飼糧中添加腐殖酸鈉對鼠傷寒沙門菌感染肉雞肝組織炎癥和抗氧化能力的影響

王 棟,柳可欣,何炎峻,鄧守翔,劉 云*,馬衛明

(1.山東農業大學動物科技學院,泰安 271000;2.東北農業大學動物醫學學院 黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室,哈爾濱 150030)

沙門菌是一種能通過食物和水傳播的人畜共患病原菌,可引起嚴重的公共衛生問題和食品安全問題[1]。歐洲食品安全局(EFSA)報告稱,食用沙門菌感染的禽肉、禽蛋及其加工產品是導致公共衛生問題的主要原因之一[2]。鼠傷寒沙門菌(SalmonellaTyphimurium,S.Typhimurium)是沙門菌的一種,感染肉雞可導致嚴重的腸道損傷和敗血癥并降低其生長性能和免疫力[3]。肝作為機體最主要的代謝器官,在許多生理和病理生理過程中發揮著重要作用。肝的主要功能是促進機體的新陳代謝和提高解毒能力,這使得肝極易受到內毒素和有害物質的損傷[4]。據報道,S.Typhimurium感染能通過損傷腸上皮細胞間的緊密連接等引起腸道屏障損傷,而腸道內的微生物以及毒素則通過受損的腸道屏障進入血液循環導致敗血癥并引起肝損傷[5]。因此,有效防控沙門菌感染對于提高肉雞的生長性能和保護公眾健康具有重要的意義。然而,出于對細菌耐藥性和不良公共衛生后果的擔憂,一些國家或機構已經限制或嚴格禁止在家禽生產中使用抗生素[6-7]。因此,具有抗菌、抗炎和調節腸道穩態的天然產物在家禽生產中受到越來越多的關注。

腐殖酸(umic acids, HAs)是由泥炭中的有機物分解轉化而成,目前已廣泛應用于農業、醫藥衛生和環境保護等多個領域[8]。腐殖酸鈉(sodium humate, HNa),是HAs的一種鈉鹽,具有抗菌、抗炎、免疫調節、止瀉、止血和促進傷口愈合等特性,在中醫中主要用作止血和止瀉的治療劑[9]。本團隊前期研究表明,HNa不僅能抑制大腸桿菌(E.coli)和S.Typhimurium的增殖,還能通過調節腸道菌群和抑制腸道炎癥反應等減輕E.coli和S.Typhimurium感染引起的小鼠腸道損傷[10-11]。一項對腸產毒素性大腸桿菌(ETEC)感染仔豬的研究表明,HNa干預減少了ETEC在腸道的定植,并緩解了其對仔豬腸道的損傷[12]。此外,陳志敏等[13]的研究表明,飼糧中添加HNa提高了肉雞的生產性能、免疫功能和抗氧化能力。上述研究結果為HNa緩解S.Typhimurium感染引起肉雞肝損傷的保護作用提供了證據,然而,其保護作用和相關機制尚待研究。因此,本試驗旨在探究飼糧中添加不同濃度的HNa對S.Typhimurium感染肉雞肝組織學形態、肝功能、肝抗氧化、肝炎癥因子和炎癥相關信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及主要試劑

腐殖酸鈉(sodium humate, HNa),由中國科學院山西煤炭化學研究所提供。鼠傷寒沙門菌(S.Typhimurium)由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所贈送。將S.Typhimurium接種于LB培養基,置于37 ℃恒溫培養12 h,8 000 r·min-1離心10 min。將收集的菌體用PBS洗3次,之后,用PBS將菌體稀釋到3×109CFU·mL-1。

蘇木精-伊紅(HE)染液(上海碧云天生物技術有限公司),總RNA提取試劑盒(Promega,U.S),反轉錄和實時熒光定量試劑盒(大連TaKaRa公司)。

1.2 試驗動物和試驗設計

將320只初始體重(41.63±0.64)g的健康1日齡雄性愛拔益加(AA)肉雞(購于煙臺大地牧業股份有限公司)隨機分為5組,每組8個重復,每個重復8只雞。試驗分組分別為:對照組(CON,基礎飼糧),模型組(ST,基礎飼糧),低劑量HNa組(L-HNa,基礎飼糧+0.2 g·kg-1HNa), 中劑量HNa組(M-HNa,基礎飼糧+0.4 g·kg-1HNa), 高劑量HNa組(H-HNa,基礎飼糧+0.6 g·kg-1HNa)。參考Marcq等[14]的方法建立S.Typhimurium感染肉雞模型。在試驗第22～24天,CON組肉雞每天灌胃1 mL PBS、ST、L-HNa、M-HNa和 H-HNa 組肉雞每天灌胃1 mL 3×109CFU·mL-1的S.Typhimurium。試驗周期為24 d,在整個試驗期間肉雞自由飲水和采食?；A飼糧組成及營養水平參照《肉雞飼養標準》(NY/T 33—2004)配制,其組成及營養水平見表1。每周記錄不同處理組肉雞的體重和采食量用于計算平均日采食量、平均日增重以及料重比。

