迷迭香酸的生物學功能及其在畜禽生產中的應用

李曉鵬 劉云龍 蔣林樹 屠 焰*

(1.中國農業科學院飼料研究所,農業農村部飼料生物技術重點實驗室,北京 100081;2.北京農學院動物科學技術學院,奶牛營養學北京市重點實驗室,北京 102206)

在飼料禁抗的大背景下[1],尋找綠色、安全和高效的抗生素替代品成為畜牧業發展的重要環節,植物提取物由于天然、無毒和生物學功能廣泛等特點備受關注[2]。迷迭香酸是一種從紫草科、唇形科和葫蘆科等植物中提取出來的天然酚酸類化合物[3],尤以紫草科和唇形科植物中含量較高,具有廣泛的藥用價值和食用價值。研究表明,迷迭香酸具有抗氧化、抗炎和抗菌等作用[4],且抗氧化能力強于綠原酸、咖啡酸和肉桂酸等多種酚酸類化合物[5]。在一些動物試驗中,迷迭香酸表現出對畜禽抗氧化能力、機體健康以及生長性能的改善作用,對動物疾病的預防和治療有一定潛力[6]。但目前的研究主要集中于模型動物上,在畜禽方面的研究較少。近年來,現代分子生物學技術和分析技術的發展促進了天然植物中生物活性物質作用途徑的研究[7],本文通過介紹迷迭香酸理化性質與在機體內的吸收代謝,解析迷迭香酸結構和與功能關系,綜述迷迭香酸發揮抗氧化、抗炎和抗菌等生物學功能的相關作用途徑以及在畜禽生產中的應用前景,旨在為迷迭香酸在新型飼料添加劑上的開發利用提供參考依據,推動植物功能組分在畜禽生產中的應用。

1 迷迭香酸的理化性質與吸收代謝

1.1 迷迭香酸的理化性質

迷迭香酸于1958年由意大利2位化學家Scarpati和Orientes首次分離得到,并因其從迷迭香中分離提取而得名[8]。迷迭香酸在唇形科和紫草科植物中含量較高,但是在不同季節以及植物的不同部位,迷迭香酸的含量有所差別,通?；ㄖ泻扛哂谌~片[9]。

迷迭香酸在植物體內由咖啡酸和3,4-二羥基苯基乳酸縮合而成,化學名稱為[R(E)]α-[[3-(3,4-二羥基苯基)-1-氧代-2-丙烯基]氧基]-3,4-二羥基苯丙酸,化學式為C18H16O8,易溶于水、甲醇及乙醇的水溶液,不溶于無水乙醇、乙醚等有機溶劑,具有迷迭香特殊草本氣味[10],其結構式如圖1[11]所示。迷迭香酸具有較好的穩定性,pH和溫度這2個條件對其穩定性的影響很小,但光照和鈣離子(Ca2+)、鎂離子(Mg2+)這2種金屬離子對其穩定性危害較大,這一特性很大程度上限制了其在生物體內的利用率[12]。

圖1 迷迭香酸的化學結構式

常見的迷迭香酸提取方法包括煎煮法、溶劑提取法、超聲波提取法和超臨界萃取法等,有研究采用離子液體作為溶劑提取紫蘇種子中的迷迭香酸,在離子液體濃度為5%、提取時間為50 s、微波刺激功率為350 W時,迷迭香酸得率為4.0 mg/g,但離子液體成本較高且具有生物不可降解性[13]。亞臨界水提法是利用水的極性變化萃取化合物,具有溶劑殘留少、節能,綠色環保的特點。閆林林等[14]利用亞臨界水提法,在提取溫度為163 ℃、提取時間為30 min、液料比為41 mL/g時,紫蘇籽粕中迷迭香酸得率為4.91 mg/g。劉根才等[15]利用超聲提取法,在乙醇體積分數為39%、料液比為1∶9、超聲時間為63 min的條件下,紫蘇葉中迷迭香酸提取率達到0.61%。

