貓犬主要過敏原蛋白的最新研究進展

李春曉,安 尉,高博泉,王振龍,韓 冰,陶 慧,王金全,王秀敏

(中國農業科學院飼料研究所,農業農村部飼料生物技術重點實驗室,北京 100081)

過敏是日常生活中很常見的問題之一,嚴格來說,過敏是機體產生的一種過激的免疫反應,機體將外來的一些物質視為異物從而引發機體免疫反應過度,繼而導致人或動物體發生一系列過敏反應。寵物過敏原誘發的癥狀嚴重程度差異很大,從與鼻炎和結膜炎相關的不適到嚴重的哮喘;哮喘可能發展成危及生命的疾病,貓犬過敏原被認為是哮喘和過敏性鼻炎發展的主要危險因素[1]。對貓過敏患者而言,在自然條件下接觸一定的貓過敏原會導致嚴重的外周氣道阻塞,它可以發展成危及生命的狀況[2]。根據一項針對吸入性過敏原的大規模皮膚點刺試驗(SPT)研究(全球哮喘和過敏歐洲網絡)顯示,因疑似吸入性過敏原而就診的歐洲成年人中約26%對貓過敏,27%對犬過敏[3-4]。我國對兒童支氣管哮喘、變應性鼻炎、濕疹、過敏性咳嗽、急慢性蕁麻疹、過敏性紫癜等常見過敏性疾病的過敏原進行分析的流行病學調查顯示,學齡前兒童和學齡期兒童吸入性過敏原過敏者分別占66%和73.1%[5]。家養貓和家養犬中最主要的過敏原分別是Fel d 1和Can f 1[6]。貓犬過敏原提取物含有多種過敏原,目前已有八種貓的過敏原(Fel d 1～Fel d 8)以及八種犬的過敏原(Can f 1～Can f 8)在WHO/IUIS中注冊。

貓犬過敏原在世界范圍內作為常見的室內吸入性過敏原,參與免疫球蛋白E(IgE)介導的過敏反應,IgE介導的過敏反應屬于Ⅰ型免疫,與其他類型免疫反應相比時間進程更快,抗原識別后繼發反應的幅度更大,這些后果可能高度危及過敏患者的生命[6]。目前,還缺乏完全有效和安全的方法治療寵物過敏。

1 貓犬主要過敏原蛋白的結構與功能分析

1.1 貓源過敏原蛋白

在貓的皮屑、毛發、唾液、舌下腺等提取物中發現有多種過敏原,包括貓過敏原蛋白Fel d 1～Fel d 8。過敏原Fel d 1是分泌珠蛋白家族的成員,是最主要的貓過敏原[7],主要在舌下和皮脂腺中產生,肛腺和淚腺也會產生[8]。Fel d 1主要儲存在唾液和毛發中,當貓咪梳理自己毛發時,Fel d 1也會轉移到貓毛上。另外,含有Fel d 1過敏原的貓皮屑作為小的空氣傳播顆粒傳播到環境中[9]。Fel d 1是由兩個異源二聚體形成的四聚糖蛋白(圖1),二聚體之間以非共價鍵的方式鏈接,每個異源二聚體由一個70殘基肽和一個85、90或92殘基肽組成。這些鏈在每個異源二聚體中通過二硫鍵共價連接[10]。Fel d 1的結構與兔子宮珠蛋白的結構具有相似性,其鏈Ⅰ與子宮珠蛋白共享氨基酸同源性,而鏈Ⅱ是具有N-端連接寡糖的糖蛋白[11]。在Fel d 1內部有一個不對稱空腔,可以結合內源性配體[7];在體內,Fel d 1的過敏原性由黏膜抗原呈遞細胞(如樹突狀細胞)上的甘露糖受體識別決定[12]。

圖1 貓主要過敏原Fel d 1蛋白結構[10]Fig.1 Structure of major cat allergen Fel d 1[10]