表1 基礎日糧組成及營養水平(風干基礎)

1.3 樣品采集與指標檢測

在試驗第25天,從翅靜脈采集不同處理組肉雞的外周血,將采集的血液置于含肝素的抗凝管中,4 ℃,3 500×g離心10 min收集血清,之后,采用頸椎脫臼的方式處死肉雞。解剖肉雞并分離肝組織,PBS沖洗,將一部分肝組織置于4%多聚甲醛中固定用于病理組織學分析,一部分肝組織放入凍存管,液氮速凍后置于-80 ℃保存,用于后續試驗分析。

1.3.1 病理組織學觀察 肝組織在4%多聚甲醛中固定后用流水進行清洗,在分級乙醇中進行梯度脫水,用二甲苯透化并嵌入石蠟中。每個樣本約5 μm厚的切片用二甲苯去蠟,分級,復水,并用蘇木精-伊紅(HE)染色。光學顯微鏡觀察并評估肝組織。

1.3.2 肝功能和抗氧化指標檢測 應用試劑盒檢測肉雞血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)和堿性磷酸酶(AKP)活性,試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

取不同處理組肉雞的肝組織制備組織勻漿,離心后收集上清,應用試劑盒檢測肉雞肝中過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性,以及總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)的濃度,試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3.3 RNA提取和實時熒光定量PCR(qPCR)檢測 取不同處理組肉雞的肝組織制備組織勻漿,離心后收集上清,采用總RNA提取試劑盒提取RNA,采用分光光度計檢測提取的RNA濃度和純度,用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,用逆轉錄試劑盒將提取的RNA逆轉錄為cDNA,之后,應用qPCR檢測肉雞肝組織中白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-18、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-10、一氧化氮合酶(iNOS)、白細胞分化抗原68(CD68)、精氨酸酶-1(ARG1)和白細胞分化抗原163(CD163)的 mRNA表達量。引物由上海生工生物工程有限公司合成(表2)。mRNA的相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算,β-actin為內參基因。

表2 qPCR引物序列

1.3.4 Western blot檢測 用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液勻漿肉雞肝組織,使用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度,將等量提取的蛋白質經SDS-PAGE凝膠電泳進行分離,之后將凝膠轉移至PVDF膜上并置于5%脫脂牛奶封閉2 h,封閉完成后與一抗(NF-κB p65、IκBα、NLRP3、ASC、Caspase-1)過夜孵育(4 ℃),TBST沖洗后,在室溫下與二抗孵育1 h,再用增強化學發光試劑檢測目標蛋白的表達,并使用Image J軟件進行定量分析。

1.4 數據統計分析

試驗數據用 Excel 2010 進行初步整理。數據采用SPSS軟件進行單因素方差分析,結果采用平均值(Mean)和標準誤(SEM)表示,組間差異采用SPSS軟件的Tukey′s HSD檢驗。P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2 結 果

2.1 HNa對S. Typhimurium感染肉雞生長性能的影響

由表3可知,與CON組相比,S.Typhimurium感染顯著降低了肉雞的終末體重和平均日增重(P<0.05)。相較于ST組,飼糧中添加0.4和0.6 g·kg-1的HNa顯著提高了肉雞的終末體重,此外,飼糧中添加0.6 g·kg-1的HNa也顯著提高了肉雞的平均日增重(P<0.05)。各組間肉雞的平均日采食量和料重比沒有顯著差異(P>0.05)。相較于CON組,ST、L-HNa、M-HNa和H-HNa組肉雞感染S.Typhimurium后表現為食欲降低、羽毛松亂、精神委頓以及排稀糞等,在整個試驗期間,沒有肉雞出現死亡。