1.2 迷迭香酸的吸收代謝

一般來說,胃的環境會極大地影響機體對所攝入酚類化合物的吸收,相比之下,腸道的環境對其消化影響較小。迷迭香酸通過食道進入體內后,在胃腸道的吸收率小于其攝入量的1%[16],其需要首先經過腸道微生物群代謝[17],由微生物酯酶將其降解為結構較為簡單的酚酸[18],隨后經過硫酸酯化、甲基化、葡萄糖結合和葡萄糖醛酸等多條途徑代謝為其他產物,最后通過腸細胞的細胞旁途徑進行吸收[19]。迷迭香酸裂解后產生的咖啡酸片段會代謝為阿魏酸[20],可發生羥基的進一步硫酸化和甲氧基化,也可經過羥基化、二羥基化和甲氧基化生成2,3,4-三甲氧基肉桂酸以及間香豆酸[21],3,4-二羥基苯基乳酸會代謝產生苯乙酸[22]、原兒茶酸[23],原兒茶酸進一步代謝為對羥基苯甲酸或香草酸等[24]。迷迭香酸及其代謝產物被吸收后在腎臟中含量最高,其次是肺臟、脾臟和肝臟[25],在骨骼和肌肉中也能少量被檢測到[26]。迷迭香酸大部分代謝物在攝入后6 h內會被排出,主要途徑是經腎臟隨同尿液排泄以及經肝臟隨同膽汁排泄[26-27],在尿液中可以檢測到咖啡酸、阿魏酸、2,3,4-三甲氧基肉桂酸、間香豆酸、對羥基苯甲酸和香草酸以游離和共軛的形式存在[23]。

2 迷迭香酸的生物學功能及作用機制

2.1 抗氧化功能及作用機制

迷迭香酸結構中的鄰二酚羥基使其具有良好的抗氧化作用,在體內可以通過脫氫的方式清除自由基。Sevgi等[5]在評估迷迭香酸、咖啡酸和綠原酸等十種不同酚酸的抗氧化和DNA損傷保護能力時發現,0.1 mg/mL的迷迭香酸對2,2-二苯基-1-苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)自由基的清除能力最高,達到91.50%。在清除自由基的過程中,鄰位羥基上的氫原子不斷脫離使其形成半醌或醌的結構,從而達到抗氧化的作用[28],清除過程如圖2[29]所示。氫離子脫離后可形成很強的分子內氫鍵使得反應更容易發生,迷迭香酸結構中C3位的共軛雙鍵可以分散電子云,對其抗氧化作用也有增強效果[30]。

