電針預處理抑制腦缺血后神經膠質細胞縫隙連接通訊功能及其作用機制

邢學良,曲陽,辛貴樂,周海純

(1.黑龍江中醫藥大學;2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院;3.黑龍江中醫藥大學附屬第四醫院,黑龍江 哈爾濱 150001)

腦缺血指由于腦血管病變或其他原因導致腦部血流量減少,使腦組織缺乏足夠的氧和營養,引起腦功能障礙或損傷的一種病理狀態[1]。神經膠質細胞之間通過縫隙連接形成功能網絡,實現物質和信息的交換[2]?？p隙連接是一種由兩個半通道組成的細胞間連接結構,在正常情況下,縫隙連接對維持細胞內穩態和組織功能有重要作用[3]。然而,在一些病理情況下,如缺血、創傷、感染等,縫隙連接可能發生異常改變,引起細胞內外離子與小分子平衡失調,從而加重細胞損傷或死亡[4]。研究[5]發現,縫隙連接通訊在腦缺血后星形膠質細胞的活化及血管反應中發揮重要作用。因此,調控縫隙連接通訊功能是防治腦缺血的有效策略。

研究[6]表明,藥物、高壓氧、亞低溫等預處理方式都能誘導腦缺血耐受現象,但上述預處理措施仍存在一定局限性[7]。電針是一種利用微弱的電流刺激針刺腧穴以防治疾病的中醫療法,臨床可操作性強,應用前景廣闊。前期預實驗發現,電針預處理可誘導腦缺血耐受,降低腦缺血區皮層細胞凋亡及炎癥反應。本研究旨在探討電針預處理對大鼠局灶性腦缺血后神經膠質細胞縫隙連接通訊功能的影響及其作用機制,以期探尋腦缺血防治的新靶點,為電針作為腦缺血的防治措施提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取96只成年雄性大鼠,體重220～250 g,飼養于標準SPF級鼠房的鼠籠內,溫度22～24 ℃,濕度50%,每6只大鼠飼養于一個鼠籠中;適應性喂養1周,在此期間大鼠可以自由進食和飲水,每日12 h明暗交替光照。本實驗方案已獲黑龍江中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準(ZHY-L-2022015)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要儀器 MSZ25熒光顯微鏡(日本尼康)、CRYOCUT-1800冰凍切片機(德國徠卡)、JW-3021HR 高速冷凍離心機(安徽嘉文)、TXDRB恒溫加熱板(湖北天鑫)、Western blots蛋白電泳儀(美國/伯樂)、VE-186 轉膜儀(上海天能)、SDZ-III 電針儀(蘇州華佗)。

1.2.2 主要試劑 生理鹽水、氯胺酮(人福醫藥集團股份公司)、PVDF膜(美國西格瑪奧德里奇公司)、Trizol、RIPA裂解液及BCA測定試劑盒(美國賽默飛世爾科技公司)、Western blot 檢測試劑盒(美國/伯樂)、縫隙連接通訊阻滯抑制劑CBX(四川省維克奇生物科技有限公司)。山羊抗兔二抗(貨號ab6721,Abcam,英國)。見表1。

表1 特異性一抗及內參的種類、濃度、貨號、廠家

1.3 方法

1.3.1 大鼠分組及MCAO模型構建 (1)實驗大鼠分組：假手術組(A組)、大腦中動脈閉塞模型(MCAO)組(B組)、電針預處理+MCAO組(C組)、縫隙連接抑制劑甘珀酸(CBX)+MCAO組(D組),每組各24只。A組大鼠不進行MCAO模型構建。B組大鼠僅接受MCAO模型構建;C組大鼠于電針治療3周后,接受MCAO模型構建;D組大鼠于術前2 h向大鼠側腦室注射10 μL濃度為5 μg/μL的CBX,接受MCAO模型構建。(2)電針預處理方法：選取大鼠百會穴,45 °進針,深度2 mm,連接電針治療儀,正極接百會穴,負極夾在大鼠耳朵上,選取疏密波,頻率、刺激強度分別設置2/15 Hz、1 mA,刺激30 min,每周治療5 d,1次/d。(3)CBX注射方法：將大鼠在鼠腦立體定位儀上固定,將其切開頭皮,暴露項骨找到Bregma點,保持原點和Bregma點對齊,緩慢移動定位儀,向后0.8 mm旁開1.4 mm處鉆孔,直至鉆破顱骨,固定微量注射器,自項骨起,進針深度3.8 mm,進針正確指回抽可見清亮液體。將CBX緩慢注射后,停留約15 min,將枕頭緩慢拔出后對頭皮進行縫合。(4)MCAO大鼠模型構建方法：對大鼠進行術前12 h禁食處理,采用水合氯醛進行全身麻醉,同時保持其體溫(37.0±0.5)℃;在消毒頸部正中進行切口,露出頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈,將頸總動脈和頸外動脈進行結扎,于頸總動脈分叉下方做一小切口,向頸內動脈內插入3.0尼龍單纖絲線(一頭末端烤成圓頭),深度17～18 mm;采用激光多普勒流量計,觀測并確認大鼠的腦血流阻斷情況。模型構建成功的標志是中腦動脈腦血流下降至基線值的30%以下;對頸內動脈進行結扎,并等待120 min以形成腦缺血,然后移除尼龍線以使血流恢復。