表3 HNa對S. Typhimurium感染肉雞生長性能的影響

2.2 HNa對S.Typhimurium感染肉雞肝組織學形態的影響

肝病理組織學結果如圖1所示,相較于CON組,S.Typhimurium感染組肉雞肝表現為大量的炎性細胞浸潤,肝小葉結構不清晰和細胞質空泡化,表明S.Typhimurium感染引起了嚴重的肝損傷。與ST組相比,飼糧中添加0.2、0.4和0.6 g·kg-1的HNa均減少了肝炎性細胞浸潤,改善了肝小葉結構,減輕了肝組織病理學損傷。飼糧中添加0.4和0.6 g·kg-1的HNa對S.Typhimurium感染致肝組織損傷的保護作用優于添加0.2 g·kg-1的HNa。此外,肝臟指數的結果也表明,S.Typhimurium感染顯著增加了肉雞的肝臟指數,CON組、M-HNa和H-HNa組肉雞的肝臟指數顯著低于ST組和L-HNa組(P<0.05)。

A. 肝HE染色;B. 肝臟指數:柱上無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同A. Liver HE staining; B. Liver index: Bars with no letter or the same letter mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter mean significant difference (P<0.05). The same as below

2.3 HNa對S. Typhimurium感染肉雞肝功能的影響

HNa對S. Typhimurium感染肉雞肝功能的影響如圖2所示,與CON組相比,ST組肉雞血清中AKP、ALT和AST的活性顯著升高(P<0.05)。相較于ST組肉雞,飼糧中添加0.2、0.4和0.6 g·kg-1的HNa均顯著降低了肉雞血清中AKP、ALT和AST的活性(P<0.05),且不同劑量間無顯著性差異。表明HNa緩解了S.Typhimurium感染引起的肉雞肝損傷。

A. 血清AKP活性;B. 血清ALT活性;C. 血清AST活性A. Serum activity of AKP; B. Serum activity of ALT; C. Serum activity of AST

2.4 HNa對S. Typhimurium感染肉雞肝抗氧化功能的影響

結果如圖3所示,與CON組相比,ST組肉雞肝組織抗氧化酶CAT、T-SOD的活性和T-AOC顯著降低,而MDA的含量顯著升高(P<0.05)。相較于ST組,飼糧中添加不同濃度的HNa均顯著緩解了S.Typhimurium感染對肉雞肝組織抗氧化功能的損傷,表現為肝CAT、T-SOD活性和T-AOC顯著升高,MDA含量顯著降低(P<0.05)。此外,M-HNa組肉雞肝T-AOC顯著高于H-HNa組肉雞(P<0.05)。

A. 肝CAT活性;B. 肝T-AOC;C. 肝T-SOD活性;D. 肝MDA濃度A. Liver CAT activity; B. Liver T-AOC; C. Liver T-SOD activity; D. Liver MDA concentration

2.5 HNa對S. Typhimurium感染肉雞肝炎癥因子和巨噬細胞極化的影響

為探究S.Typhimurium感染對肉雞肝炎癥的影響以及HNa的緩解作用,分別檢測了肉雞肝炎癥因子和M1、M2型巨噬細胞標記物的mRNA表達水平。結果如圖4所示,與CON組相比,ST組肉雞肝促炎細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-18的mRNA表達顯著升高,而抗炎細胞因子IL-10的mRNA表達顯著降低(P<0.05);此外,ST組肉雞肝組織M1型巨噬細胞標記物iNOS和CD68的mRNA表達顯著升高,而M2型巨噬細胞標記物ARG1和CD163的mRNA表達顯著降低(P<0.05)。與ST組相比,飼糧中添加不同濃度的HNa均降低了促炎細胞因子(IL-1β、TNF-α和IL-18)和M1型巨噬細胞標記物(iNOS、CD68)的mRNA表達,提高了抗炎細胞因子(IL-10)和M2型巨噬細胞標記物的(ARG1、CD163)mRNA表達(P<0.05)。進一步的研究發現,與L-HNa和H-HNa組肉雞相比,M-HNa組肉雞肝組織有更低的IL-1β和TNF-αmRNA表達以及更高的IL-10和ARG1 mRNA表達。以上結果表明,飼糧中添加HNa具有調節肝組織炎癥和免疫的作用,且飼糧中添加0.4 g·kg-1HNa優于其它濃度。

A～D. 肝IL-1β、TNF-α、IL-18、IL-10 mRNA表達;E～H. 肝iNOS、CD68、ARG1、CD163 mRNA表達A-D. Liver mRNA expression of IL-1β, TNF-α, IL-18, and IL-10; E-H. Liver mRNA expression of iNOS, CD68, ARG1, and CD163

