荷斯坦牛肺干細胞分離培養與生物學特性研究

劉晏辰,周世瑩,張 洋,高 揚,關偉軍*

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,北京 100193;2.首都體育學院,北京 100191)

肺癌是一種高度惡性的腫瘤,給人類健康帶來了嚴重的威脅?；?、放療、手術等手段在治療肺癌方面取得了一定的進展,但其5年生存率仍然很低。因此近年來,人們在分子、基因層面上對肺癌發生發展的機理進行了深入研究,提供了新的治療思路。研究發現,胚胎肺組織中存在多種前體細胞,而成年肺組織中是否有具有多向分化潛能的間充質干細胞尚不清楚[1]。為了深入了解肺癌的病理機制以及開發新的肺癌治療手段,一些研究組開始對肺間充質干細胞(LR-MSCs)進行研究。

LR-MSCs是一種干細胞,具有分化多種組織的潛能,其是干細胞研究與臨床工作者共同探索的重要方向。在研究過程中,研究者采用阻斷組織壁等方法獲得LR-MSCs,并將其與原代培養的LR-MSCs進行共培養。研究發現,這些細胞具有向成脂、成骨、軟骨等組織分化的能力,并且已經證明LR-MSCs具有多向分化的潛能,這被認為具有很大的實用價值。

目前,原代培養是LR-MSCs體外培養的最為常用的方法。這種方法不僅能夠重現LR-MSCs體外形成、增殖、分化的全過程,而且能夠直觀觀察不同因子對LR-MSCs體外培養的影響,還能保持基因背景不變,使得研究結果更加可靠、可信[2-6]。因此,LR-MSCs的形態學、增殖及分化潛能的研究對于肺癌的治療具有重要意義。肺間質干細胞可以作為潛在的標志物用于幫助早期診斷。研究人員發現,肺間質干細胞特有的標記物和生物學特征,如CD44、CD166等,與肺癌的存在和發展相關聯。通過檢測這些標記物的表達,可以提高肺癌診斷的準確性和敏感性。在肺癌的治療方面,肺間質干細胞也可能對治療結果產生影響。研究表明,肺間質干細胞可以通過多種機制參與肺癌的增殖、轉移和耐藥性等過程。同時,肺間質干細胞與腫瘤微環境之間存在相互作用,可以調節免疫應答和血管生成等過程,從而影響肺癌的發展和治療效果[7-9]。

此外,肺間質干細胞還具有一定的應用潛力。通過將抗腫瘤藥物或基因載體轉導到肺間質干細胞中,可以提高藥物的靶向性和療效,從而改善肺癌的治療效果。此外,肺間質干細胞還可能被用作肺癌疫苗的載體,以提高免疫治療的效果。

肺間質干細胞在肺癌中的具體作用機制和其在臨床應用中的潛力還需要進一步的研究和驗證[10]。此外,由于肺間質干細胞的來源和獲取方面的限制,其在臨床應用中還面臨著一些挑戰。因此,進一步深入研究肺間質干細胞與肺癌的關系,將有助于揭示其作用機制,開發更有效的診斷和治療策略[11-13]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 試驗所用健康雄性荷斯坦牛胚胎由中國農業科學院北京畜牧獸醫所昌平實驗基地提供。

1.1.2 主要材料 胰蛋白酶(Tripsin)、胎牛血清(FBS)DMEM/F12 基礎培養基、L-DMEM 基礎培養基、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自 Gibco 公司;膠原酶V購自 Sigma公司;封閉用山羊血清、FITC 標記山羊抗兔二抗購自北京博奧森生物技術有限公司;CD29、CD44、CD73、CD90、CD34、CD45 一抗購自美國 Abcam 公司;RNA 逆轉錄試劑盒購自TaKaRa 公司;胰島素生長因子-1 (IGF-1)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、胰島素轉鐵蛋白(ITS)均購自英國 Perotech 公司;吉姆薩染液、油紅O染液、阿利新藍染液、糖原染液、茜素紅染液均購自索萊寶公司。激光共聚焦顯微鏡(Nikon 公司),TH4-200 倒置顯微鏡(Olympus 公司),CO培養箱(Heraeus 公司),離心機(Ependorf 公司)。

