基于微生物組和宿主轉錄組整合分析香砂六君子湯對ETEC誘導斷奶腹瀉仔豬回腸損傷的調控機制

肖 樂,劉峻源,曾雯玉,汪 芹,韓雯玨,劉彥泠,范 譽,徐雨婷,楊貝妮,肖 雄*,王自力*

(1.西南大學動物醫學院,重慶 400715;2.浙江大學動物科學學院,杭州 310058;3.浙江大學動物醫學中心,杭州 310058)

仔豬斷奶后腹瀉是全球養豬業最具威脅的疾病之一,也是仔豬死亡的主要原因,給養豬業造成巨大的經濟損失。研究發現產腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli, ETEC)是引起斷奶仔豬腹瀉的最常見的食源性病原[1]。主要表現為水樣腹瀉,伴有精神沉郁、食欲不振和脫水等[2]。生產上常用抗生素和飼料添加氧化鋅來防治仔豬腹瀉,然而抗生素和醫學水平的氧化鋅長期過度使用會導致細菌耐藥性的產生以及土壤中鋅濃度升高,對人類健康和環境產生不利影響[3-4]。因此,尋找替代性預防和治療ETEC感染的藥物及方法對養豬業生產至關重要。

中獸醫理論認為,斷奶仔豬腹瀉的主要病因是脾虛濕盛,脾胃虛弱是斷奶仔豬腹瀉的內因,濕盛則是外因,造成飼料腐熟無力,水谷不化,合污而下,形成腹瀉[5-6]。香砂六君子湯出自《古今名醫方論》,藥方組成包括黨參、白術、茯苓、甘草、陳皮、半夏、木香、砂仁,在補脾健胃、燥濕化痰及補中益氣方面功效顯著[7-8]。研究表明,香砂六君子湯可通過多靶點有效調節胃腸道酸堿度,抑制促炎因子的表達從而緩解腸道炎癥反應[9-10]。洪文文[11]發現香砂六君子湯能有效提高機體免疫功能,主要是通過調控淋巴細胞亞群比例和免疫相關細胞因子水平[11]。另外,在日糧中添加香砂六君子湯能有效減輕ETEC誘導的斷奶仔豬腹瀉,促進小腸黏膜發育[12]。本研究通過灌服香砂六君子湯治療ETEC誘發的斷奶仔豬腹瀉,從臨床表現、腸道炎性損傷、轉錄組學、微生物組學和MAPK信號通路綜合評估香砂六君子湯對ETEC致斷奶仔豬腹瀉的防治效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

主要試劑:ETEC菌株(CVCC196,O8:H19:K88ac)購自中國獸醫微生物菌種保藏管理中心;中藥黨參、白術、茯苓、炙甘草、陳皮、制半夏、木香、砂仁購自重慶眾妙藥業有限公司;qRT-PCR熒光定量檢測試劑盒(G892)購自Abm公司;BCA蛋白濃度檢測試劑盒(P0010 S)、RIPA裂解液(P0013B)、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑(P1045)購自碧云天生物技術有限公司;抗體β-Actin(4970 S)、p-ERK(9101 S)、ERK(9102 S)、p-p38(9215 S)、p38(8690 S)、p-JNK(9251 S)、JNK(9252 S)和Anti-Rabbit IgG(7074 S)購自CST公司;Anti-Mouse IgG(#31430)購自Invitrogen公司。

主要儀器:-80 ℃超低溫冰箱(DW-HL860)購自美菱生物醫療;旋轉蒸發儀(RE-5286A)購自上海亞榮生化儀器廠;恒溫細菌培養搖床(THZ-100B)購自上海市一恒科學儀器有限公司;石蠟切片機(RM-3375)購自Leica公司;光學顯微鏡(BX53)購自Olymus公司;測序系統(NovaSeqTM 6000 Sequencing System)購自illumnia公司;實時熒光定量PCR儀(7500/Bio-RAD icyoler)購自Bio-Rad公司;電泳儀(Mini-protean tetra)購自Bio-Rad 公司;顯影儀(GelDoc XR +)購自Bio-Rad公司。

