豬瘟病毒C株表位突變毒株的構建及拯救

劉元杰,徐 璐,朱元源,徐 嫄,張乾義,李 翠,李 明,夏應菊,王 琴,劉業兵,趙啟祖,鄒興啟

(中國獸醫藥品監察所國家豬瘟參考實驗室,北京 100081)

豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種高發病率、高死亡率的急性、熱性、接觸性傳染病。該病沒有固定的季節性,給全球的養豬業帶來了巨大的經濟損失。豬瘟病毒為豬瘟的病原,屬于黃病毒科瘟病毒屬,為單股正鏈RNA。CSFV基因組全長12.3 kb,唯一的開放性閱讀框編碼一個多聚蛋白,該多聚蛋白由3 989個氨基酸殘基組成,在宿主細胞內蛋白酶和病毒特異的蛋白酶作用下裂解成12個成熟蛋白,從N端到C端依次是Npro、C、Erns、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[1-4]。我國使用豬瘟病毒C株很好地控制了豬瘟疫情,但要凈化豬瘟,則需要通過檢測抗體來區分自然感染和疫苗免疫動物,因此,標記疫苗的研究迫在眉睫[5]。E2在CSFV所有蛋白中免疫原性良好,可以產生有效的中和抗體,從而對動物提供保護[6]。有研究者發現,豬瘟WH303單抗可以和CSFV的56個病毒株反應,但是不能和其他瘟病毒屬成員,如BVDV、BDV反應[7]。據推測,WH303可以識別CSFV上保守的一個肽段,該肽段也正是可以區分CSFV和BVDV以及BDV的關鍵。在此基礎上,有研究者用分子克隆方法敲除豬瘟病毒Alfort187株E2區段內的221個氨基酸,通過分段表達E2蛋白最終確定WH303最小識別基序為TAVSPTTLR[8]。2014年,有學者在豬瘟強毒BICv基礎上,插入特異性片段flag,構建FlagT4v[9],后又在FlagT4v基礎上構建FlagT4Gv,解決了傳代毒力返強的問題[10]。目前,很大一部分豬瘟標記疫苗都是在強毒基礎上構建的,存在不可控的生物安全隱患,如果以弱毒C株為基礎,構建標記疫苗,可以從根本上解決這一問題,同時能夠保持C株優秀的免疫效果。本試驗以C株和實驗室已成功構建的C-flag株[11]為基礎,通過突變WH303位點,使該位點序列與BVDV NADL株保守序列一致[8]。并對病毒進行拯救,以期得到WH303單抗反應為陰性的突變毒株。

1 材料與方法

1.1 細胞系和病毒感染性克隆

PK15細胞由中國獸醫藥品監察所保存;C株半長感染性克隆CH、CH-flag,C株全長感染性克隆C株和C-flag感染性克隆由本實驗室構建保存;單抗WH303由英國APHA Weybridge的Trevor Drew教授惠贈、單抗1C8由本實驗室制備保存。

1.2 試劑

pGEM-T easy載體:Promega生物技術有限公司;限制性內切酶:SnaBI、NgoMIV、BamHI、NotI、SacI:NEB公司;羊抗鼠二抗(HRP)(CW0102 S):康為世紀生物科技有限公司(50230);羊抗鼠二抗(FITC)(F9006):賽默飛生物科技有限公司(SLBQ6729V);MEM(11095-080):Gibco公司(1858767);胎牛血清(16010-159):Gibco公司(8174565);反轉錄試劑盒:天根生物科技有限公司(Q5504);豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒:愛德仕生物科技有限公司;豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒:中國獸醫藥品監察所

1.3 實驗動物

實驗兔:日本大耳白兔(2～3 kg)20只,購自北京隆安實驗動物養殖中心。

1.4 WH303位點的突變

通過重疊PCR擴增得到突變片段M,再將其連接至T載體,經過篩選得到陽性克隆MT。以MT為模板,引物P297、P298為模板,進行PCR 擴增。得到的產物進行測序,與引物P582、P583序列比對,驗證是否突變成功。突變與驗證引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 突變毒株MC和MC-flag的構建

通過酶切連接的方法,先將MT連接至豬瘟病毒C株半長CH、CH-flag,再連接至全長C株和C-flag,得到WH303突變的C株全長感染性克隆MC和MC-flag。將MC和MC-flag分別進行酶切鑒定(表2),同時進行PCR測序后進行比對,驗證突變穩定性。

表2 重組質粒對應的內切酶與理論條帶大小

1.6 MC和MC-flag 病毒拯救

大量提取MC和MC-flag質粒,進行線性化處理、去RNase操作后,按照轉錄試劑盒操作,體外合成RNA。將合成的MC和MC-flag RNA電轉至PK15細胞,每個樣品加入10 μL RNA和密度為1×107個·ml-1的細胞,均以750 V、25 μF電擊,同時設不加RNA的空白對照。每個樣品加入到10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基中,然后分別轉移至6孔細胞培養板中,在37 ℃,5%CO2培養。