Fel d 2是一種血清白蛋白,是皮屑中的重要蛋白質,它是一種引起輕微過敏癥狀的貓過敏原,可在單重和多重免疫分析中作為天然純化和重組分子獲得。Fel d 3是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑,也是一種次要過敏原,屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑(CPI)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族,是一種小的酸性蛋白,沒有半胱氨酸殘基或二硫鍵。Fel d 4和Fel d 7為脂質激素,Fel d 8是一種獨特的泡沫蛋白樣蛋白,屬于脂多糖結合蛋白/殺菌通透性增加家族[13]。

在以上過敏原蛋白中,最重要的過敏原蛋白為Fel d 1,能使93.9%的貓科動物敏感患者敏感[14],過敏患者血清中針對貓過敏原的IgE抗體多數指向Fel d 1,占總過敏原活性的60%～90%[12]。

貓過敏原及其特性詳見表1[15-16]。

表1 貓過敏原及其特性[15-16]

1.2 犬源過敏原蛋白

犬過敏原Can f 1是一種在犬的唾液腺中產生的脂質運載蛋白,與人類淚液脂質運載蛋白同源[17-19],在多達50%～75%對犬皮屑敏感的受試者中結合IgE抗體[6],是犬主要的過敏原之一。目前,Can f 1仍然是流行病學研究中的主要過敏原[20],其蛋白結構見圖2[21]。

該蛋白結構由Min等[21]解析上傳至在線存儲庫http:∥www.wwpdb.org/,8epu 代表 Can f 1,該圖像由網站 (https:∥swissmodel.expasy.org/templates/8epu.1) 生成The protein structure was analyzed by Min et al[21]and uploaded to the online repository http:∥www.wwpdb.org/, and 8epu stands for Can f 1. The image was generated by the website (https:∥swissmodel.expasy.org/templates/8epu.1)

Can f 2、Can f 4、Can f 6組分與Can f 1同屬于載脂蛋白家族[5]。Can f 3來源于犬血清白蛋白,與貓的過敏原Fel d 2屬于同一類蛋白家族,而同一蛋白家族的成員間可能發生發叉反應[22]。Can f 4是舌上皮組織表達的一種158個氨基酸的脂質運載蛋白,該過敏原主要存在于唾液和皮屑中[23]。

Can f 5是一種前列腺激肽釋放酶(28 ku蛋白),在2009年也被確定為主要的犬過敏原,在70%的過敏患者中結合IgE,作為一種前列腺蛋白,它僅存在于公犬尿液中,并且與人類前列腺特異性抗原表現出交叉反應性,為犬過敏原暴露引起的精液超敏反應提供了潛在的解釋[24]。Can f 7又稱 NPC2蛋白,也稱為CE1蛋白,是MD-16相關脂質識別(ML)家族中的2 ku過敏原[25-26]。此外,也在犬的皮屑中觀察到了Can f 8,并將其歸為胱抑素家族的一員[27]。

犬過敏原及其特性見表2[4,28-29]。

表2 犬過敏原及其特性[4,28-29]

2 貓犬過敏原蛋白的重組表達

2.1 重組表達系統

重組蛋白藥物生產的表達系統主要包括真核表達系統(如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞等)和原核表達系統(如大腸桿菌、乳酸乳球菌等)[30]。目前批準上市的重組蛋白藥物大多是在這兩個表達系統中生產[31]。用于表達重組蛋白的哺乳動物細胞主要包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0和NS0、人胚胎腎細胞HEK293、倉鼠腎細胞BHK-21等,它們具有類似于人源細胞的翻譯后修飾、外源基因的穩定整合、可以大規模懸浮培養等優點,其中大約有70%的重組蛋白藥物是由CHO細胞生產的[32]。在原核表達系統中,大腸桿菌遺傳背景清楚,相對于CHO細胞,其表達量較高,能在培養基上快速繁殖、成本低, 是最常用的原核表達系統[33],但由于缺乏翻譯后修飾(如糖基化),主要用于表達分子量較小、不需要翻譯后修飾的重組藥物[34]。