2.6 HNa對S. Typhimurium感染肉雞肝組織NF-κB和NLRP3信號通路的影響

本研究進一步探究了S.Typhimurium感染對肉雞肝組織NF-κB和NLRP3信號通路的影響。結果如圖5和圖6所示,相較于CON組,S.Typhimurium感染顯著提高了肉雞肝NF-κB p65、NLPR3、ASC和Caspase-1的蛋白表達,顯著降低了IκBα的蛋白表達(P<0.05)。飼糧中添加不同濃度的HNa均抑制了S.Typhimurium感染引起的肉雞肝NF-κB和NLRP3信號通路的激活,表現為降低的NF-κB p65、NLPR3、ASC和Caspase-1的蛋白表達(P<0.05)。

A. 蛋白表達結果;B. NF-κB蛋白表達定量分析;C. IκBα蛋白表達定量分析A. Protein expression results; B. Quantitative analysis of NF-κB protein expression; C. Quantitative analysis of IκBα protein expression

3 討 論

沙門菌是一種重要的人畜共患病原菌。研究表明,食用家禽制品是沙門菌感染導致公共衛生問題的主要原因之一[2]。因此,防控肉雞沙門菌感染可有效減輕沙門菌對公共衛生的危害。作為一種具有多種生物活性的天然產物,HNa已被廣泛應用于農業、醫藥和保健等多個領域。本課題組前期研究發現,HNa能通過調節腸道菌群、抑制腸道炎癥和調節腸道黏膜免疫等緩解病原微生物感染對腸道和肝的損傷[10-11,15]。然而,HNa對S.Typhimurium感染肉雞致肝損傷的保護作用尚不清楚。因此,本研究通過檢測肝組織學形態、肝功能、肝抗氧化、肝炎癥因子和炎癥相關信號通路探究了HNa對S.Typhimurium感染肉雞肝損傷的保護作用及相關機制。

有研究表明,沙門菌感染會降低肉雞的生產性能,引發腸道損傷以及急性系統性疾病[16]。本研究發現,S.Typhimurium感染顯著降低了肉雞的終末體重和平均日增重。陳志敏等[13]的研究表明,飼糧中添加HNa能顯著提高肉雞的生產性能。對仔豬的研究也表明HNa具有提高生長性能的作用[17]。此外,本課題組前期對犢牛的研究也發現,飼糧中添加HNa可以提高犢牛的生長性能,降低犢牛的發病率[18]。本研究進一步證實了飼糧中添加HNa可以有效緩解S.Typhimurium感染對肉雞生長性能的影響。此外,本課題組前期研究發現,S.Typhimurium感染引起了小鼠嚴重的肝損傷[11]。相似的是,本研究表明,S.Typhimurium感染也造成了肉雞的肝損傷,主要表現為大量的炎性細胞浸潤,肝小葉結構不清晰和細胞質空泡化。血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)和堿性磷酸酶(AKP)的活性可作為肝損傷的生物標志物。之前的一項研究表明,S.Typhimurium感染顯著提高了小鼠血清ALT、AST、AKP和總膽汁酸(TBA)的水平[19]。與此相一致的是,S.Typhimurium感染也顯著提高了本試驗中肉雞血清中ALT、AST和AKP的水平,且肝組織病理學和肝功能的檢測結果均表明S.Typhimurium感染導致了肉雞肝損傷。飼糧添加HNa顯著降低了肉雞肝病理組織學損傷和血清中AKP、ALT和AST的水平,表明HNa緩解了S.Typhimurium感染對肉雞肝損傷。研究表明,S.Typhimurium感染引起肝損傷的原因主要通過破壞腸道屏障導致S.Typhimurium和腸道有害物質進入血液通過腸肝循環進入肝,導致肝組織發生炎癥反應和肝細胞凋亡等引發肝損傷[16]。本團隊前期的研究發現,HNa通過調節腸道菌群、抑制腸道炎癥和促進腸上皮細胞增殖等緩解了S.Typhimurium和大腸桿菌感染對小鼠腸道屏障的損傷[10-11],此外,本課題組還發現HNa可以通過抑制肝TLR4/NF-κB和NLRP3信號通路的激活緩解LPS誘導的小鼠肝損傷(數據未發表)。與之前的研究一致,本研究的結果表明飼糧中添加HNa緩解了S.Typhimurium感染對肉雞肝組織的損傷。綜上所述,可以推測HNa主要通過提高腸道屏障的完整性和抑制肝炎癥反應緩解肝損傷。