1.7 帶毒細胞的傳代與檢測

將MC電轉后長滿的PK15細胞按1∶3傳代,培養48 h,在細胞生長密度達到90%左右時,再次進行傳代。按照上述方法,傳代至17代。取F0、F6、F12、F17細胞培養液上清進行RT-PCR,同時對細胞進行IPMA檢測。

1.8 MC株兔體傳代與檢測

MC株在實驗兔中傳3代,第一代MC株、C株各4只,對照2只;第二代MC株4只、對照1只;第三代MC株4只,對照1只。以耳緣靜脈注射接種,每只接種1 mL。接種后測量實驗兔體溫。第一代接種C株兔和第三代接種MC株兔安樂死后取脾組織,制備組織切片。分別用單抗WH303和單抗1C8進行免疫組織化學試驗,比較接種C株和MC株兔脾組織對兩種單抗的不同反應。

2 結 果

2.1 MC和MC-flag酶切鑒定結果

以限制性內切酶對MC和MC-flag構建過程中的陽性質粒進行酶切鑒定,得到的條帶均符合預期(圖1)。測序結果與引物P582、P583進行序列比對一致,說明WH303突變位點在分子構建過程中保持穩定。

M. 10000DL bp Marker;1. MC單酶切;2. MC-flag單酶切;3. MC雙酶切;4. MC-flag雙酶切M. 10000DL bp Marker; 1. Single restriction of MC; 2. Single restriction of MC-flag; 3. Double restrictions of MC; 4. Double restrictions of MC-flag

2.2 RNA轉錄

轉錄結果顯示有明顯條帶,說明3株陽性質粒cDNA條帶轉錄成功(圖2)。

M. DL15000 bp Marker;1. C株;2. MC株;3. MC-flag株;M. DL15000 bp Marker; 1. Strain C; 2. Strain MC; 3. Strain MC-flag

2.3 突變病毒檢測

2.3.1 病毒序列比對結果 在F6、F12和F17細胞培養上清中均檢測到病毒。PCR產物送測序,與引物P582、P583進行序列比對也一致(圖3),說明在病毒傳代的過程中,突變位點可以穩定遺傳。

圖3 測序后序列比對Fig.3 Sequence alignment after sequencing

2.3.2 IPMA 轉染后48 h、F6和F12:C株與 H303和1C8兩個單抗反應均為陽性;MC株與WH303反應為陰性,與1C8反應為陽性(圖4)。MC-flag與1C8反應在48 h時可以檢測到輕微陽性,F6時顯示陰性,說明病毒在傳代過程中丟失。

A. C株WH303;B. C株1C8;C. MC株WH303;D. MC株1C8;E. 陰性對照A. WH303 IPMA of the rescued strain C; B. 1C8 IPMA of the rescued strain C; C. WH303 IPMA of the rescued strain MC; D. 1C8 IPMA of the rescued strain MC; E. Negative control

2.4 兔體試驗結果

2.4.1 兔體熱反應結果 從兔體發熱情況來看,在第一代接種C株的兔中,體溫升高情況非常明顯,全部達到定型熱的標準。但是接種MC株的兔在前兩代MC株體溫升高情況不明顯,以可疑反應為主,少量輕熱反應。到第三代體溫在72～80 h后有明顯升高,升高幅度在1.5～2 ℃,都為定型熱反應。兔體溫度變化見圖5。

圖5 參試病毒兔體接種體溫測定圖Fig.5 Body temperature of rabbits inoculated with experimental virus

2.4.2 組織切片免疫組織化學結果 第三代兔脾組織切片的免疫組織化學染色結果顯示,C株與單抗WH303和1C8免疫組織化學反應都為陽性,MC株與單抗WH303免疫組織化學反應為陰性,與單抗1C8反應為陽性,說明MC株的突變WH303表位序列保持穩定,同時又保持識別單抗1C8的能力。對照組與單抗WH303和1C8反應都為陰性。免疫組織化學結果見圖6。

圖6 兔脾組織免疫組織化學結果(20×)Fig.6 Immunohistochemical results of rabbits spleen (20×)

3 討 論

反向遺傳學操作平臺,是應用于RNA病毒基因構建比較成熟的技術方法。鄒興啟等[12]完成了C株全長cDNA感染性克隆的構建和拯救;朱元源等[13]和韓燾[11]分別在豬瘟石門株和豬瘟C株的基礎上,插入標記多肽flag片段,構建并拯救帶有flag陽性標記的毒株。Flag是專為標記而設計的多肽標記物,為非已知蛋白。與插入flag的陽性標記相比,本研究在C株和C-flag株的基礎上突變WH303位點,構建陰性標記。相較于陽性標記,陰性標記可以減少陽性標記鑒定中弱陽性和假陽性的干擾,在鑒定過程中更為直觀。遺憾的是,MC-flag在拯救后傳代的過程中丟失,沒能構建成功同時含有陰性標記和陽性標記的C株突變毒株。由于MC株在傳代的過程中1C8單抗反應陽性率也明顯低于C株,據此推測,WH303結合位點對原毒株的增殖和傳代可能會有一定影響。如何驗證這一猜想并有針對地減少這種影響,保證突變毒株的復制效率還有待后面進一步的研究。

