不同大口黑鱸群體生長性能、肌肉營養成分、腸道形態結構及菌群組成的比較研究

黃仁善 鐘純怡 張 帝 強 俊,* 陶易凡 李 巖 董亞倫 路思琪 徐 跑,*

(1.南京農業大學無錫漁業學院,無錫 214128;2.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心,農業農村部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室,無錫 214081)

大口黑鱸(Micropterussalmoides),又名加州鱸,隸屬于鱸形目(Perciformes)、鱸亞目(Porcoidei)、太陽魚科(Cehtrachidae)、黑鱸屬(Micropterus)[1]。大口黑鱸由于具有養殖周期短、生長速度快、抗病能力強、肉質鮮嫩、無肌間刺以及營養豐富等優點,我國于1983年將大口黑鱸引入大陸[2],并且得到了非常成功的養殖推廣,使其備受消費者和養殖人員歡迎。據統計,2022年我國大口黑鱸養殖產量突破80萬t[3],大口黑鱸也成為我國重要的經濟性淡水養殖魚品種之一,被稱為中國的“第五大家魚”。我國大口黑鱸的主要養殖區域有廣東、江蘇、湖南、湖北和河南等地,所養殖的品種主要包括“優鱸3號”、“優鱸1號”和臺灣群體。經過多年的養殖,目前國內養殖的大口黑鱸群體的遺傳多樣性已顯著下降,種質退化嚴重[4]。

隨著營養消費的升級,人們更加偏向于購買營養價值高、味道鮮美的魚肉,而魚類肌肉中的脂肪酸如亞油酸、二十二碳六烯酸等,在改善魚肉口感、滿足人類營養需求以及預防疾病等方面發揮著不可或缺的作用[5]。研究表明,魚類肌肉營養成分組成與品系、遺傳、生長速度以及生活環境等因素有關[6]。目前對于魚類肌肉營養方面的研究多集中于改良飼料成分來提升肌肉品質[7-8]或對比不同養殖模式下魚類肌肉的營養差異[9-10],但對魚類不同群體的肌肉營養成分對比的研究較少。腸道作為魚類消化吸收的主要場所[11],其形態結構的完整性是營養物質消化吸收的前提條件和維持黏膜正常生理功能的重要保障[12]。魚類腸道內存在大量微生物,這些微生物與宿主之間存在復雜的相互作用,在魚體消化吸收、預防免疫等方面起到重要作用[13]。近年來,集約化養殖模式逐漸擴大,高密度養殖再加上使用大量植物性蛋白質原料等,使得養殖環境逐漸惡化,導致魚類腸道健康受到很大影響,這成為限制我國水產養殖業持續健康發展的短板之一,因此越來越多的研究開始關注腸道結構、腸道微生物等與魚類生長性能的關聯[14-17]。

本課題組于2020年從美國引進大口黑鱸北方亞種群體,并進行了群體遺傳多樣性分析,結果發現引進群體與目前國內主要養殖品種存在極顯著遺傳分化[4]。因此,本試驗以引進大口黑鱸北方亞種為父本與當地選育種群進行雜交,通過對“優鱸3號”、“優鱸1號”、臺灣群體以及雜交群體4個養殖群體在生長性能、肌肉營養成分、腸道形態結構以及菌群組成方面進行對比分析,以期為大口黑鱸良種選育和品種改良提供基礎資料和參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼養管理

1.2 試驗飼料

試驗所用飼料購自浙江某水產飼料股份有限公司。飼料顆粒大小隨飼養苗種規格變化而變化,飼料營養水平見表1。

表1 飼料營養水平(風干基礎)

1.3 樣品采集

養殖試驗結束后,禁食24 h后開始采樣。使用丁香酚(1∶1 000)對大口黑鱸進行深度麻醉后,記錄每個網箱內試驗魚的數量、體質量和體長;然后在每個群體隨機抽取15尾大口黑鱸,用消過毒的解剖刀剖離其背部肌肉,分別測量其肌肉重、內臟重和肝臟重,肌肉稱重后立即使用液氮冷凍,后轉入-80 ℃冰箱暫存,用于營養成分測定;另外在每個群體中隨機抽取10尾大口黑鱸,分別取其前腸(胃后3 cm)和后腸(肛門前5 cm),用10%福爾馬林固定,用于觀察腸道結構形態;最后在每個群體中隨機抽取6尾大口黑鱸,取其腸道內容物裝入2 mL凍存管中,用液氮速凍4 h后,放入-80 ℃暫存,用于檢測腸道微生物群落。