圖2 迷迭香酸清除自由基的過程

迷迭香酸可以通過清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)和增加抗氧化分子實現抗氧化作用。Fernando等[31]研究發現,在過氧化氫(H2O2)處理的人角質細胞中,2.5 μmol/L的迷迭香酸清除了細胞內60%的ROS,其通過調節細胞抗氧化系統,減輕了H2O2誘導的氧化損傷。細胞色素P450 2E1(cytochrome P450 2E1,CYP2E1)會激活細胞內質網產生ROS,因此對其抑制可能有助于減輕ROS誘導的損傷。Hasanein等[32]通過對乙酰氨基酚誘導的大鼠氧化損傷和肝毒性試驗表明,口服迷迭香酸(100 mg/kg)可抑制肝臟CYP2E1活性,同時通過提高谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量和增強谷胱甘肽轉移酶活性來降低促氧化劑含量和增強抗氧化能力。此外,在研究不同濃度(20、40和80 μmol/L)迷迭香酸對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的外周血單核細胞氧化損傷和炎癥的影響時發現,迷迭香酸通過抑制脂質過氧化以及一氧化氮生成來減少氧化應激,并且可以增強谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性[33]。核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)作為轉錄因子在抗氧化應激系統中起到關鍵作用,可以調節多種抗氧化酶基因的表達.在重鉻酸鉀刺激大鼠模型試驗中,觀察到迷迭香酸(25 mg/kg)灌胃60 d對大鼠有保護作用,其通過上調Nrf2信號通路減輕了肝臟和腎臟組織的氧化損傷,并且與模型組相比,迷迭香酸處理使得GSH含量顯著升高,氧化產物丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量顯著降低[34]。在豬的飼喂試驗中也有同樣的發現,在豬飼糧中添加20 mg/kg迷迭香酸和300 mg/kg橙皮苷飼喂90 d后發現,迷迭香酸和橙皮苷組合顯著提高了豬盲腸的總抗氧化能力及SOD活性,并且增強了Nrf2的mRNA相對表達量[35]。另外,用氧化鋅(zinc oxide,ZnO)/殼聚糖納米顆粒包裹迷迭香酸,處理甲基苯丙胺(methamphetamine,MA)誘導氧化應激損傷的斑馬魚后,發現15 mg迷迭香酸能有效抑制胱天蛋白酶3(Caspase-3,CASP3)mRNA水平的升高,顯著降低了MA誘導的氧化應激損傷[36]。綜上所述,迷迭香酸可以通過清除ROS、增加抗氧化因子、降低促氧化化合物水平以及調節信號通路等途徑來減少氧化應激的產生,其自身化學結構是發揮抗氧化活性的主要原因。

2.2 抗炎功能及作用機制

迷迭香酸在炎癥部位發生補體激活時表現出優異的抗炎活性,它能夠與活性補體物質C3b共價結合從而抑制補體活性,繼而抑制炎癥反應[37]。核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的激活會誘導多種促炎細胞因子以及酶生成,迷迭香酸可以通過抑制受體識別和信號轉導、磷酸化活化以及促炎細胞因子基因的轉錄等途徑抑制NF-κB來發揮其抗炎活性(圖3)[38-40]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)是一種細胞膜受體,作為Toll樣受體和模式識別受體的一部分可誘導NF-κB活化引發炎癥反應[41]。Ma等[37]分別用5、10和20 μg/mL的迷迭香酸處理大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系細胞24 h后發現,迷迭香酸通過抑制TLR4/NF-κB信號通路,降低腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)表達,從而降低LPS誘導的炎癥反應。NF-κB的活化首先需要其進行磷酸化過程[42],在LPS誘導的小鼠急性肺損傷模型中,迷迭香酸、綠原酸和異嗪皮啶的混合物可以抑制細胞中NF-κB的磷酸化,從而降低炎癥反應,同時還可以降低一氧化氮和促炎因子含量[38]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)是一種位于細胞核中的蛋白質,主要協調基因轉錄,可以激活促炎細胞因子基因表達[43]。Lin等[39]研究發現,大鼠口服給藥2 g/kg迷迭香酸4周后,抑制了HMGB1/TLR4軸信號通路,降低了NF-κB的激活和促炎細胞因子的產生,從而緩解了大鼠的肝臟炎癥。

RosA:迷迭香酸 rosmarinic acid;TLR4:Toll樣受體4 Toll-like receptor 4;Signal transduction:信號轉導;NF-κB pathway:核因子-κB通路 nuclear factor kappa-B pathway;P;磷酸化 phosphorylation;Inhibition:抑制;HMGB1:高遷移率族蛋白B1 high mobility group box-1 protein;Transcription of genes:基因轉錄;COX:環氧化酶 cyclooxygenase;STAT3:信號轉導和轉錄激活因子3 signal transducer and activator of transcription 3;IL-1β:白細胞介素-1β interleukin-1β;IL-6:白細胞介素-6 interleukin-6;Anti-inflammatory:抗炎;NLRP3:NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3 NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3。