1.2 香砂六君子湯提取方法

取香砂六君子湯(黨參193 g、白術193 g、茯苓193 g、炙甘草65 g、陳皮97 g、制半夏97 g、木香65 g、砂仁97 g)1 000 g,按照1∶10和1∶8的比例先后加水煮沸后,改文火煮沸45 min,合并2次濾液,采用旋轉蒸發儀于80 ℃負壓蒸發濃縮至1 g生藥·mL-1,冷卻后分裝并置于4 ℃冰箱保存備用[12]。

1.3 動物分組及處理

24頭21日齡杜×長×大三元雜交雄性斷奶仔豬(重慶市盈和農業科技有限公司)在25 ℃左右,40%～65%的相對濕度下飼養,試驗期間給與充足的清潔飲水和無抗飼料。適應性飼喂3 d后,將仔豬隨機分為對照組(CON組)、模型組(MOD組)和香砂六君子湯組(XS組)。連續14 d給XS組灌服香砂六君子湯(1 mL·kg-1,1 g·mL-1),其余組灌服等量無菌水,第15天給MOD組和XS組仔豬按1 mL·kg-1體重連續3 d灌服1011CFU·mL-1的ETEC菌液,XS組繼續灌服香砂六君子湯。第18天仔豬安樂死,采集各組仔豬腸道組織及回腸內容物樣本。

1.4 腹瀉評分

攻毒后每日觀察仔豬肛周及糞便,按照腹瀉評分標準進行評分并記錄。腹瀉評分標準見表1[13]。

表1 糞便評分標準

1.5 腸道組織病理學檢查

取40 mL·L-1中性甲醛固定后的回腸組織制作石蠟切片,HE染色,于光學顯微鏡下觀察腸道組織病理學變化,測量腸絨毛高度與隱窩深度并計算腸絨毛高度與隱窩深度比(V/C)。每個腸段切片選取6根最長絨毛及6處最深隱窩進行測量,取平均值進行統計。

1.6 qRT-PCR法檢測回腸組織炎性因子mRNA轉錄水平

按照RNA提取試劑盒步驟提取總RNA,反轉錄合成cDNA。根據NCBI數據庫查找目的基因序列,利用Primer Premier 5.0設計引物,由華大基因合成。單個樣本設計3個復孔,記錄Ct值,采用2(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對轉錄量。相關引物信息見表2。

表2 引物序列信息

1.7 RNA序列分析

用Trizol法提取仔豬回腸組織的總RNA并對RNA進行純化、片段化、反轉錄、擴增以及質量控制,然后在Illumina平臺上進行測序。測序結果經過Cutadapt過濾后,使用HISAT2軟件與仔豬參考基因組進行比較并篩選?；虮磉_的差異性統計分析由DESeq進行,參數為|fold change|>2且P<0.05。使用R語言ggplots2軟件包繪制差異表達基因的火山圖。使用R語言Pheatmap軟件包對樣品進行雙向聚類分析。利用GO數據庫(http:∥www.geneontology.org/)和KEGG數據庫(http:∥wego.genomics.org.cn)分別進行GO富集分析和KEGG富集分析。由上海派森諾生物科技股份有限公司完成測序,所有數據分析在派森諾基因云平臺進行(https:∥www.genescloud.cn)。

1.8 回腸內容物16S rDNA高通量測序

取-80 ℃凍存的回腸內容物,置于盛有干冰的保溫箱后送往上海派森諾生物科技股份有限公司進行16S rDNA V3-V4區高通量測序,引物為 F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′,R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。采用Illumina平臺對群落DNA片段進行雙端測序,運用 QIIME2 dada2方法進行去引物,質量過濾,去噪,拼接和去嵌合體等步驟,并對ASV/OTU表進行抽平。通過計算Alpha多樣性指數(包括Chao1指數、Observed_species指數、Shannon指數和Simpson指數等)評價微生物種類的豐富度及均勻度。采用非量度多維尺度分析(NMDS)評估Beta多樣性。對組間門、綱、目、科、屬水平的類群豐度進行統計學比較。采用LEfSe分析組間腸道微生物的差異,并找出可能的標記物種?；贙EGG數據庫,采用PICRUSt進行微生物組功能預測分析。