1.4 指標測定

1.4.1 生長性能指標測定

增重率(weight gain rate,WGR,%)=100×(Wt-W0)/W0;特定生長率(specific growth rate,SGR,%/d)=100×(lnWt-lnW0)/t;臟體比(viscerosomatic index,VSI,%)=100×Wv/Wf;肝體比(hepatosomatic index,HSI,%)=100×Wh/Wf;飼料系數(feed conversion rate,FCR)=F/(Wt-W0);肥滿度(condition factor,CF,g/cm3)=100×Wt/L3。

式中:W0為魚的平均初始體質量(g);Wt為魚的平均終末體質量(g);t為試驗的飼養天數(d);F為每尾魚的平均總攝食量(濕重,g);Wv為每尾魚的終末內臟重(g);Wh為每尾魚的終末肝臟重(g);Wf為魚的終末體質量(g);L為魚的終末體長(cm)。

1.4.2 肌肉營養成分測定

肌肉水分含量測定參考GB 5009.3—2016,粗灰分含量測定參考GB 5009.4—2016,粗蛋白質含量測定參考GB 5009.5—2016,粗脂肪含量測定參考GB 5009.6—2019,脂肪酸含量測定參考GB 5009.168—2016。

1.4.3 腸道形態結構指標測定

腸道組織在10%福爾馬林中固定1～2 d后,在各級乙醇脫水后再進行包埋和切片,晾干烘烤之后利用二甲苯和各級乙醇溶液脫蠟,最后進行染色和封片。切片制作完成后,通過Eclipse Ci-L拍照顯微鏡40×成像進行觀察和拍照,最后利用Image-Pro Plus 6.0分析軟件測量絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度,根據絨毛數量和對應黏膜層面積,計算絨毛密度:

絨毛密度=絨毛數量/黏膜層面積。

1.4.4 腸道菌群測序和分析

取腸道內容物于冰上解凍,利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法對腸道菌群的總DNA進行提取,經過電泳檢測和定量后進行PCR擴增,引物為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。擴增產物經過AMPure XT beads純化和Qubit定量。純化后的擴增產物經Agilent 2100生物分析儀(Agilent,美國)和Illumina (Kapa Biosciences,美國)的文庫定量試劑盒進行評估后,利用NovaSeq 6000測序儀進行雙端測序,相應試劑為NovaSeq 6000 SP Reagent Kit (500 cycles)。測序獲得的雙端數據經拆分、拼接和過濾之后,再通過qiime dada2 denoise-paired調用DADA2去噪,從而獲得最終的擴增子序列變異(ASV)特征序列和ASV豐度表格?；讷@得的ASV特征序列和豐度表格進行alpha多樣性分析、物種差異分析和功能預測。alpha多樣性顯著性檢驗采用Kruskal-Wallis檢驗;腸道差異菌群的篩選采用線性判別分析效應大小(LEfSe)分析,設定差異判斷標準為P<0.05、線性判別分析(LDA)值>4;利用PICRUSt2軟件對腸道菌群功能進行預測。

1.5 數據統計分析

試驗所得數據采用Excel 2021進行處理后,再用SPSS 26.0對所得數據進行正態性檢驗(Shapiro-Wilk)和方差齊性檢驗(Levene tests),然后再進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比較檢驗,結果數據以平均值±標準差(mean±SD)表示,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 4個大口黑鱸群體生長性能指標差異

由表2可知,雜交群體和臺灣群體大口黑鱸終末體質量、增重率和特定生長率顯著高于優鱸1號和優鱸3號(P<0.05),優鱸3號終末體質量、增重率和特定生長率顯著高于優鱸1號(P<0.05);臺灣群體終末體長顯著高于優鱸1號(P<0.05);雜交群體臟體比顯著低于優鱸1號和臺灣群體(P<0.05);雜交群體肝體比顯著低于優鱸3號(P<0.05);雜交群體肥滿度顯著高于其他3個群體,臺灣群體肥滿度顯著高于優鱸1號和優鱸3號(P<0.05);雜交群體飼料系數率顯著低于其他3個群體(P<0.05)。