迷迭香酸還可以作用于不同的酶以達到抗炎目的,其主要介質是環氧化酶。50 mg/(kg·d)迷迭香酸對大鼠連續作用60 d后,能夠通過抑制環氧化酶表達和降低前列腺素含量,顯著抑制脂質過氧化水平和炎癥反應[44]。通過大鼠體內試驗發現,60 mg/kg的迷迭香酸可顯著降低大鼠結腸炎的嚴重程度,其作用機制與信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)有關,通過抑制STAT3的激活可減少小鼠結腸中IL-1β、IL-6的產生以及環氧化酶的表達,從而達到抑制細胞炎癥的目的[45]。迷迭香酸也可以通過抑制炎性小體的激活來發揮抗炎活性,NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)與凋亡相關斑點樣蛋白、半胱天冬酶-1前體組合成的NLRP3炎性小體復合物會被迷迭香酸抑制,使用100 mg/kg的迷迭香酸對瑞士白化小鼠灌胃2 d后發現,迷迭香酸通過阻斷半胱氨酸蛋白酶-1及其下游信號分子IL-1β抑制了NLRP3信號通路的激活,NF-κB的活化和環氧化酶蛋白的表達也被抑制,有效預防了NLRP3參與的急性腎損傷[46]。此外,由于體內氧化應激與炎癥反應是互相影響的,Nrf2作為在細胞抗氧化反應和炎癥反應中都起到重要調節作用的關鍵轉錄因子[47],迷迭香酸對其調控不止起到抗氧化作用,對炎癥反應也有較高的緩解效果,通過抗氧化作用影響機體炎癥平衡也是迷迭香酸發揮作用的一條重要途徑。

2.3 抗菌功能及作用機制

迷迭香酸在多項研究中表現出良好的抗菌活性,抑制細胞能量供應以及破壞細胞結構完整性是其對細菌作用的主要途徑。烯醇化酶是細菌體內一種參與糖代謝的關鍵糖酵解金屬酶,主要負責催化糖酵解過程中的2-磷酸甘油酸轉化為磷酸烯醇式丙酮酸,為后續氧化磷酸化提供底物支持,是糖酵解過程中的重要蛋白[48]。分子對接結果表明,迷迭香酸可以通過金屬-受體的相互作用與烯醇化酶的Mg2+結合,迷迭香酸的苯環也可以與氨基酸形成氫鍵抑制烯醇化酶的表達,影響細菌正常代謝和糖酵解,導致細菌生理活動的能量供應不足,從而抑制其生長[49]。Ivanov等[50]研究發現,迷迭香酸可以通過破壞細胞膜完整性及降低線粒體活性抑制真菌活性,0.1 mg/mL的迷迭香酸處理念珠菌后,由于細胞膜的通透性發生了改變,結晶紫的吸收率由15.8%上升到39.6%,線粒體的活性也降低了50%以上。迷迭香酸對動物細菌性腹瀉的主要病原菌大腸桿菌和沙門氏菌均有抑制作用,特別是大腸桿菌,可以通過破壞其細胞結構導致內容物質流出,阻礙其生長繁殖,同時抑制細胞磷脂雙分子層中鈉離子(Na+)/鉀離子(K+)-ATP酶的活性,導致Na+/K+平衡被破壞,迷迭香酸對大腸桿菌最低抑菌濃度和最低殺菌濃度分別為0.8和0.9 mg/mL[51]。此外,迷迭香酸還可以上調蛋白激酶1(putative kinase 1,PINK1)的mRNA和蛋白表達,促進泛素連接酶E3從細胞質匯集到線粒體并磷酸化,增強PINK1和泛素連接酶E3的相互作用及其在巨噬細胞的共定位,通過增強PINK1介導的線粒體自噬達到提高巨噬細胞抗菌免疫活性的目的[52]。