2.2 重組過敏原蛋白

在目前的研究報道中,貓過敏原Fel d 1重組蛋白一般采用原核表達系統進行表達。裴業春[35]將Fel d 1鏈Ⅰ、Ⅱ拼接后插入到乙肝病毒核心抗原(HBcAg)中,構建了pET28a-HBcAg-rFel d 1表達載體,將其轉化入大腸桿菌BL21(DE3)中;通過誘導表達后獲得了HBcAg-rFel d 1融合蛋白,大小約為37 ku。Schmitz等[36]將噬菌體Qβ的外殼蛋白的病毒樣顆粒(Qβ-VLP)作為Fel d 1表達載體,并在大腸桿菌中進行了高效表達,獲得了Qβ-Fel d 1融合蛋白。Curin等[37]設計了一系列Fel d 1的衍生肽(包括Fel d 1 M1、M、MA、MB、MC、ME和MF),該系列肽均無典型的α-螺旋結構,不具有IgE反應性;這些低過敏性衍生肽均含有誘導過敏原特異性阻斷IgG抗體和T細胞表位的序列元件,插入表達載體pET-28b后,在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達,獲得了重組的Fel d 1低過敏性衍生物,其表達量為2～6 mg·L-1、純度高達90%以上,可用于過敏疫苗接種和耐受誘導。周婕[38]在構建好的Fel d 1-IL-10(FIL)重組嵌合蛋白(含Fel d 1、IL-10)的基礎上,通過基因工程定點突變技術對重組貓過敏原Fel d 1序列中抗原值高的位點進行改造(23V→P,34V→P),插入載體,轉化至大腸桿菌中進行誘導表達,獲得貓過敏原突變體蛋白,但未驗證其抗原性。

許卓謙和劉志剛[39]利用pET-24(+)構建表達載體,獲得了帶有his標簽的Fel d 1 Ⅰ、Ⅱ鏈,但該重組Fel d 1蛋白發生了突變(如42 Met→Lys、55 Ile→Leu、74 Met→Thr)。此外,Gr?nlund等[40]發現大腸桿菌表達后的Fel d 1鏈Ⅰ、Ⅱ混合后與IgE抗體結合能力比天然Fel d 1下降了25倍,可能與鏈Ⅰ、Ⅱ之間的連接及Fel d 1的三對二硫鍵(Cys3～Cys73、Cys44～Cys48、Cys7～Cys70)的正確配對有關。由此可見,重組過敏原Fel d 1蛋白有時不能正確折疊,或表達量不高、位點突變及二硫鍵錯配等問題可能會影響其免疫原性。

3 降低貓犬過敏原蛋白的治療方法

3.1 過敏原特異性免疫療法

過敏原特異性免疫療法,又稱脫敏治療,是目前唯一一種治療過敏性疾病的有效療法,其通過長期注射過敏原誘導患者耐受該過敏原從而不再產生過敏反應,即使停藥也有長期的療效[41]。國際上從20世紀70年代開始已經開展對貓犬過敏原特異性免疫治療的研究。過敏原特異性免疫療法有多種給藥途徑,例如皮下、舌下或淋巴注射,并在小鼠和人類受試者中測試了該治療方法的安全性和有效性,已經觀察到一些非常有希望的結果[42]。多項研究表明,這種方法對過敏性患者具有安全性和多重益處,能夠緩解呼吸道的主要癥狀,可以減少炎性反應[43-44]。Alvarez-Cuesta[45]等使用標準化貓過敏原提取物對貓毛皮屑過敏患者進行治療,發現13.2 μg的Fel d 1抗原劑量具有一定的療效,且呈劑量依賴性,高劑量Fel d 1提取物(15 μg)達到有效的治療效果。據報道,患者獲益與誘導針對貓主要過敏原Fel d 1的IgG抗體以及減少皮膚和呼吸道癥狀有關。另一項研究顯示,與安慰劑組相比,接受貓科動物過敏原Fel d 1提取物皮下免疫療法的受試者中IgG4水平升高、對過敏原的皮膚反應性降低、支氣管反應性降低以及癥狀評分改善;臨床療效呈劑量依賴性,3.0和15.0 μg組在安慰劑組中均顯示出顯著變化,但彼此之間無顯著差異,可能需要高劑量的過敏原以實現更有效的治療[46]。然而,使用天然過敏原提取物或者未經改變的重組蛋白進行過敏原特異性免疫療法更易產生副作用。Mellerup等[47]研究表明,41%接受貓過敏原提取物特異性免疫治療的患者出現了嚴重的副作用。另外,用犬過敏原Can f 1提取物對狗毛皮屑過敏患者進行特異性免疫治療的效果不佳,有待進一步探討。