1.9 Western blot法檢測回腸炎性信號通路MAPK相關蛋白的表達

凍存的回腸組織液氮充分研磨后,按照每20 mg組織加入200 μL含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液進行裂解,充分裂解后4 ℃,12 000 r·min-1離心取上清。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度后將蛋白煮沸變性,隨后進行SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜,封閉,分別用p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK和β-Actin一抗4 ℃孵育過夜,洗膜3次,二抗室溫孵育2 h,洗膜3次后滴加ECL顯色液顯影,采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.10 統計學分析

2 結 果

2.1 香砂六君子湯緩解ETEC誘導的斷奶腹瀉仔豬回腸炎性損傷

與CON組相比,MOD組斷奶仔豬腹瀉評分極顯著升高(P<0.01),與MOD組相比,XS組腹瀉評分極顯著下降(P<0.01)(圖1 A)。CON組回腸組織結構完整,腸上皮絨毛排列整齊無脫落,腺體及隱窩清晰且豐富;與CON組相比,MOD組回腸組織腸上皮絨毛脫落嚴重,固有層結構疏松,腺體稀疏且結構不完整,V/C值極顯著下降(P<0.01);與MOD組相比,XS組回腸組織結構完整,腺體豐富且排列整齊,V/C值極顯著升高(P<0.01)(圖1B、C)。與CON組相比,MOD組回腸組織IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA表達量極顯著升高(P<0.01);與MOD組相比,XS組回腸組織IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA表達量顯著或極顯著降低(P<0.01)(圖1D～F)。

2.2 香砂六君子湯對ETEC誘導的斷奶腹瀉仔豬回腸特征基因和通路的調控作用

DESeq分析顯示,MOD組與XS組存在110個差異表達基因,其中XS組相對于MOD組上調的差異基因22個,下調基因88個(P<0.05)(圖2A)。上調基因包括TNFAIP8L2(先天免疫反應的負調節劑)、TRIM67(NF-κB信號通路的抑制因子)等;下調基因包括CXCL2(參與中性粒細胞募集)、EGF(調節腸道炎癥的表皮生長因子)、NOX1(誘導氧化應激和炎性因子產生)、CCL28(黏膜趨化因子)、FABP2(脂肪酸結合蛋白2)、FABP6(脂肪酸結合蛋白6)、IL1RAP(白細胞介素1受體輔助蛋白)、CEBPB(調節免疫和炎癥反應)等(圖2B)。GO分析表明,MOD組與XS組之間的差異基因主要富集于細胞外區域、對細菌和外部刺激的免疫反應、體液免疫等(圖2C)。KEGG富集分析表明,MOD組與XS組之間富集的信號通路包括MAPK信號通路、PPAR信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用和NOD樣受體信號通路等(圖2D)。

2.3 香砂六君子湯對ETEC誘導的斷奶腹瀉仔豬腸道微生物的調控

采用Illumina平臺對16S rDNA的V3-V4區域進行測序分析CON、MOD和XS組(n=3)回腸內容物的菌群結構,9個樣本共檢測到819 702個原始讀段,平均每個樣本檢測到(91 078±10 232)個原始讀段。Alpha多樣性分析顯示,Chao1、Simpson、Observed species和Shannon指數無顯著性差異(P>0.05),即各組間腸道微生物Alpha多樣性無統計學差異(圖3A)。NMDS分析結果顯示,各組微生物存在明顯聚類趨勢(圖3 B)。為了研究腸道微生物群的變化情況,對測序鑒定出的各組主要分類群的相對豐度進行了比較。在門水平上,與CON相比,MOD組變形菌門極顯著上調(P<0.01),厚壁菌門極顯著下調(P<0.01);與MOD相比,XS組變形菌門極顯著下調(P<0.01),厚壁菌門極顯著上調(P<0.01)。在屬水平上,與CON相比,MOD組乳酸菌屬下調,志賀氏菌屬、鹽單胞菌屬、梭菌屬、放線桿菌屬和擬桿菌屬上調,但無統計學差異(P>0.05);與MOD相比,XS組乳酸菌屬上調,志賀氏菌屬、鹽單胞菌屬、梭菌屬、放線桿菌屬和擬桿菌屬下調,但無統計學差異(P>0.05)(圖3C～E)。