1.3.2 取材 分別于再灌注12 h、再灌注3 d進行取材,每次每組取12只大鼠?？焖贁囝^取腦,分離右側大腦皮層,置于冰箱-80 ℃凍存備用。

1.3.3 免疫熒光雙標法觀察星形膠質細胞上Cx43表達情況 采用冰凍切片機將大鼠腦組織制成10 μm的連續切片,貼附于玻片上(已采用多聚賴氨酸包被過)。放置3 min晾干,保存于-80 ℃冰箱待測。采用SP法雙重染色,進行Cx43、GFAP雙標,觀察Cx43在星形膠質細胞上的表達量及表達位置的變化。具體方法參照試劑盒說明。采用500 mL/L的甘油封片,于熒光顯微鏡下觀察并拍攝照片。設置陰性對照,采用山羊血清稀釋液替代一抗,二抗與實驗組相同。

1.3.4 Western blot檢測缺血半暗區神經膠質細胞縫隙連接通訊相關蛋白表達情況 根據試劑盒說明書進行蛋白提取和濃度測定。使用預冷蛋白提取液對樣本進行稀釋后,保存在-80 ℃冰箱中。從每個樣本中取等量蛋白,進行SDS-PAGE以將蛋白分離后,將蛋白轉膜,加入一抗、二抗進行免疫反應,DAB染色反應,將完成染色并干燥的膜拍照,并分析結果。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠星形膠質細胞上Cx43表達情況

Cx43主要在星形膠質細胞膜表面與突起部位表達。再灌注12 h,B組、C組、D組Cx43、GFAP熒光強度均高于A組(P<0.05);B組、C組、D組各組間比較,差異無統計學意義(P>0.05)。再灌注3 d,B組、C組、D組Cx43、GFAP熒光強度均高于A組(P<0.05);C組、D組Cx43、GFAP熒光強度均低于B組(P<0.05);C組與D組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1及圖2。

2.2 各組大鼠缺血半暗區神經膠質細胞縫隙連接通訊相關蛋白表達情況

再灌注12 h,B組、C組、D組Cx43、p-Cx43-S368、p-Cx43-S262、GFAP、PKC、AT1R均高于A組(P<0.05),NeuN、eNOS均低于A組(P<0.05);B組、C組、D組各組間比較,差異無統計學意義(P>0.05)。再灌注3 d,B組、C組、D組Cx43、p-Cx43-S368、p-Cx43- S262、GFAP、PKC、AT1R均高于A組(P<0.05),NeuN、eNOS均低于A組(P<0.05);C組、D組Cx43、p-Cx43-S368、p-Cx43-S262、GFAP、PKC、AT1R 均低于B組(P<0.05),NeuN、eNOS均高于B組(P<0.05);C組與D組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

3 討論

大量研究證實[8-10],電針百會穴對腦缺血后神經元具有保護作用,但其作用機制尚未完全明確。星形膠質細胞主要功能包括支持神經元存活、維持中樞神經系統穩態等[11]。相鄰星形細胞之間、相鄰腳板之間存在縫隙連接?？p隙連接通訊是指細胞間縫隙連接通道,允許第二信使、離子和其他分子量<1.5KDa 的分子通過,直接介導細胞間的信息交流[12]。Cx43是星形膠質細胞上最常見的縫隙連接蛋白,其在維持神經組織的組織穩定及物質調控方面發揮重要作用。在腦缺血再灌注損傷中,Cx43的作用及其影響仍然存在爭議。

部分研究[13-15]認為Cx43具有神經保護作用,如任文鑫等[13]以24只雄性SD大鼠為實驗對象,發現缺血再灌注組大鼠相較假手術組Cx43表達下調、分布紊亂;另有研究認為Cx43具有作用促進凋亡的作用,李保龍等[14]指出,MCAO模型組大鼠缺血側皮層腦組織中Cx43表達水平明顯高于假手術組;Zhang等[15]通過構建小鼠缺氧/復氧體外模型發現,缺氧/復氧損傷導致小膠質細胞活化增加,Cx43水平明顯增加,而丙泊酚治療可通過下調膠質細胞中Cx43水平而降低MCAO大鼠梗死體積與細胞凋亡程度。本研究中,再灌注12 h,B組、C組、D組Cx43、GFAP熒光強度及Cx43、p-Cx43-S368、p-Cx43- S262、GFAP、PKC、AT1R蛋白表達水平均高于A組(P<0.05),NeuN、eNOS蛋白表達水平均低于A組(P<0.05),提示MCAO模型構建成功后,縫隙連接通訊功能異?；钴S,影響星形膠質細胞中Cx43表達;而再灌注3 d時上述差異更為明顯,這可能是由于隨著時間的推移,大鼠缺血灶會逐漸擴大,縫隙連接通訊將梗死中心區的死亡信號逐漸傳遞至梗死周邊區,進一步影響上述縫隙連接通訊相關蛋白表達水平。進一步比較發現,再灌注3 d,C組、D組Cx43、GFAP熒光強度及Cx43、p-Cx43-S368、p-Cx43- S262、GFAP、PKC、AT1R蛋白表達水平均低于B組(P<0.05),NeuN、eNOS表達水平均高于B組(P<0.05),提示電針預處理可能通過調節上述蛋白的表達,發揮了腦保護作用,推測其作用機制可能由于電針百會穴預處理通過調控細胞間縫隙連接通訊功能,影響Cx43等縫隙連接通訊相關蛋白分子通過,從而改善腦缺血/再灌注大鼠神經功能缺損,減輕缺血側皮質區病理損傷,縮小腦梗死體積,抑制缺血區細胞凋亡及腦缺血/再灌注期間炎癥級聯反應,發揮神經保護作用。魏靜靜[16]以MCAO大鼠為實驗對象,提出電針百會穴有利于改善其神經功能缺損癥狀,具有腦保護作用,并推測其作用機制可能與調節Cx43的表達相關,與本文研究結論相似。

綜上,電針預處理可能通過調節神經膠質細胞縫隙連接通訊相關蛋白的表達,促進腦缺血后神經血管重構,發揮腦保護作用。