1.2 方法

1.2.1 LR-MSCs的分離培養 試驗所用荷斯坦牛胚胎在無菌情況下取肺部組織,經 PBS沖洗3次后,去腸系膜,將肺部組織切開(1 mm×1 mm×1 mm),用0.1%膠原蛋白4在37 ℃下進行10～20 min的消化。在 DMEM/F12混合液中加入10%的FBS,經中和后進行消化。用100目的篩子過濾得到的懸浮液,在1 200 r·min-1下離心6 min。用 PBS法處理,將不粘著的細胞移除。

組織塊貼壁法:小塊肺部組織需要經過洗滌處理后才能被貼在細胞培養皿上。這是為了去除可能存在的細菌和污染物,以保證組織的健康生長。組織塊需要在完全培養基中進行培養,包括DEME/F12、FBS和bFGF。這些培養基成分可以提供所需的營養物質和生長因子,以促進組織生長。組織塊需要在特定的環境下進行培養,包括37 ℃和50 mL·L-1CO2的培養箱。組織塊的邊緣會出現大量的細胞,這時可以在融合率達到80%時使用胰蛋白酶進行傳代,繼續培養。

1.2.2 LR-MSCs生長曲線及群體倍增時間檢測 在24孔平板上,將3、9、15代的細胞以1×104個·孔-1的密度種植。從接種開始,每隔24 h,在3個小孔中有序地抽取3個小孔,連續8 d,采集細胞懸液。以此為依據,畫出生長曲線,并計算出群倍數(PDT)。PDT=lg2(t-t0)/(lgNt-lgN0),Nt為最后的培養細胞數量。

1.2.3 LR-MSCs克隆形成能力檢測 將第3、9、15代的LR-MSCs細胞以100個·孔-1接種在6孔板中培養,2周后可見單個LR-MSCs形成較大克隆團,40 g·L-1多聚甲醛固定30 min,PBS洗2次,吉姆薩工作液染色20 min。顯微鏡下拍照觀察克隆形態并計算克隆形成率,克隆形成率=克隆形成數/接種細胞數×100%,試驗重復3次以計算平均值。

1.2.4 染色體核型檢測 加入秋水仙素0．2 μg·mL-1,于37 ℃和50 mL·L-1CO2培養器中連續培養24 h,將其消化后采集,2 000 r·min-1離心10 min,除去上清,37 ℃進行低滲性預處理30 min,用1 mL的固定溶液輕輕吹動混合均勻后,將1 mL的定量分析溶液混合均勻后置于室內溫靜置30 min,再進行1次以上的定量分析。然后將其取出,于冷凍后的玻璃片上1.5 m高度,將其均勻地倒在玻璃片上,于室溫下進行烘干,用吉姆薩工作液對其進行20 min的染色。經過干燥處理后,在顯微鏡下進行詳細的觀察和照片。

1.2.5 LR-MSCs表面標志物檢測 將LR-MSCs種植于6孔平板上。當融合率為70%時,用 PBS沖洗,40 g·L-1的聚乙二醇固定30 min,0.25%的TritonX-100滲透10 min。在室溫下將羊血清封閉30 min后,加入CD29、CD44、CD73;在4 ℃下培養CD90抗體的稀釋劑。丟棄第一抗體,用 PBS沖洗2次,添加 FITC標記的第二抗體,培養1 h。PBS沖洗3次,DAPI培養20 min,PBS沖洗完畢,用激光共焦顯微鏡對 PBS沖洗完畢的樣品進行觀察和攝像。

1.2.6 多能性相關基因表達鑒定 采用 Trizol方法,通過 PCR試劑盒(TaKaRa)進行 RNA的合成。通過 Primer Premier5．0軟件對特異的引物進行設計(表1),對 RNA進行擴增。PCR反應體系為20 μL,包含10×RT緩沖液2．0 μL,蒸餾水13．4 μL,LEx-Taq 0．2 μL,正、反轉引物共2．0 μL,模板 cDNA1．0 μL,dNTP (2．5 mmol·L-1)1．4 μL。根據操作規程,對反應條件進行了設定。PCR擴增產物后,于140 V瓊脂電泳恒溫培養30 min,檢測多能性相關基因的表達。