2.4 其他功能及作用機制

大量試驗證明,迷迭香酸有抗腫瘤、降血糖、保護神經和護肝的作用。迷迭香酸毒副作用較化療藥物小,具有調節炎癥和血管生成相關細胞因子分泌的作用,同時通過抑制異種移植微環境中NF-κB p65的表達,可以有效抑制腫瘤生長[53]。此外,迷迭香酸可以降低刺猬(hedgehog,Hh)信號通路相關基因和膠質瘤相關癌基因同源物1的表達,下調抗凋亡基因B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表達,上調促凋亡基因B細胞淋巴瘤-2相關X因子(Bcl-2-associated X protein,Bax)表達,通過抑制乳腺癌干細胞的活力和遷移發揮抗癌作用[54]。迷迭香酸對糖尿病大鼠有顯著降糖作用,120 mg/kg的迷迭香酸可以改善大鼠的葡萄糖利用和胰島素敏感性,而且作用效果具有劑量依賴性,其作用機制與肝臟中磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶表達的降低和骨骼肌中葡萄糖轉運蛋白-4表達的提高有關[55]。另外有研究證明,迷迭香酸可以通過降低黑質鐵水平和調節Bcl-2/Bax基因表達的比例,緩解氧化性神經毒素6-羥基多巴胺引起的細胞計數和紋狀體多巴胺含量嚴重降低,保護黑質多巴胺神經元免受6-羥基多巴胺的毒性作用[56]。在一些研究中,迷迭香酸表現出顯著的肝保護能力,10 mg/kg迷迭香酸可顯著減輕肝纖維化大鼠的纖維化程度,改善白蛋白、球蛋白、丙氨酸轉氨酶及谷氨酸轉氨酶等生化指標,下調肝臟轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和結締組織生長因子表達[57];20 mg/kg迷迭香酸除下調肝臟TGF-β1表達外,還可減輕肝膠原沉積,改善肝外膽汁淤積引起的肝臟炎癥[58]。

3 迷迭香酸及酚酸類化合物在畜禽生產中的應用

隨著禁止在畜禽飼料中使用抗生素、畜禽產業迅速發展以及人們對動物產品的需求不斷增加,開發更加綠色、安全的抗生素替代品成為畜牧業面臨的關鍵問題之一。植物提取物由于出色的抗氧化、抗炎以及抑菌等生物學功能,被視為一種創新且高效的飼料添加劑,在畜禽生產領域得以應用。植物提取物的應用可以顯著提升動物的生產性能、免疫能力和產品品質,展現出非?？捎^的應用前景。迷迭香酸作為一種優質的天然植物提取物功能組分,可以作為高效綠色的植物添加劑應用于畜牧生產中,但目前直接作用于畜禽生產的研究較少。

3.1 迷迭香酸在畜禽生產中的應用

迷迭香酸作為飼料添加劑時可以發揮其良好的抗氧化特性,對動物的抗氧化能力有一定提升效果。在育肥豬飼糧中添加200 mg/kg迷迭香酸可顯著提高血清中免疫球蛋白含量,以及提高血清、肝臟和肌肉中抗氧化酶的活性,降低MDA含量,增強機體的免疫和抗氧化能力,并且迷迭香酸能夠上調皮質脂肪和肝臟組織中脂肪分解相關基因的表達,下調脂肪合成相關基因的表達,進而改善脂肪代謝緩解脂肪沉積[59]。在白羽肉雞的試驗中也有同樣的結果,30 mg/kg的迷迭香酸可使白羽肉雞胸肌中抗氧化基因Nrf2的mRNA表達量顯著升高,MDA含量顯著下降,使得白羽肉雞抗氧化能力有所提高[60]。迷迭香酸的抗菌特性發揮在動物機體內,可以通過對動物腸道菌群的調節以及對病原微生物的抑制,對動物生產性能起到改善作用。雷銘康等[61]研究發現,飼糧中添加500 mg/kg迷迭香酸可以改善攻毒斷奶仔豬的結腸結構形態,調節結腸菌群組成,并且提高結腸食糜中類細菌代謝產物的含量,有助于維持結腸屏障功能,緩解斷奶仔豬腹瀉。在肉雞飼糧中分別添加40、80和160 mg/kg迷迭香酸發現,160 mg/kg的迷迭香酸能夠顯著降低堆型艾美耳球蟲攻毒肉雞糞便中卵囊數量、21日齡肝臟指數以及血清谷丙轉氨酶活性,顯著提高15～21日齡平均日增重,有效緩解堆型艾美耳球蟲感染引起的肉雞生長緩慢,并且提高其免疫性能[62]。