本研究利用重疊PCR的方法達到特異片段突變的目的,在實際操作中,直接以回收片段為模板擴增沒有成功擴增出突變后的297～300片段。針對這種情況,采用不加引物延伸補平后加引物擴增,通過對比試驗找出了最佳的無引物擴增循環數,為這一操作方法提供數據支撐。

在MC構建過程中,采用瓊脂糖凝膠電泳觀測特異性PCR條帶、PCR產物測序和酶切3種方法,實時驗證每一步構建結果的準確性和WH303位點突變的穩定性。測序結果與引物P582、P583序列比對,結果都顯示吻合,這說明WH303位點突變后是穩定的,沒有在后續的操作過程中發生回復突變。在MC全長陽性克隆構建完成后,選用了ScaI單酶切和NotI、BamHI雙酶切兩組酶切進行驗證,結果顯示產生的條帶均與理論值相符。

單抗1C8與WH303都位于豬瘟病毒E2基因中的保守位點,1C8位于898～906位[14],WH303位于829～837位,二者位置不重疊。單抗1C8研究目前已經比較成熟,可以作為IPMA的陽性對照。IPMA使用C株作為病毒株陽性對照,使用單抗1C8作為單抗陽性對照。結果顯示,MC株與WH303反應為陰性,而與1C8反應為陽性,而C株與兩個單抗反應都為陽性,這說明成功拯救的MC株達到了預期的標記效果。MC-flag雖然在轉染后檢測到病毒存在,但在后續傳代過程中丟失,可能是由于WH303的突變影響了病毒的增殖能力所致,具體原因還需要后續試驗進一步探究。

從IPMA結果中可以看出,MC株與C株在PK15細胞中傳代時隨著代次的增加,陽性率略有所下降,因此需要確定突變對病毒增殖是否有影響。影響病毒增殖的因素有很多,培養溫度、血清、培養基、微量化學物質等,以及病毒在感染細胞時與細胞本身的相互作用都會對病毒基因組復制產生影響[15]。E2蛋白位于病毒囊膜表面,是變異程度較大的一個蛋白。但是,單克隆抗體WH303位點位于E2上的保守抗原表位中。豬瘟病毒表面抗原決定簇主要分布在A、B、C、D四個結構域中[16-17],這四個結構域都位于E2蛋白[18]。E2蛋白參與病毒對細胞感染的過程,攜帶有能刺激CSFV中和抗體產生的抗原決定簇。所以,不排除WH303表位的陰性突變對病毒E2結構蛋白產生影響進而影響其增殖的可能性。由于豬瘟病毒增殖不引起細胞病變,可與傳代細胞共繁殖。帶毒細胞傳代繁殖病毒,但病毒增殖速率達不到細胞增殖速率時,通過IPMA檢測病毒陽性率可能呈下降趨勢。當前,我國寧宜寶等[19]通過ST傳代細胞繁殖豬瘟C株,細胞維持時間可達20～30 d,解決了豬瘟病毒C株生產培養的難題,因此后續可嘗試在ST細胞中繁殖,優化生產工藝以增加病毒滴度。

區分疫苗免疫與野毒感染的標記疫苗已經成為豬瘟防控研究中的熱點,國內外學者已經做了大量研究。Flc9和Flc11通過C株與牛病毒性腹瀉病毒 II(BVDVII)5250 株重組構建而來[20],具有良好的免疫原性,且不在動物中水平傳播[21]。CP7_E2alf是以BVDVCP7株為框架,通過反向遺傳學方法用CSFV187株的E2基因替換CP7株相應區段構建而來[22]。接種豬后,細胞因子TNF-ɑ和IL-6含量明顯降低,而IFN-γ和 IgG2含量卻明顯升高,說明了CP7_E2alf 在細胞免疫方面的重要作用[23]。該疫苗作為歐盟第一個被官方授權的標記疫苗[24],保護性強于Flc11株[25],且遺傳穩定,更加安全[26]。Hulst等[27]構建了表達 E2基因的亞單位疫苗pAcAS3gXE2±TMR,接種豬后可以抵御豬瘟強毒的攻擊[27],其具有良好的安全性,但是免疫效果不如C株。國內已經獲批的E2亞單位疫苗有2個,理論上可以通過鑒別Erns蛋白表達抗體達到區分免疫與野毒感染的目的。但由于Erns蛋白在豬體內表達量低,檢測難度大,目前還沒有成熟的檢測方法。在構建標記疫苗候選的毒株的過程中,由于強毒本身的特性,標記位點在傳代過程中不穩定,存在回復突變導致毒力返強的問題。豬瘟C株經歷了多年的臨床實踐,成為國內豬瘟防控的“金標準”。MC株在C株的基礎上設計構建而來,在一定程度上避免了生物安全隱患。MC株在PK15細胞中傳代穩定,突變表位未發生回復突變或其它變異,有望開發成為安全、穩定、有效的豬瘟標記疫苗。

4 結 論

4.1以豬瘟C株和C-flag為原材料,成功構建WH303突變毒株MC和MC-flag的陽性克隆。

4.2以PK15細胞為宿主,成功拯救MC株,病毒遺傳穩定性良好。