表2 4個大口黑鱸群體生長性能指標差異

2.2 4個大口黑鱸群體肌肉常規營養成分差異

由表3可知,臺灣群體大口黑鱸肌肉水分含量顯著高于雜交群體和優鱸1號(P<0.05),雜交群體肌肉水分含量顯著低于其他3個群體(P<0.05);4個群體間肌肉粗灰分含量無顯著差異(P>0.05);雜交群體和優鱸1號肌肉粗脂肪含量顯著高于臺灣群體(P>0.05);臺灣群體肌肉粗蛋白質含量顯著高于優鱸3號(P<0.05)。

表3 4個大口黑鱸群體肌肉常規營養成分差異

2.3 4個大口黑鱸群體肌肉脂肪酸組成差異

由表4可知,大口黑鱸肌肉中共測出20種脂肪酸,包括7種飽和脂肪酸(SFA),5種單不飽和脂肪酸(MUFA),以及8種多不飽和脂肪酸(PUFA)。其中,雜交群體和優鱸1號肌肉各類脂肪酸含量均顯著高于優鱸1號和臺灣群體(P<0.05),且雜交群體肌肉SFA、MUFA和PUFA含量顯著高于其他3個群體(P<0.05)。4個群體中肌肉脂肪酸含量較多的均為PUFA,其次是MUFA和SFA。

表4 4個大口黑鱸群體肌肉脂肪酸組成差異

2.4 4個大口黑鱸群體腸道形態結構差異

4個大口黑鱸群體腸道形態結構如圖1和表5所示,雜交群體大口黑鱸前腸絨毛寬度和后腸絨毛高度、絨毛寬度以及肌層厚度均顯著高于優鱸1號(P<0.05);雜交群體前腸絨毛密度和后腸絨毛寬度顯著高于優鱸3號和臺灣群體(P<0.05),并且雜交群體后腸肌層厚度也顯著高于優鱸3號(P<0.05)。臺灣群體前腸絨毛高度和后腸肌層厚度均顯著高于優鱸3號(P<0.05);臺灣群體后腸絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度顯著高于優鱸1號(P<0.05);臺灣群體前腸肌層厚度顯著高于其他3個群體(P<0.05)。優鱸3號后腸絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度均顯著高于優鱸1號(P<0.05),但前腸絨毛高度顯著低于優鱸1號(P<0.05)。

紅色箭頭:絨毛高度;黃色箭頭:絨毛寬度;綠色箭頭:肌層厚度;黑色箭頭:完整絨毛。

表5 4個大口黑鱸群體腸道形態結構差異

2.5 4個大口黑鱸群體腸道菌群差異

2.5.1 4個大口黑鱸群體腸道菌群alpha多樣性分析

如圖2所示,雜交群體大口黑鱸腸道菌群Chao1指數和操作分類單元(OTU)數量顯著高于優鱸3號和臺灣群體(P<0.05),極顯著高于優鱸1號(P<0.01);雜交群體腸道菌群Shannon指數極顯著高于其他3個群體(P<0.01),且優鱸1號腸道菌群Shannon指數顯著高于臺灣群體(P<0.05);優鱸3號腸道菌群alpha多樣性各指標與優鱸1號和臺灣群體相比均無顯著差異(P>0.05)。

*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。圖3同。

2.5.2 4個大口黑鱸群體腸道菌群組成分析

本試驗中,選取門水平相對豐度前30的菌門進行分析發現(圖3-A),4個大口黑鱸群體腸道菌群的優勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteriota)以及放線菌門(Actinobacteriota)。另外,通過布雷-柯蒂斯(Bray-Curtis)距離聚類發現,臺灣群體、優鱸3號和優鱸1號聚類較近,雜交群體聚類較遠,表明雜交群體的微生物組成與其他3個群體差異較大。差異分析表明(圖3-B),優鱸3號和臺灣群體大口黑鱸腸道厚壁菌門相對豐度極顯著高于雜交群體(P<0.01)。雜交群體腸道變形菌門相對豐度顯著高于優鱸3號(P<0.05),極顯著高于臺灣群體(P<0.01);優鱸1號腸道變形菌門相對豐度顯著高于臺灣群體(P<0.05)。雜交群體腸道梭桿菌門相對豐度顯著高于優鱸1號(P<0.05),腸道放線菌門相對豐度顯著高于臺灣群體(P<0.05)。