3.2 酚酸類化合物在畜禽生產中的應用

酚酸類化合物是一類主要含有氫原子、羧基和酚基的化合物,已在動物生產上驗證了具有多種生物學功能,除了抗氧化、抗炎及抑菌作用外,其對動物的消化道菌群、生產性能和機體健康等也表現出一定的改善作用。在斷奶仔豬飼糧中添加1 000 mg/kg的綠原酸,顯著提高了空腸和回腸黏膜二胺氧化酶活性,空腸黏膜轉化生長因子α含量有所升高,對腸上皮屏障功能產生了有益作用,同時飼糧中添加綠原酸會刺激細菌產生更多的短鏈脂肪酸,調節腸道pH,從而促進益生菌的生長[63]。張全宇[64]研究發現,在斷奶前期犢牛飼糧中添加1 g/kg的沒食子酸,顯著提高了犢牛的開食料采食量、平均日增重和營養物質消化率,對犢牛生長性能具有改善作用;此外,添加沒食子酸對瘤胃細菌群落有一定調節作用,提高了參與糖代謝的產乙酸糖發酵菌(Saccharofermentans)相對豐度,增強了瘤胃糖代謝能力。在蛋雞飼糧中分別添加10、15 mg/kg的釩以及600、1 000 mg/kg的茶多酚,飼喂8周后,飼喂茶多酚使得肝臟谷胱甘肽轉移酶和GPX活性顯著提高,提高了蛋雞肝臟抗氧化應激能力,并且茶多酚可防止釩對蛋雞造成的蛋清質量下降以及蛋殼顏色漂白[65]。在仔豬飼糧中添加0.1%由香芹酚、肉桂醛和百里香酚組成的復合精油,飼喂42 d后仔豬平均日增重顯著提高,同時復合精油改善了仔豬腸道屏障功能和腸道炎癥,提高了緊密連接蛋白mRNA表達量以及消化酶活性,對仔豬生產性能產生了諸多有益影響[66]。

綜上所述,迷迭香酸對動物機體炎癥、氧化應激以及病原微生物繁殖等可以發揮改善作用,而且作為酚酸類化合物在調節動物消化道微生物、機體健康及生產性能等方面具備很大的潛力,將來可以進行更加深入的研究來充分發揮其價值。

4 小結與展望

迷迭香酸具有多種生物學功能,不僅可以通過脫氫消除機體內異常增加的活性氧,調節抗氧化物水平以及抗氧化信號通路減少機體氧化應激的發生,還可以通過多條途徑抑制NF-κB信號通路,作用于不同的信號因子發揮抗炎作用,抑制細菌增殖以及保護肝臟,有利于機體健康。迷迭香酸在維持動物氧化應激-炎癥反應-免疫三方聯動效應穩定上體現出一定潛力,但到目前為止,迷迭香酸畜禽上的研究還較少,在不同動物體內發揮生理功能的分子機制以及在不同動物上的適宜添加量還有待進一步探究。此外,迷迭香酸在理化性質上還有易受Ca2+、Mg2+影響的特點,這為其在畜禽上的研究增加了許多困難和挑戰,今后可以圍繞分子對接、高通量篩序及結構性修飾等方面展開對迷迭香酸的研究[67]。迷迭香酸在動物體內的代謝產物種類繁多,深入且全面地掌握其作用途徑和機理與代謝產物的關系有利于迷迭香酸的開發以及精準飼喂。