桿狀病毒表達系統表達BCoV纖突蛋白及其對小鼠的免疫原性

喻琦勝,朱 慶,周 群,宋 鑫,張家祺,陳濤云,徐 林,張朝輝*,張 斌*

(1.西南民族大學畜牧獸醫學院,成都 610041;2.四川省甘孜藏族自治州動物疫病預防控制中心,康定 626000)

牛冠狀病毒病是由牛冠狀病毒(bovine coronavirus,BCoV)引起的導致牛呼吸道和腸道感染的病毒性疾病[1],被廣泛認為是引起初生犢牛腹瀉的重要病原之一。目前國內BCoV廣泛流行,嚴重阻礙了養牛業的發展[2-4]。有研究證實BCoV能感染多種宿主[5-6],說明BCoV在跨物種傳播領域具有重要意義,其生物安全影響不容忽視。

BCoV是單股正鏈RNA病毒,屬于套式病毒目、冠狀病毒科、β冠狀病毒屬[7]。其病毒粒子呈球形或多邊形,編碼五種主要結構蛋白,即纖突蛋白(S蛋白)、核衣殼蛋白(N蛋白)、囊膜糖蛋白(M蛋白)、血凝脂酶糖蛋白(HE蛋白)和小膜蛋白(E蛋白)[8]。其中S結構蛋白含有主要抗原位點,包含S1、S2兩個亞基,能誘導機體產生免疫應答,進而誘導中和抗體的產生[9-10]。目前已有多種冠狀病毒的疫苗是基于S蛋白進行開發的[11-13]。

桿狀病毒表達系統(baculovirus expression system,BES)是以桿狀病毒為外源基因表達載體,以昆蟲細胞為受體的真核表達系統。其優點是桿狀病毒對外源基因的容納能力較強,只感染節肢動物[14],在實際生產應用中較為安全;昆蟲細胞能夠對外源蛋白進行加工修飾,使外源蛋白能夠正確折疊,保持空間構象及蛋白活性[15-16]。BES已被廣泛用于表達重組蛋白[15],已有多種商業化的基因工程亞單位疫苗使用該系統生產重組蛋白,如由GSK公司研發的人乳頭瘤病毒二價疫苗,四川大學華西醫院研發的重組新冠病毒疫苗,武漢科前生物股份有限公司生產的豬瘟病毒E2蛋白重組桿狀病毒滅活疫苗(WH-09株)[17-18]。

目前,有關BCoV S蛋白表達的報道均屬于原核表達,缺乏翻譯后修飾、蛋白產量較低,而且未表達完整S蛋白[19-20]。因此,本研究構建了攜帶BCoV S基因的重組桿狀病毒,通過桿狀病毒表達系統獲得重組S蛋白,免疫BALB/c小鼠,對其免疫原性進行評價,為今后BCoV亞單位疫苗的研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細胞 大腸桿菌感受態細胞(DH5α、DH10Bac)、Sf9細胞、pFastBac-Dual質粒由西南民族大學畜牧獸醫學院預防獸醫學實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 質粒小提試劑盒購自OMEGA生物公司,BacPAKTM桿狀病毒滴度快速測定試劑盒購自TaKaRa生物公司,超敏ECL化學發光底物購自四正柏生物公司,辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG、HRP標記的山羊抗鼠IgG均購自北京博奧森生物有限公司,異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗兔IgG、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自博士德生物工程有限公司,RIPA裂解液購自Thermo Fisher Scientific公司,蛋白酶抑制劑混合物(通用型)購自上海碧云天生物技術有限公司,NE41動物免疫佐劑(MF59佐劑)、CpG免疫增強劑均購自北京利昂盛生物技術有限公司。

1.1.3 實驗動物 4～6周齡雌性BALB/c小鼠,購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建與鑒定 選擇BCoV/SWUN/HXD-4/2021株(GenBank:OL456213.1)的S結構蛋白作為模板,由生工生物工程(上海)股份有限公司針對Sf9細胞進行密碼子優化并合成,連接至pFastBac-Dual載體上,得到pFastBac-Dual-S重組質粒。