為了降低使用過敏原進行免疫治療對患者的危害,通常需要降低過敏原蛋白的過敏性。聚合是降低過敏原蛋白過敏性最常見的方法[48]。過敏原聚合會導致暴露的IgE結合位點數量減少,使其對過敏性患者外周血中嗜堿性粒細胞的活化能力低于正常過敏原,從而降低機體的過敏癥狀[49]。Calzada等[27]將Can f 1和Can f 5的聚合產物作為新型犬皮屑過敏物質進行研究,發現該聚合物具有低結合IgE和激活犬過敏患者嗜堿性粒細胞的能力,這種過敏性疫苗可以提供比天然提取物更安全的特性。

3.2 疫苗

另外,基于短肽的過敏原免疫療法是常規免疫療法的替代方法,由于短肽缺乏使肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面上的IgE交聯所需的三維結構,可以降低IgE介導的嚴重反應風險。因此,基于短肽的重組過敏原有望為過敏原免疫治療提供新的思路[50]。通過重組表達Fel d 1的T細胞抗原表位、開發一種Fel d 1低致敏原,使其能對免疫接種、誘導阻斷IgG抗體以及誘導耐受性都有用;這種過敏原特異性免疫療法一方面可以降低嚴重的副作用,另一方面能夠減少肥大細胞或嗜堿性粒細胞上IgE的結合,從而減少過敏反應。另外,這種短肽疫苗可以靶向過敏原特異性T細胞,比傳統疫苗更安全、保護率更高[51]。此外,Kaiser等[7]解析了重組Fel d 1蛋白的結構(圖3),發現其由兩個鏈組成,N端和6個C端His殘基不受電子密度的限制;折疊后由8個螺旋組成,H1-H4和H5-H8對應于天然Fel d 1的鏈Ⅰ和Ⅱ;對重組Fel d 1抗原表位進行預測,發現IgE結合的3個重要的抗原表位是25～38、46～59與15～28位(圖4),第一個抗原表位與人類血清的識別率達到46%。

A. Fel d 1鏈Ⅰ和Ⅱ; B. 電子密度云; C. Fel d 1單體A. Fel d 1 chains Ⅰ and Ⅱ; B. Electron density clouds; C. Fel d 1 monomer

3個IgE表位的相對定位顯示在Fel d1的分子表面上。a.方向與圖3C(左)相同;b.與a垂直的視圖;c.與b垂直的視圖The relative localization of three IgE epitopes is indicated on the molecular surface of Fel d 1. a.The same orientation as in Fig. 3C, left; b.The perpendicular view to a; c.The perpendicular view to b

通過對貓自身的主要過敏原Fel d 1進行免疫來治療人類由Fel d 1引起的過敏[52]。裴業春[53]按照貓過敏原Fel d 1鏈Ⅰ、鏈Ⅱ連接后進行表達,制備了重組Fel d 1蛋白疫苗,免疫虎皮貓后,發現其毛發、下顎下腺中的Fel d 1含量下降15%～60%。同時,使用表達Fel d 1的真核表達質粒proVAX-rFel d 1作為DNA疫苗,與蛋白疫苗按照1∶1比例混合后作為DNA/蛋白共免疫疫苗,并在BALB/c小鼠上進行了預防和治療試驗。結果顯示,注射DNA/蛋白共免疫疫苗的過敏小鼠血清中總IgE水平降低了600～800 ng·mL-1,抑制了肺部呼吸阻力的上升,降低了應激過敏反應的激烈程度[53]。