A:布雷-柯蒂斯距離聚類樹及相對豐度前30的菌門分布圖;B: 腸道核心菌門的差異分析。

為進一步確定不同群體大口黑鱸腸道內的核心菌群,本試驗通過LEfSe分析比較了雜交群體分別與優鱸1號、優鱸3號以及臺灣群體間所有檢測到的細菌類群的豐度(圖4),設定P<0.05、LDA值>4為差異顯著判斷標準,篩選出的核心差異菌屬是顯著富集于雜交群體的鯨桿菌屬(Cetobacterium)和鄰單胞菌屬(Plesiomonas),顯著富集于優鱸1號、優鱸3號和臺灣群體的支原體屬(Mycoplasma)以及顯著富集于優鱸1號的不動桿菌屬(Acinetobacter)。

圖4 4個大口黑鱸群體腸道菌群組成LEfSe分析

2.5.3 4個大口黑鱸群體腸道菌群功能預測及相關性分析

基于獲得的ASV采用PICRUSt2軟件進行菌群功能分析(圖5-a),利用京都基因與基因組百科全書(KEGG)數據庫對獲得的數據進行比對,4個大口黑鱸群體中最豐富的腸道菌群功能類別是膜轉運、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、復制和修復、翻譯以及能量代謝,并且各功能分類在4個大口黑鱸中的平均比例變化趨勢均為:雜交群體>優鱸3號>臺灣群體>優鱸1號。此外,通過斯皮爾曼相關性分析發現(圖5-b),各腸道菌群功能與后腸絨毛高度呈極顯著正相關(P<0.01);脂質代謝與后腸絨毛寬度呈極顯著正相關(P<0.01),其他功能與后腸絨毛寬度顯著正相關(P<0.05);大口黑鱸肥滿度與能量代謝、氨基酸代謝以及折疊、分類和降解呈顯著正相關(P<0.05)。

a:腸道菌群功能預測;b: 相關性分析。a: function prediction of intestinal microflora; b: correlation analysis.

3 討 論

生長性能和形態指標是魚類良種選育和品種改良過程中重要的選種參數[18]。不同大口黑鱸群體的生長性能存在差異,李江濤等[19]以大口黑鱸臺灣群體和佛山群體為親本進行自交和正反交,發現正反交群體的生長性能和形態指標顯著優于2個自交群體。周家輝等[20]通過對大口黑鱸北方亞種、“優鱸1號”及其正反交后代群體的生長性能進行綜合分析,發現雜交群體的生長性能要優于自交群體,并且北方亞種的生長性能優于“優鱸1號”。在形態指標方面,臟體比、肝體比和肥滿度是衡量魚體能量狀態的重要指標,在一定程度上可以反映魚體的健康狀況[7]。本試驗通過美國北方亞種和地方選育種進行正交,得到的雜交群體生長性能和形態指標均優于國內養殖群體,依次為:雜交群體、臺灣群體、“優鱸3號”和“優鱸1號”,這是因為本研究中雜交群體的父本為新引進的美國北方亞種,遺傳結構相對獨立,具有較高的遺傳多樣性,而“優鱸3號”和“優鱸1號”是在臺灣群體的基礎上經過多代選育而來,其在選育的過程中可能存在遺傳混雜現象,也可能會出現一些基因所決定的生長性狀存在連鎖現象,導致遺傳多樣性降低和種質退化,因此基于北方亞種群體開展群體選育或與其他群體開展種內雜交育種可能具有較好的應用前景[4]。