A. 腹瀉評分;B. 回腸組織切片;C. 腸絨毛高度與隱窩深度比值(V/C值);D. IL-1β mRNA水平;E. IL-6 mRNA水平;F. IL-8 mRNA水平。*/**表示與CON比較,*.P<0.05,**. P<0.01,#/##表示與MOD比較,#.P<0.05,##. P<0.01,下同 A. Diarrhea score; B. Ileal tissue sections; C. The ratio of villus height to crypt depth (V/C value); D. IL-1β mRNA level; E. IL-6 mRNA levels; F. IL-8 mRNA levels. */** indicates comparison with CON group, *.P<0.05 and **.P<0.01, #/## indicates comparison with MOD group, #. P<0.05 and ##. P<0.01, the same as below 圖1 香砂六君子湯緩解ETEC誘導的斷奶仔豬回腸炎性損傷Fig.1 Xiangsha Liujunzi decoction alleviates ETEC-induced inflammatory injury in the ileum of weaned piglets

為了進一步分析腸道微生物的變化,使用LEfSe分析各組間的差異,結果顯示,CON組的Lactobacillaceae富集,MOD組的Shigella富集,XS組的Deinococcus和Eubacterium富集(LDA評分>3.0,P<0.05)(圖3E～G)。采用基于KEGG的 PICRUSt2分析預測菌群功能,結果顯示脂多糖合成、生物素代謝和膽汁酸合成等通路存在明顯差異(圖3H)。

2.4 香砂六君湯對ETEC致斷奶腹瀉仔豬回腸組織MAPK信號通路的調控

與CON組相比,MOD組仔豬回腸組織在ETEC感染后p-p38/p38和p-JNK/JNK比值顯著或極顯著升高(P<0.01或P<0.05),p-ERK/ERK比值略有升高,但無統計學差異(P>0.05);與MOD組相比,XS組p-p38/p38和p-ERK/ERK比值極顯著降低(P<0.01),p-JNK/JNK比值略有降低,但無統計學差異(P>0.05)(圖4)。

3 討 論

ETEC是誘發斷奶仔豬腹瀉的主要病原之一,主要定植在斷奶仔豬的腸道中,可分泌腸毒素破壞腸道屏障并誘發腸道炎癥[14]。研究發現,斷奶仔豬感染ETEC后除表現明顯的腹瀉癥狀外,腸絨毛和隱窩發育阻滯,導致對營養成分的消化吸收能力下降[15-16]。同時,ETEC還誘導斷奶仔豬腸道肥大細胞(MCs)的活化和促進炎性細胞因子(如IL-1β、IL-6和IL-8等)的合成和分泌,誘發急性腸道炎癥[17-18]。本研究發現,斷奶仔豬灌服ETEC后出現明顯的腹瀉癥狀,回腸組織結構損傷明顯,腸道發育受阻(V/C值下降),炎性因子IL-1β、IL-6和IL-8表達升高,表明ETEC致斷奶仔豬腹瀉模型構建成功。香砂六君子湯灌服后腹瀉仔豬的腹瀉評分下降,腹瀉得到有效控制,回腸組織結構恢復完整,V/C值升高,炎性因子IL-1β、IL-6和IL-8表達降低,表明香砂六君子湯可有效緩解ETEC誘導的斷奶仔豬腹瀉,抑制腸道炎癥反應,促進腸道發育。