Nakatsuji等[54]基于序列比對和三級結構,預測了犬過敏原Can f 1蛋白中IgE表位的五個關鍵殘基(His86、Glu98、Arg111、Glu138和Arg152)(圖5);結果表明,殘基His86和Arg152為IgE構象表位的候選者。Immonen等[55]發現了七個Can f 1的T細胞表位區域,由這七個表位區域組成的肽可用于犬過敏的免疫治療,這些肽表現出廣泛的T細胞反應性,并且它們能夠有效地與白人群體中最常見的HLA-DRB1分子結合。Juntunen等[56]合成了過敏原Can f 1 T細胞表位的肽片段,發現這些合成肽比天然肽高10～30倍的致敏性,進一步說明重組犬過敏原短肽疫苗有望成為治療過敏的有效途徑。

圖5 預測的Can f 1的 IgE 表位殘基[54]Fig.5 Predicted IgE epitope residues of Can f 1[54]

3.3 抗體

有研究表明,過敏原特異性中和抗體可以阻斷IgE介導的過敏反應[53]。卵黃抗體(immunoglobulin of yolk, IgY)是鳥類、爬行以及兩棲動物體內產生的主要抗體,與哺乳動物的IgG相似,由蛋雞產生的IgY經轉移聚集在卵黃當中,提取后能夠作為預防和治療相應疾病的多克隆抗體。一只蛋雞每年可以產生20 g以上的IgY[57],Akbari等[58]制備的抗LPS IgY提取物的產量為40 mg·蛋黃-1;周繼萍等[59]IgY抗體制備研究表明,蛋雞在經四次免疫后IgY抗體效價達到1:51 200;段海龍等[60]制備的抗白唇竹葉青蛇毒IgY可在常溫下進行制備、保存,且具有較強的耐酸性,在pH值為2的環境下仍可保持74%的活性;經胰蛋白酶處理1 h時其活性下降不明顯;表明IgY具有制備簡單、產量大、特異性強、穩定性強等優點。近年來已經有許多IgY針對毒素、細菌、病毒、寄生蟲等方面的治療報道,例如蛇毒[60]、諾如病毒[61]、豬帶絳蟲[62]、大腸桿菌[63]、鴿毛滴蟲與白色念珠菌[64]等。

Satyaraj等[65]研究發現抗Fel d 1的兔多克隆抗體、過敏原特異性雞卵黃抗體IgY能夠與貓唾液中的Fel d 1結合,并有效地降低過敏患者血漿中Fel d 1的濃度,阻斷Fel d 1與IgE的結合以及IgE介導的嗜堿性粒細胞脫顆粒,從而降低過敏反應。另外,他們將Fel d 1特異性卵黃抗體IgY添加到貓糧中(添加量為8 mg·kg-1),飼喂3周后,發現卵黃抗體IgY顯著降低了貓毛發中Fel d 1的含量;飼喂10周后,毛發中Fel d 1的平均含量下降了47%[66]。由此可見,重組Fel d 1蛋白卵黃抗體能夠中和過敏原蛋白,降低貓過敏原蛋白的分泌量,特異性抗體為對貓犬過敏癥的防治提供了一種新的方法。

4 存在的問題及解決策略

近幾十年來,人們為貓犬過敏原進行免疫治療也作出了巨大努力。目前,對貓過敏患者的治療主要通過脫敏治療法實現,通過反復注射貓皮屑的粗提取物或源自Fel d 1的多肽,治療后的患者仍然存在過敏癥狀或者產生了副作用[67-68]。過敏原阻斷抗體為中和貓犬過敏原提供了一種新的思路,包括貓犬過敏原的重組、過敏原阻斷抗體的制備及其在靶動物體內阻斷的實際應用效果等研究。但是,重組過敏原全長蛋白的策略往往不能正確折疊,其表達量不高、位點突變及二硫鍵錯配等問題可能會影響其免疫原性,有待進一步從抗原表位序列上進行優化。今后,基于抗原多表位融合的策略研發高效特異性生物制劑(如特異性IgY抗體),不僅可以中和貓犬體內的過敏原蛋白,從源頭上降低其含量,而且比疫苗更容易被機體吸收,有望解決寵物毛發過敏癥的源頭問題。