表1 引物信息

1.2.7 誘導分化能力鑒定 成骨誘導劑包括:DMEM/F12、10%的 FBS、0.1 mmol·L-1的地塞米松、10 mmol·L-1的β-甘油、50 mg·L-1的 Vc。本試驗的誘發劑為 DMEM/F-12,FBS為10%,地塞米松為10～7 mol·L-1,肺部島素為8 μg·L-1,吲哚美辛為70 μmol·L-1,IBMX為0.5 mmol·L-1。L-DMEM,FBS 2.5%,ITS1%,脯氨酸50 μg·mL-1,地塞米松0.1 μmol·L-1,丙酮酸鈉0.5 mmol·L-1,維生素C 50 μg·mL-1,TGF-β310 ng·mL-1,IGF-1 10 mg·L-1,IGF-110。以茜素紅、油紅O、阿利新蘭、糖原等為主要研究對象,采用RT-PCR技術,對骨特異性基因collogen-I、骨橋蛋白(OPN)進行研究。前期研究發現,成脂特異性的PPAR-γ和 LPL在脂肪組織中均高表達。研究發現,成軟骨特異性蛋白 ACAN、SOX9在軟骨細胞中表達。

1.3 數據處理

采用 SPSS25．0軟件對資料進行了單因子變異數分析和鄧肯氏多元比較,結果以“均數±標準差”表示,P<0.05表明差異有顯著性,P<0.01表明差異有極顯著性。

2 結 果

2.1 LR-MSCs的分離培養

采用組織塊貼壁法可以得到LR-MSCs,這種方法所得到的細胞在傳到第3代的時候,其形態是長梭形的,并且呈螺旋狀生長(圖1)。

2.2 LR-MSCs體外增殖能力檢測

對LR-MSCs進行第3、9、15代培養后,分別對第3、9、15代培養的LR-MSCs作生長曲線。3個世代的生長周期分別為潛伏期、對數生長期、平緩期、下降期,形成一個典型的“S”形(圖2)。結果顯示:隨著傳代次數的增多,細胞倍增能力在不斷下降。

圖2 荷斯坦牛LR-MSCs生長曲線Fig.2 Growth curves of Holstein cattle LR-MSCs

2.3 LR-MSCs克隆形成能力檢測

LR-MSCs的第3、6、9代都可以以較低的濃度形成單克隆群(圖3)。荷斯坦牛LR-MSCs第3、6、9代的克隆率分別為(39.4±6.5)%、(34.9±2.6)%、(27.3±4.9)%,隨傳代次數增加,其克隆形成率呈下降趨勢。利用 SPSS軟件對其進行了計算,結果顯示,在第3、6、9代LR-MSCs的克隆形成率存在著明顯的差異(表2)。

A～C．荷斯坦牛LR-MSCs在第3、6、9代(P3．P6．P9)中克隆團簇形態A-C．Holstein cattle LR-MSCs exhibit cloned cluster morphology in the 3rd．6th．and 9th passages (P3．P6．P9)

A～W．組織塊貼壁法第0～22代細胞形態A～W．Cell morphology of generations 0 to 22 by the tissue block attachment method 圖1 荷斯坦牛 LR-MSCs 形態Fig.1 The morphology of Holstein cattle LR-MSCs

表2 LR-MSCs的克隆形成率

2.4 核型分析

第9代LR-MSCs的染色體數為2n=60,包含一對 XY性染色體。結果顯示,LR-MSCs在體外培養過程中,其染色體形態和數量均未發生異常變化(圖4)。

A． 染色體核型形態;B．染色體核型配對A.Karyotypic analysis;B.Chromosome karyotype pairing analysis

2.5 免疫熒光表型分析

在第7代LR-MSCs中檢測到CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166的表達;顯示全部為陽性(圖5)。

2.6 多能性相關基因表達鑒定

用Primer Premier5．0軟件設計CD29、CD44、CD73、CD90、CD106、CD166、CD34的擴增引物;以GAPDH作為內參考基因,用CD45標記基因擴增引物,檢測到 MSC的特異標志基因CD29、CD44、CD73、CD90、CD106、CD166均為陽性。CD34和CD45在MSC特異標志基因中的表達呈陰性(圖6)。

