喬 寬,王路陽,王艷飛,張云鮮,時長旭
蒙牛乳業(焦作)有限公司,河南焦作 454100
黃曲霉毒素(AFT)是黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產生的雙呋喃環類毒素。其衍生物有約20 種,分別命名為B1、B2、G1、G2、M1、M2、GM、P1、Q1、毒醇等。其中B1的毒性最大,致癌性最強。動物食用黃曲霉毒素污染的飼料后,在肝臟、腎臟、肌肉、血液、乳汁及蛋品中可測出極微量毒素[1]。黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)是動物攝入黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)后在體內經羥基化形成的代謝產物,毒性僅次于AFB1,WHO將其列為ⅡB類致癌物。AFM1主要存在于動物的乳汁、腎臟、肝臟、蛋、肉和尿中,以乳中最常見。牛乳及其制品是易受黃曲霉毒素污染的食品之一[2,3]。若把發霉谷物作為飼料飼喂動物,其中的黃曲霉毒素在24 h之后就能進入乳中。黃曲霉毒素被動物食用后,一部分會蓄積在體內,另外一部分會轉化到乳汁和尿液中,轉化率一般為3.45%~11.39%,排出AFM1的量為AFB1攝入量的1%~3%。黃曲霉毒素M1進入人或動物體內后,除抑制DNA、RNA合成外,也抑制肝臟蛋白質合成,導致人體中毒。其危害主要表現在3 個方面:一是損害組織器官;二是致癌、致畸、致突變,引發動物及人類的肝癌、腎癌和胃癌等;三是抑制免疫機能。其毒性是氰化鉀的10倍,砒霜的68 倍,主要危害部位是肝臟。我國規定生牛乳中黃曲霉毒素M1含量不得超過0.5 μg/kg[4]。近年來,由于國內外乳品安全問題,作為乳品中廣泛存在的一類劇毒物——黃曲霉毒素越發引起關注。黃曲霉毒素具有強烈致癌性、致畸性及誘變性,已被證實可對人和動物健康造成極大傷害,牛乳中以其代謝產物黃曲霉毒素M1最常見。
本文闡述牛乳中黃曲霉毒素M1的來源與危害,并重點介紹2 種檢測方法的對比分析。當前,我國檢測機構針對生牛乳中AFM1檢測設備有很多種,涉及檢測原理主要有同位素稀釋液相色譜—串聯質譜法、高效液相色譜法、酶聯免疫吸附篩查法、膠體金法等。在AFM1檢測中根據不同需求,選擇不同設備和方法檢測,對檢測效率至關重要,因此,本文通過試驗對酶聯免疫吸附篩查法、膠體金法對生牛乳中AFM1的進行對比分析,旨在為乳品企業選擇牛乳中AFM1檢測方法提供參考。
酶標儀ELx800,美國伯騰儀器有限公司生產;膠體金讀數儀OTplus-Ⅱ,北京陸橋技術股份有限公司生產;ME204E/02電子天平,梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司生產;高速冷凍離心機Neofuge15R,上海力申科學儀器有限公司生產;振蕩器MS3 basic,德國IKA Works GmbH & Co.KG生產;保鮮柜LSC-600K,浙江星星冷鏈集成股份有限公司生產;黃曲霉毒素M1靈敏檢測試劑盒,丹麥普格生物技術股份有限公司生產;黃曲霉毒素M1金標快速檢測條,北京陸橋技術股份有限公司生產;去離子水。
1.2.1 酶標儀
吸取1.0 mL液體生乳樣品于離心管中,2~8 ℃、3 000 r/min離心10 min,去除脂肪層,吸取100 L脫脂牛奶樣品進行檢測。
1.2.2 膠體金讀數儀
生乳樣品回溫至20~25 ℃?;靹蚝笾苯訖z測。
1.3.1 酶標儀檢測原理
該產品基于競爭性酶聯免疫吸附測定原理。酶標板微孔包被有AFM1特異性抗體。AFM1標準品和待測樣品加入酶標微孔中,若AFM1存在,溶液中AFM1會與包被的抗體偶聯。未偶聯的AFM1將在洗滌步驟中洗去。之后將AFM1-HRP酶結合物(檢測溶液)加入酶標板微孔中。AFM1-HRP酶結合物與還未被標準品或樣品中AFM1占據的抗體結合部位偶聯。檢測溶液中所有未偶聯的AFM1-HRP酶結合物將在洗滌步驟中洗去。將顯色底物加入微孔中,與檢測出的抗體逐漸形成藍色絡合物。顯色過程在加入酸后停止,并將生成的最終物質變成黃色。450 nm下測定吸光值,有色絡合物的光強度與樣品、標準品中AFM1濃度間接成比例。