1.2.2 收獲重組桿粒 將上述構建成功的pFastBac-Dual-S重組質粒DNA轉化至DH10Bac感受態細胞中,涂布到含有慶大霉素、卡那霉素、氯霉素的LB瓊脂平板上。在37 ℃二氧化碳培養箱中靜置培養48 h后,可觀察到藍色和白色的圓形菌落,挑取白色圓形單個菌落利用菌落PCR篩選出陽性克隆,并通過三線法進一步劃線純化以去除假陽性。將篩選出的陽性克隆擴大培養,提取重組桿粒命名為Bacmid-S,測定濃度后保存于-20 ℃。

1.2.3 重組桿狀病毒的拯救 將長滿細胞培養瓶的Sf9細胞傳代到六孔板中,根據CellfectinTMII Reagent轉染試劑說明書進行轉染,27 ℃靜置培養96 h后,反復凍融3次,收獲病毒液,將其作為第一代病毒(P1),命名為rpFastBac-S。盲傳代到P4后,收集病毒液,分裝保存于-80 ℃。

1.2.4 重組桿狀病毒的鑒定

1.2.4.1 基因組PCR:取P4病毒液提取基因組DNA。將rpFastBac-S的DNA作為模板,進行基因組PCR鑒定。

1.2.4.2 間接免疫熒光試驗:將長滿細胞培養瓶的Sf9細胞進行傳代,用Sf9專用培養基將細胞濃度調整到4×105cells·mL-1,進行六孔板鋪板,每孔2 mL,8～10 h后按細胞培養液3%的比例接入rpFastBac-S。27 ℃靜置培養48 h后棄去培養液,用80%丙酮固定10 min,PBS洗滌3次;5%脫脂奶封閉2 h,PBS洗滌3次;以Anti-BCoV-S2蛋白多克隆抗體為一抗,37 ℃孵育2 h,PBS洗滌3次;以FITC標記的Goat Anti-rabbit IgG作為二抗,37 ℃孵育1 h,PBS洗滌3次;滴入DAPI染色液,室溫孵育10 min,使用吸水紙吸取凈殘留液體后,進行熒光顯微鏡成像。

1.2.4.3 Western blot分析:通過Western blot分析S蛋白在Sf9細胞中的表達情況。樣品制備方法同“1.2.4.2”,27 ℃靜置培養48 h后棄去培養液,用PBS重懸細胞,12 000 r·min-1離心5 min,棄去上清;加入200 μL RIPA裂解液裂解細胞,同時加入2 μL通用型蛋白酶抑制劑,冰浴15 min后再次離心,取上清,加入SDS-PAGE上樣緩沖液,95 ℃加熱5 min,完成樣本制備。以5%脫脂奶為封閉液,37 ℃水平搖晃孵育2 h,TBST洗滌3次;以Anti-BCoV-S2蛋白多克隆抗體為一抗,4 ℃水平搖晃孵育過夜,TBST洗滌3次;以HRP標記的Goat Anti-rabbit IgG作為二抗,37 ℃水平搖晃孵育2 h,TBST洗滌3次;使用超敏ECL化學發光底物顯影,觀察目的條帶。

1.2.5 重組桿狀病毒滴度的測定 按照BacPAKTM桿狀病毒滴度快速測定試劑盒說明書,測定P4重組桿狀病毒rpFastBac-S的滴度。

1.2.6 優化不同感染劑量對蛋白表達的影響 將rpFastBac-S分別以MOI=0.005、MOI=0.05、MOI=0.5、MOI=1、MOI=2感染Sf9細胞,3 d后,棄去上清,收集細胞,Western blot檢測蛋白表達情況。

1.2.7 收獲S蛋白及制備免疫原 將rpFastBac-S按照最佳感染復數感染Sf9細胞,3 d后收獲細胞培養液,3 000 r·min-1離心20 min以去除細胞碎片,收集上清進行超速離心純化,離心條件為“4 ℃、30 000 r·min-1、2 h”,離心后用PBS重懸沉淀。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,分裝儲存于-80 ℃備用。