2.7 LR-MSCs多向分化能力鑒定

2.7.1 成脂誘導分化能力鑒定 在誘導成脂6 d后,用RT-PCR方法對其進行了檢測,結果顯示,在誘導成脂6 d后,油紅 O染色可見大量的桔紅色油珠。LR-MSCs成脂分化過程中,其高表達LPL及PPAR-γ(圖7)。

A．對照組,未用油紅-O染色。B．誘導組,用油紅-O染色。C.M.DNA相對分子質量標準;1.GAPDH;2.試驗組 LPL;3.試驗組 PPAP-γ;4．對照組LPL;5.對照組PPAP-γA．Control group without Oil Red O staining．B．Induction group with Oil Red O staining．C.M. DNA marker; 1.GAPDH; 2.Experimental group LPL; 3.Experimental group PPAP-γ; 4．Control group LPL; 5.Control group PPAP-γ

2.7.2 成軟骨誘導分化能力的鑒定 經阿利新蘭染色,15 d后,誘導組小鼠軟骨結節呈現出明顯的青色,其中以酸性粘多糖為主;RT-PCR結果顯示,ACAN與SOX9在LR-MSCs中均有表達(圖8)。

A．染色前。B．阿利新藍染色后。C.M.DNA相對分子質量標準;1.GAPDH;2.試驗組Collagen typeⅠ;3.試驗組 ACAN;4.試驗組 SOX9A．Before staining．B．After Alcian blue staining．C.M. DNA marker; 1.GAPDH; 2.Experimental group Collagen type Ⅰ; 3.Experimental group ACAN; 4.Experimental group SOX9

2.7.3 成骨誘導分化能力的鑒定 在15 d的成骨誘導之后,進行茜素紅染色,在誘導之后,能看見沉積的鈣鹽變為紅色。RT-PCR分析顯示,LR-MSCs在成骨分化后,其組織中有Ⅰ型膠原蛋白(Collagetype I)和骨橋蛋白(Osteopontin)基因表達(圖9)。

A．未染色前。B．茜素紅染色后。C.M.DNA相對分子質量標準;1.GAPDH;2.試驗組Osteopontin;3.試驗組 Collagen typeⅠ;4.對照組 Osteopontin;5.對照組 Collagen typeⅠA．Before staining．B．After Sirius red staining．C.M. DNA marker; 1.GAPDH; 2.Experimental group Osteopontin; 3.Experimental group Collagen type I; 4.Control group Osteopontin; 5.Control group Collagen type I

3 討 論

肺間充質干細胞(LR-MSCs)是一種重要的免疫調節細胞,可有效的修復組織損傷,并可有效的抑制炎癥反應。因此,尋找來自于同一組織或同一部位的干細胞有可能為臨床應用提供新的思路[14-18]。 LR-MSCs除用于肺部疾病外,LR-MSCs與 MSCs的體外分化及免疫調控功能在移植機體中同樣有很好的應用前景[19-21]。 通過貼壁法可從荷斯坦牛胚胎中獲得生長狀態良好的LR-MSCs,細胞形態為長梭形且傳代時間一致。隨著傳代次數的增加群體倍增時間逐漸增加,克隆形成率逐漸降低。說明隨著細胞傳代次數的增加細胞逐漸衰老。二倍體核型和穩定的染色體數目、形狀和結構是細胞生長和功能的先決條件。核型分析是區分正常細胞和變異細胞的一種簡單實用的方法。荷斯坦牛有30對染色體,包括性染色體X和Y。本研究培養的荷斯坦牛LR-MSCs均為正常二倍體(2 n=60,XY)。這些發現可能對理解染色體融合的分子機制、基因進化具有重要意義[22-26]。