1.3.2 膠體金讀數儀檢測原理
應用競爭性免疫層析檢測原理,通過受檢樣品中AFM1與固定在檢測線上的AFM1競爭結合標記有膠體金顆粒的抗體,達到抑制檢測線顯色效果。
1.4.1 酶標儀
(1)使用前將所有試劑恢復至20~25 ℃,將所需數量的板條固定在微孔板架上,記錄標準品和樣品位置。
(2)將100 μL標準品或樣品加入對應微孔中,封板,搖板30 s,室溫下溫育45 min。
(3)將孔內液體甩干,在吸水紙上拍干,加入稀釋后的洗滌液250 μL/孔到微孔中,重復洗滌4 次,每次間隔10 s。如使用自動洗板機,可預定洗板完成5次周期,用吸水紙拍干(拍干后未清除氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
(4)加入100 μL AFM1檢測溶液,封板,搖板30 s后,室溫下溫育15 min。
(5)重復步驟3,將孔內液體甩干,在吸水紙上拍干,加入稀釋后的洗滌液250 μL/孔到微孔中,重復洗滌4 次,每次間隔10 s。如使用自動洗板機,可預定洗板完成5 次周期,用吸水紙拍干(拍干后未清除氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
(6)加入100 μL TMB基底,封板,搖板30 s后,于室溫下暗處避光溫育15 min。
(7)移去封板膜,在每個微孔中加入100 μL終止液,搖板,設定酶標儀于450 nm處(在5 min內讀完數據)測定每孔OD值。用spline曲線進行計算。
1.4.2 膠體金讀數儀
(1)試驗前請將試紙條和待測樣本恢復至20~25 ℃。
(2)用移液器移取200 μL待測生乳樣品于微孔中,反復吹打直至微孔中紅色試劑充分溶解混勻后,將其放置于(40±1)℃溫育器上溫育3 min。
(3)將試紙條插入微孔中,(40±1)℃溫育器上繼續溫育7 min,溫育結束后取出試紙條,去除下端樣品墊,判讀結果。
將10 個AFM1定性檢測為陽性的生乳樣本,分別用酶標儀和膠體金讀數儀檢測,其中酶標儀檢測采用加標回收率方法,膠體金讀數儀檢測采用陽性質控樣方法,按照正常試驗步驟進行前處理和檢測。2 種方法檢測結果見表1、表2。其中表1的本底樣為不含待檢物質的復原乳,表2的本底樣為不含待檢物質的生牛乳。
表1 酶標儀檢測樣本數據結果
表2 膠體金讀數儀檢測樣本數據結果
根據《牛乳中黃曲霉毒素M1的快速檢測 雙流向酶聯免疫法》(NY/T 1664—2008)、《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)、《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素M族的測定》(GB 5009.24—2016)、《商品化食品檢測試劑盒評價方法》(SN/T 2775—2011),以及表1、表2數據可知,酶標儀檢測和膠體金讀數儀檢測均滿足檢測要求(其中膠體金讀數儀的結果報出只有陰性或陽性的定性結果),酶標儀檢測方法的回收率和膠體金讀數儀檢測方法精密度均達標[5]。
對2 種設備在單位樣品檢驗時間、費用、操作等方面進行綜合比較,結果見表3。2 種檢測設備各有優劣,檢測機構、企業或檢驗人員可綜合考量自身不同需求和環境、樣品量等因素,選擇最合適設備進行檢驗。
表3 酶標儀與膠體金讀數儀檢測結果比較
本文主要對酶標儀、膠體金讀數儀檢測牛乳中黃曲霉毒素M1的操作過程和檢測結果對比分析。從操作過程看,酶標儀檢測操作過程相對復雜,所需耗材成本較高,因其試劑較多,操作暴露風險較大,有安全隱患,但快速、靈敏、對樣品純度要求不高,特別適用于大批量樣品檢測。由于需要酶標儀和熟練操作人員,不適合現場快速檢測[6]。膠體金讀數儀操作較簡單,所用耗材較少,檢測過程較安全,檢測速度較快,人員水平要求較低。從檢測結果看,酶標儀、膠體金讀數儀檢測方法均滿足檢測要求。酶標儀檢測方法的回收率、膠體金讀數儀檢測方法精密度均達標。酶標儀檢測結果較準確,適合作為定性初篩陽性樣品的再次定量驗證。膠體金讀數儀檢測速度較快,但無法定量檢測,較適用于快速定性檢測。實際應用中,2 種方法可配合使用,靈活運用設備優勢,高效率完成工作。