1.2.8 rpFastBac-BCoV-S蛋白在小鼠中的免疫原性評價

1.2.8.1 rpFastBac-BCoV-S免疫小鼠的方案設計:4～6周齡雌性BALB/c小鼠24只,隨機分為3組,分別為S蛋白組、滅活病毒組、佐劑對照組,每組8只。均采用肌肉注射,S蛋白組每只每次免疫50 μg蛋白,滅活病毒組每只每次免疫200 μL滅活病毒液(劑量為2×104.67TCID50),佐劑對照組每只每次免疫50 μL MF59佐劑,其中S蛋白組與滅活病毒組均混合了等體積的MF59佐劑與20 μg CpG免疫增強劑。首免后14 d進行二免,并在免疫前、首免7 d、首免14 d、二免7 d、二免14 d進行采血,收集血清備用。

1.2.8.2 間接ELISA試驗檢測小鼠血清特異性抗體水平:根據本實驗室建立的基于BCoV S2重組蛋白的間接ELISA抗體檢測方法,對收集到的血清樣本進行特異性抗體水平檢測。將原核表達獲得的BCoV S2蛋白用50 mmol·L-1Tris-HCl溶液稀釋為0.1 μg·mL-1,每孔100 μL,37 ℃包被1 h后棄液,PBST洗滌三次;每孔加入100 μL 5%脫脂奶,37 ℃封閉1 h后棄液,PBST洗滌三次;以收集到的小鼠血清作為一抗,用2%冷水魚皮明膠進行梯度稀釋后,每孔100 μL,37 ℃孵育1 h后棄液,PBST洗滌三次;將HRP標記的羊抗鼠IgG用2%冷水魚皮明膠按照1∶10 000稀釋,每孔100 μL,37 ℃孵育1 h后棄液,PBST洗滌三次;加入TMB顯色液,每孔100 μL,37 ℃避光孵育10 min后,加入終止液終止反應,使用酶標儀讀取OD450 nm值。

1.2.8.3 微量中和試驗檢測小鼠血清中和抗體水平:將長滿細胞培養瓶的HCT-8細胞傳代至96孔板,37 ℃靜置培養8～10 h;將小鼠血清56 ℃滅活30 min,用不含血清與雙抗的DMEM培養基進行2倍倍比稀釋,與200 TCID50的BCoV混合,37 ℃培養箱感作1 h;取出含有HCT-8細胞的96孔板,棄液,PBS洗滌2次,將感作完成后的混合培養液加入到96孔板中培養96 h后,觀察記錄每孔的病變情況,按Reed-muech兩氏法計算血清中和抗體的效價。

2 結 果

2.1 重組質粒的構建

以S基因為模板,針對昆蟲細胞進行密碼子優化,CAI(密碼子適應指數)從0.39調整為0.87,平均GC含量從35.8%調整為50.6%,利用基因合成技術獲得重組質粒pFastBac-Dual-S。

2.2 重組桿粒獲取及重組桿狀病毒的拯救與鑒定

將上述構建成功的重組質粒轉化DH10Bac同源重組后獲得重組桿粒,并在轉染Sf9細胞后收獲重組桿狀病毒rpFastBac-S,將拯救的重組桿狀病毒rpFastBac-S傳代至第四代時,Sf9細胞開始出現典型病變,表現為細胞生長緩慢、變大變圓。為了驗證重組桿狀病毒rpFastBac-S是否構建成功,作者通過PCR、Western blot、IFA試驗對其進行鑒定(圖1A～C)。鑒定結果如圖1所示,圖1A為提取第四代重組桿狀病毒DNA后,利用S基因特異引物進行PCR鑒定和瓊脂糖凝膠電泳,電泳結果顯示在4 000 bp附近出現預期條帶,說明收獲的重組桿狀病毒正確表達了S目的蛋白基因;IFA試驗的一抗為Anti-BCoV-S2蛋白多克隆抗體,利用倒置熒光顯微鏡能觀察到試驗組產生了很亮的綠色熒光(圖1C),說明構建的桿狀病毒有效表達了S目的蛋白;收集重組桿狀病毒rpFastBac-S感染Sf9細胞48 h后的培養液上清部分,使用Anti-BCoV-S2蛋白多克隆抗體進行Western blot分析,結果顯示其能夠與Anti-BCoV-S2蛋白多克隆抗體發生特異性結合(圖1B),說明重組桿狀病毒感染Sf9細胞后可以有效表達S目的蛋白,并且該蛋白具有較好的反應原性。