荷斯坦牛LR-MSCs的鑒定主要依據是CD29、CD44、CD73、CD90等特異性標志物。CD44是細胞膜上的一種糖蛋白,在細胞間相互作用、遷移、粘附、活化、循環、歸巢等方面起著重要作用[27-29]。CD73是一種以糖類磷脂酰肌醇(GPI)為核心的蛋白,其與細胞膜的結合是CD73的重要功能。CD106和VCAM-1是由細胞因子誘導產生的一種膜蛋白,可介導細胞間的粘附[30-33]。目前,MSCs的鑒定主要依據是細胞形態、生長特性和多種免疫表型,而 MSCs的多向分化能力則是 MSCs鑒定的重要依據。細胞在體外能分化為骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等[34-36]。本課題組前期研究發現,魯西黃牛LR-MSCs具有向成骨、成脂兩種分化能力。在此基礎上,利用荷斯坦牛LR-MSCs向中胚層骨、脂肪和軟骨細胞定向分化,并在細胞水平上對LR-MSCs定向分化能力進行初步驗證。前期研究發現,成骨細胞標志基因(如CollagetypeI、OPN等)與脂肪細胞標志基因(如LPL、PPAR-γ等)密切相關,但其分子機制尚不清楚。其中,ACAN、SOX9是主要的軟骨細胞標志基因。蛋白質聚糖(protein polygonuclein．ACAN)是 ECM的重要組分。SOX9作為一種重要的轉錄因子,可通過時序特異性地調節一系列下游基因,從而影響軟骨分化過程[37]。本試驗結果表明,對于成骨、成軟骨細胞的分化,其融合率應該在50%左右,而對于成脂肪細胞的分化,則應該在80%左右。這一現象的發生,主要原因是在脂肪組織的成脂過程中,細胞停止了增殖,開始了細胞的凋亡。此外,對LR-MSCs的體內特征(生物分布、生物利用率,靶向性等)進行了探討。藥動學等和它們的用途(給藥途徑、給藥劑量、給藥時間間隔;藥效評價等)尚需深入研究。近年來,人們在皮膚、脂肪、肌肉等非血液系統中發現了一種具有組織特征的干細胞。近50年來,LR-MSCs在生物醫藥領域的應用受到了廣泛的關注[38]。充質干細胞(LR-MSCs)是一種具有高度特異性的干細胞,在組織修復與再生醫學領域具有重要意義,是當前組織修復與再生領域的熱點。但是,目前還未見荷斯坦牛肺臟組織來源的LR-MSCs的相關研究。為此,本研究從荷斯坦牛的肺臟細胞中分離出了LR-MSCs,并分析了LR-MSCs的生物學特征;本研究將為肺臟成體干細胞的體外培養和臨床應用奠定基礎[39]。

LR-MSCs的組織培養、 exosomes的提取、制備、篩選適宜的培養基及誘導因素是LR-MSCs組織修復的關鍵。另外,LR-MSCs的組織及 exosomes的保存、轉運及存儲也是LR-MSCs研究的重點。用于臨床的細胞組織制品,其安全及不良反應均需密切監控。雖然存在著上述問題,但以LR-MSCs為基礎的組織工程技術在再生醫學領域仍具有廣闊的應用前景[40]。

4 結 論

本課題組前期已從荷斯坦牛胎牛肺中獲得了LR-MSCs,其體外培養的LR-MSCs具有很強的自我更新能力,且具有很好的體外培養條件。荷斯坦牛LR-MSCs可表達與 MSCs有關的表面標志基因,如CD29、CD44、CD73、CD90、CD106、CD166;而CD34、CD45不表達;荷斯坦牛LR-MSCs具有向成脂、成骨和成軟骨分化的能力,這將可能成為一種新型的組織工程種子細胞。牛肺間充質干細胞(LR-MSCs)具有自我更新、多向分化和免疫調節等特性,是當前再生醫學領域的研究熱點。同時,合適的低氧預處理、物理刺激、基因修飾、可降解載體等也能有效提高LR-MSCs的組織修復能力。同時,LR-MSCs及 exosomes可作為一種自然載體,實現對生物活性物質及藥物的靶向遞送。牛肺間充質干細胞(LR-MSCs)不僅具有多向分化潛能,而且可分泌多種組織因子,具有調控機體免疫、促造血等作用。由于LR-MSCs特有的生物學性質,使LR-MSCs在組織治療、基因治療及組織工程化等領域表現出良好的應用前景。