米顆粒也由于各種原因，沒有被 FDA 批準用于臨床。理想的遞送系統應該具有高轉染效率、足夠的安全性、保護 mRNA，避免快速降解和靶向遞送，這些功能還遠遠沒有實現。

mRNA 療法被列為 2022 年全球十大最具影響力的科學突破。引起了眾多科學家和投資者的高度關注，這表明mRNA 藥物具有十分廣闊的應用前景。特別是各種新興的仿生納米載體體系開發有望成為 mRNA 遞送的重要手段，將對 mRNA 治療產生更深遠的影響。外泌體作為天然細胞分泌的納米顆粒，具有生物相容性好、免疫原性低、不易被吞噬、介導免疫逃逸、存留時間長、能穿透深層組織，裝載各類基因治療物質等眾多優點。相信未來，基于外泌體的mRNA 納米工程技術將實現對疾病的精準治療，對藥物開發模式產生顛覆性影響。