免疫系統是機體抵御病原體和有害物質入侵的第一道防線。巨噬細胞具有分泌細胞因子、吞噬和殺傷病原體、維持免疫平衡等多種功能[20]。庫普弗細胞(Kupffer cell)是位于肝中的特殊巨噬細胞,在介導肝免疫和炎癥反應中發揮重要的作用。研究表明,過度的巨噬細胞浸潤會促進炎癥的發展[21]。此外,在肝損傷或感染的情況下,巨噬細胞可在促炎的M1型和抗炎的M2型之間轉換。M1型巨噬細胞可介導Th1免疫反應,在感染初期和炎癥急性期發揮關鍵作用。M2型巨噬細胞介導Th2免疫反應,負責組織重塑和穩態維持[22]。本研究發現,S.Typhimurium感染顯著增加了M1型巨噬細胞標志物iNOS和CD68的mRNA表達,降低了M2型巨噬細胞標志物ARG1和CD163的mRNA表達,表明S.Typhimurium感染誘發了肉雞肝組織嚴重的炎癥反應。相較于ST組,飼糧中添加HNa降低了iNOS和CD68的mRNA表達,增加了ARG1和CD163的mRNA表達,表明HNa促進了肝中的巨噬細胞向M2型極化。這與本課題組前期研究發現類似,即HNa干預通過促進巨噬細胞M2型極化降低了S.Typhimurium感染誘發的小鼠腸道炎癥反應[11]。眾所周知,NF-κB是參與炎癥性疾病的主要轉錄因子。作為NF-κB的抑制劑,IκBα通過在細胞質中形成不活躍的NF-κB/IκBα復合物抑制NF-κB的激活。當存在細胞外刺激的情況下,磷酸化介導的IκBα會發生降解,進而激活NF-κB并誘導IL-1β和TNF-α等促炎細胞因子的分泌[23]。研究表明,IL-1β可以激活巨噬細胞表面NOD樣受體蛋白3(NLRP3),此外,激活的NF-κB也能與NLRP3啟動子結合激活NLRP3。激活的NF-κB信號通路和NLRP3炎性小體可以促進IL-1β和IL-18的成熟和釋放,并進一步通過反饋回路加劇炎癥反應[24]。研究發現,抑制炎癥信號通路的激活和誘導巨噬細胞向M2型極化是炎癥性相關疾病的潛在治療方案[25-26]。本研究發現,S.Typhimurium感染激活了肉雞肝組織NF-κB信號通路和NLRP3炎性小體,主要表現為NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18和TNF-α表達的增加。本研究還發現,飼糧添加HNa顯著降低了肉雞肝組織NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白表達以及IL-1β、IL-18和TNF-α的mRNA表達水平,表明HNa對炎癥相關信號通路和促炎細胞因子的抑制作用。本課題組前期研究也表明,HNa干預能通過抑制炎癥反應有效緩解E.coli和S.Typhimurium感染對小鼠腸道的損傷[10-11]。除了抗炎作用外,對仔豬、犢牛和小鼠的研究均表明,HNa還具有較強的抗氧化作用[11-12,18]。氧化應激的特點是活性氧(ROS)的過度產生超出了機體的抗氧化防御能力。ROS 可導致各種細胞損傷,包括脂質過氧化、DNA 損傷和蛋白質氧化,最終加劇組織損傷和炎癥。眾所周知,CAT、T-AOC 和 T-SOD 是催化超氧陰離子和過氧化氫(H2O2)轉化為無毒化合物的關鍵抗氧化酶,是細胞抗氧化防御的重要組成部分。脂質過氧化水平可通過檢測MDA的濃度進行測量[27-28]。本研究發現,在S.Typhimurium感染的肉雞肝組織內,抗氧化酶(CAT、T-AOC和T-SOD)的活性急劇下降,而MDA濃度顯著升高,表明S.Typhimurium感染對肉雞肝造成了嚴重的氧化損傷。相較于ST組肉雞,飼糧中添加不同濃度的HNa均顯著提高了肉雞肝組織CAT、T-SOD的活性和T-AOC,降低了MDA的濃度,表明HNa提高了肝的抗氧化功能。本團隊還發現,喂服HNa能顯著提高犢?？寡趸傅幕钚?數據未發表)。此外,Wang等[17]證實,給斷奶仔豬服用HNa也能提高抗氧化酶的活性?；谇叭撕捅狙芯康慕Y果,可以推測,飼糧中添加HNa主要通過提高肉雞肝組織抗氧化酶的活性發揮抗氧化作用。

4 結 論

綜上所述,飼糧中添加HNa可通過降低肝炎癥反應、抑制肝NF-κB和NLRP3信號通路的激活以及提高肝抗氧化酶的活性等緩解S.Typhimurium感染對肉雞肝的損傷。在本試驗條件下,飼糧中添加0.4～0.6 g·kg-1的HNa對肉雞肝損傷有更好的保護作用。