A. S基因PCR產物電泳結果(1. DL5000相對分子質量標準;2. 重組桿狀病毒DNA);B. Western blot結果 (1. 蛋白質相對分子質量標準;2～4. 桿狀病毒感染后的細胞上清;5. 正常Sf9細胞對照);C. 間接免疫熒光結果A. The PCR results of S gene (1. DL5000 marker; 2.Recombinant baculovirus DNA); B. Western blot results (1. Protein marker; 2-4. Baculovirus infected cell supernatant; 5. Normal Sf9 cell control); C. Indirect immunofluorescence assay results

2.3 桿狀病毒滴度測定

鑒定完成后,使用試劑盒測得第四代重組桿狀病毒rpFastBac-S的滴度為1.013×107IFU·mL-1,表明第四代重組桿狀病毒數量和密度良好,達到要求,能用于Sf9細胞的接種,可以進行大量蛋白的表達。

2.4 優化不同感染劑量對蛋白表達的影響

將rpFastBac-S分別以MOI=0.005、MOI=0.05、MOI=0.5、MOI=1、MOI=2感染Sf9細胞,3 d后,Western blot檢測蛋白表達情況。圖2顯示MOI為0.5時S蛋白表達量最高,所以將其作為后續大量表達蛋白時的最佳感染條件。

A. Western blot結果(1. 蛋白質相對分子質量標準;2～6. 接毒量0.005、0.05、0.5、1、2 MOI);B. Western blot灰度值分析A. Western blot results (1. Protein marker;2-6. Dose 0.005,0.05,0.5,1,2 MOI); B. Western blot analysis of gray value

2.5 rpFastBac-BCoV-S蛋白在小鼠中的免疫原性評價

2.5.1 小鼠血清特異性抗體IgG檢測結果 根據本實驗室建立的基于BCoV S2重組蛋白的間接ELISA抗體檢測方法,對收集到的血清進行特異性抗體檢測。由圖3可以看出,S蛋白組小鼠在首免一周后抗體水平開始升高,并在二免后抗體水平持續增長,二免7、14 d的特異性抗體效價顯著高于滅活病毒組和佐劑對照組,二免14 d特異性抗體效價最高達到1∶12 800。

**. P<0.01;***. P<0.001

2.5.2 小鼠血清中和抗體檢測結果 對收集到的各組一免7 d、一免14 d、二免7 d、二免14 d血清進行BCoV中和抗體檢測。分析結果如圖4所示,S蛋白組小鼠在首免1周后就產生了抗BCoV的中和抗體,效價為1∶20～1∶40,與MF59佐劑對照組相比,統計學差異顯著(P<0.05),并且隨著時間增長,中和抗體效價在持續升高,二免14 d后中和抗體效價最高達到1∶224。一免14 d后,S蛋白組中和效價平均值高于滅活病毒組,但中和抗體效價相當,統計學差異不顯著(P>0.05)。

同一時間點,柱上有相同字母表示差異不顯著(P>0.05),具不同標記字母表示差異顯著(P<0.05)At the same time point, the same letter above each column indicates no significant difference between the treatments (P>0.05), while the different marked letters indicates significant difference (P<0.05)