轉錄組學分析結果顯示,MOD組與XS組存在110個差異表達基因,其中XS組相對于MOD組上調的差異基因22個,下調基因88個。其中TNFAIP8L2和TRIM67表達上調,CXCL2、EGF、NOX1、CCL28、FABP2、FABP6、IL1RAP和CEBPB表達下調。研究發現,TNFAIP8L2、CCL28和IL1RAP參與MAPK信號通路的活化,從而調節炎癥反應的強度,其中TNFAIP8L2負調節Toll樣受體(TLR)和T細胞受體的功能[19-20],CCL28上調Bcl-2和β-catenin表達[21],IL1RAP輔助IL33發揮作用[22]。CXCL2和EGF主要與炎性細胞的募集以及炎癥反應中激活的免疫細胞類群相關[23-24]。CEBPB通過促進microRNA-145來活化DUSP6,從而加劇腸道炎癥[25]。上述差異基因的功能作用主要聚焦于免疫與炎癥,其中多個基因功能與MAPK信號通路關系密切,KEGG通路差異富集分析也表明,MAPK信號通路在香砂六君子湯治療ETEC致斷奶仔豬腹瀉中發揮關鍵作用。

ETEC除了直接引起斷奶仔豬腹瀉外,同時會影響斷奶仔豬腸道菌群組成,對腹瀉的發生也有重要影響[25-26]。腸道菌群是與宿主最大的共生生態系統,在維持腸道穩態方面發揮著重要作用[27]。在本研究中,NMDS分析結果顯示,ETEC攻毒后腸道菌群Beta多樣性發生明顯改變,在香砂六君子湯治療后腸道菌群Beta多樣性再次改變并偏向對照組,表明香砂六君子湯可緩解ETEC導致菌群Beta多樣性變化。具體而言,ETEC感染組仔豬腸道菌群中的厚壁菌門豐度急劇下降,而變形菌門豐度上升,香砂六君子湯能有效逆轉這種變化。研究表明,變形菌門在正常腸道菌群結構中占比較低,且多數為致病菌,其異常升高標志著腸道菌群失調[28-29]。在屬水平上,ETEC感染組仔豬乳酸菌屬豐度下降,志賀菌屬豐度上調,香砂六君子湯能有效逆轉這種變化。乳酸菌屬成員大都屬于有益菌,在抑制致病菌,防止細胞凋亡,增強腸道屏障功能中發揮作用[30-31],志賀菌屬成員是與大腸桿菌密切相關的腹瀉病原體,長期以來是全球重要的公共衛生問題的罪魁禍首[32-33]?；贙EGG信號通路的菌群結構差異功能預測發現脂多糖合成,生物素代謝,膽汁酸合成等信號通路差異顯著。研究發現,腸道菌群差異導致生物素缺乏可導致炎癥性腸病表型的腸道炎癥[34-35],膽汁酸可活化MAPK(包括ERK和p38 MAPK)信號通路,從而參與炎癥反應的調控[36-37]。

結合轉錄組學和微生物組學分析結果可知,MAPK信號通路在香砂六君子湯對ETEC致斷奶仔豬腹瀉中發揮了重要作用。MAPK信號通路被證明在腸道炎性損傷中扮演著重要的角色[38]。MAPK信號通路通過p38、ERK和JNK的三個級聯激活轉錄因子C-fos和C-Jun,并促進它們轉移到細胞核中形成轉錄因子AP-1并調節IL-6和TNF-α等炎性因子的轉錄,最終誘發腸道炎癥[39-40]。本研究發現ETEC攻毒后JNK和p38 MAPK信號通路被激活,香砂六君子湯則能有效抑制ERK和p38 MAPK的活化,表明香砂六君子湯可通過抑制MAPK信號通路抑制ETEC誘導的斷奶仔豬腸道炎癥。

4 結 論

ETEC感染可誘發斷奶仔豬腹瀉,破壞回腸組織結構,抑制回腸發育,同時能引起腸道菌群紊亂,降低有益菌豐度,并通過激活MAPK信號通路引起腸道炎性損傷;香砂六君子湯可有效緩解ETEC誘導的斷奶仔豬腹瀉,提高腸道菌群中有益菌的豐度,逆轉ETEC誘發的菌群結構的改變,并可通過抑制MAPK信號通路的激活,從而緩解ETEC誘導的斷奶仔豬腸道炎性損傷。