3 討 論

牛冠狀病毒最早在1972年由Mebus等從牛腹瀉糞便中分離得到[21]。BCoV首先在美洲流行,隨后在亞洲和歐洲暴發,流行范圍廣,可引起呼吸道和腸道雙重臨床癥狀[22]。感染BCoV后通常會導致初生犢牛腹瀉、冬季痢疾和呼吸道感染癥狀,進而造成犢牛死亡、肉牛生長緩慢、奶牛產奶量和產奶品質降低等影響,對養殖業造成巨大的經濟損失。牛冠狀病毒的S蛋白是病毒感染宿主細胞的主要成分,全長1 363個氨基酸[23],基因組較大,其序列高度突變和高重組的特性可能會導致BCoV的抗原性與致病性改變[24-25]。有研究表明,分子伴侶pG-KJE8可促進BCoV病毒樣顆粒的可溶性表達,與分子伴侶共表達的VLPs具有免疫活性,免疫小鼠后能使其產生較高IgG抗體水平和細胞因子水平[26]。S蛋白的單克隆抗體在體內可防止BCoV引發的犢牛腸毛萎縮,證實了S蛋白在誘導中和抗體產生的同時,也起到阻斷病毒附著和感染的作用,因此該蛋白在疫苗研究方面具有重要參考價值。

目前國內暫無商品化BCoV疫苗。S蛋白是冠狀病毒的主要抗原蛋白,可以作為新型疫苗研究的切入點。新型冠狀病毒通過S蛋白的RBD結合宿主細胞表面受體——血管緊張素轉換酶2,介導病毒進入宿主細胞[13]。2021年9月,中國三葉草生物制藥公司一項研究表明,基于SARS-CoV-2 S蛋白的改良疫苗針對該病毒的五種變體提供了較強的保護作用,并且對具有高度傳染性的Delta毒株也具有較強的保護作用[27]。2022年,四川大學華西醫院研發出RBD-HR/三聚體亞單位疫苗,該研究將Delta變異株的RBD序列與SARS-CoV-2 S2亞基中的HR1和HR2序列直接串聯起來,使其通過自組裝形成三聚體[28],在多種動物模型中能夠誘導持續的體液免疫,產生高水平的針對Omicron變異株的廣譜中和抗體,也可在體內誘導強烈的T細胞免疫應答。

本研究發現,利用桿狀病毒表達系統表達出的BCoV S重組蛋白經過昆蟲細胞較為完整的包括糖基化在內的翻譯后修飾,能夠正確折疊以維持原有的空間構象和蛋白活性,在此基礎上還優化了不同MOI感染后的S重組蛋白的表達量,結果表明MOI=0.5的接毒條件更適合蛋白表達。豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)與BCoV同屬于冠狀病毒科,在一項應用桿狀病毒表達系統表達PEDV纖突蛋白的研究中,S蛋白免疫小鼠后,可刺激小鼠產生IL-4,但血清抗體水平與PBS組相比,并無明顯差異[29]。而本研究在BCoV S重組蛋白制備免疫原時使用了MF59佐劑與CpG免疫增強劑,小鼠免疫試驗結果顯示,該免疫原能夠刺激小鼠產生特異性IgG抗體,血清抗體效價最高達到1∶12 800,抗體效價顯著高于滅活病毒組和佐劑對照組,同時也能誘導小鼠產生高水平的中和抗體,最高中和抗體效價達到1∶224,且S蛋白組的中和效價平均值高于滅活病毒組。MF59佐劑安全有效并且可以完全降解,在新型冠狀病毒疫苗研究中也有使用[28,30],而CpG免疫增強劑能提高免疫原穩定性并延長其在體內的半衰期,可不同程度地誘導體液免疫與細胞免疫,增強機體的免疫應答[31]。本研究為后續BCoV重組亞單位疫苗的研制提供了進一步的參考。

4 結 論

本研究利用桿狀病毒表達系統表達了BCoV全長S蛋白,免疫小鼠后,產生高水平的特異性IgG抗體與中和抗體,說明本研究中表達的BCoV S重組蛋白具有良好的免疫原性,為今后BCoV亞單位疫苗的研發提供了進一步的理論依據。