本試驗中,4種養殖大口黑鱸群體的肌肉常規營養成分中的水分、粗蛋白質和粗灰分含量與宋立民等[21]及樊佳佳等檢測結果一致,但宋立民等[21]所測“優鱸3號”和臺灣群體肌肉粗脂肪含量(分別為2.60%和1.83%)明顯低于本試驗所測“優鱸3號”和臺灣群體肌肉粗脂肪含量(分別為6.00%和3.01%);樊佳佳等[22]所測“優鱸1號”肌肉粗脂肪含量為4.45%,明顯低于本試驗所測“優鱸1號”肌肉粗脂肪含量(6.94%)。本試驗所測雜交群體肌肉粗脂肪含量為6.40%,與王廣軍等[23]的檢測冰鮮魚組肌肉粗脂肪含量(6.41%)一致,高于其飼料組所測結果(2.12%)。推測這一結果與養殖過程中飼料營養成分、養殖模式、養殖周期和養殖溫度等因素有關。根據世界衛生組織和聯合國糧農組織提出的脂肪酸平衡要求,SFA、MUFA和PUFA比例(S∶M∶P)越接近1∶1∶1,越有助于人體營養均衡[24]。本試驗4種大口黑鱸群體肌肉的S∶M∶P接近1.0∶1.1∶1.4,相比于鳙魚(Aristichthysnobilis)[25]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[8]等其他魚類更接近于理想比值,因此食用大口黑鱸更有助于人體攝入均衡的營養。另外,4個大口黑鱸群體肌肉脂肪酸中均以PUFA含量最高,其次為MUFA和SFA。大口黑鱸作為肉食性魚類,其激烈的搶食行為使得大量SFA和MUFA優先分解供能,同時降低了大口黑鱸體內脂肪沉積,提高生長性能[26];并且,穆小平[27]研究發現,魚類在適當的運動強度下能增加肌肉PUFA含量,而PUFA含量與魚肉口感鮮嫩程度成正比[5]。有報道指出,魚類肌肉脂肪酸含量和組成差異是評價其營養價值的重要指標,同時提高肌肉營養價值也是選育優良品種的主要目標之一,其組成及含量主要與養殖模式、飼料類型和生活環境等因素有關[28]。本試驗在相同的養殖條件下,發現雜交群體的肌肉脂肪酸含量顯著高于目前國內主要養殖群體,表明雜交可以促進大口黑鱸肌肉中脂肪酸的積累,優化肌肉品質。

腸道是魚類消化吸收營養物質的主要部位,絨毛高度、絨毛寬度以及肌層厚度與魚類腸道的生長發育和吸收能力密切相關[11]。絨毛高度和寬度的增加會增大與食物的接觸面積,從而促進對營養物質的消化吸收;肌層厚度則可反映腸道的收縮能力,通過腸道收縮推動食物,形成腸道蠕動,使食物與消化液在腸道內充分混勻,提高消化吸收效率[16]。4種大口黑鱸群體的前腸絨毛高度和寬度均高于后腸,前腸可能是其主要的消化場所[29]。本試驗中,雜交群體腸道結構最優,其次為臺灣群體、“優鱸3號”和“優鱸1號”,與生長變化趨勢一致。因此,大口黑鱸腸道絨毛發育越完善,形態結構越完整,在維持腸道內環境穩態方面發揮的作用越大,有利于腸道微生物的定植和增殖,從而有助于對營養物質消化吸收,降低飼料系數,提高生長性能。

不同魚類腸道優勢菌群存在差異,但是厚壁菌門、變形菌門和梭桿菌門更多的以優勢菌門的身份出現[13]。這與本試驗在門水平上的分析結果一致,大口黑鱸腸道內的優勢菌群為厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門以及放線菌門。厚壁菌門可以參與機體內蛋白質、脂肪等復雜大分子有機物質的轉化,被認為是評價動物機體肥胖程度的重要指標,哺乳動物的肥胖、糖尿病等常常與其豐度上升密切相關[30]。本試驗中,厚壁菌門在雜交群體中比例顯著低于其他3個群體,可能是因為雜交群體在養殖過程中對于脂類和碳水化合物等營養物質的代謝更加旺盛,這有利于大口黑鱸的健康生長。目前研究表明,變形菌門中包含大量潛在致病菌,對于哺乳動物來說,其豐度提高是宿主腸道菌群失調的重要標志之一[31],但是Sun等[32]研究發現,變形菌門始終參與蛋白質的消化過程,與宿主的具有復雜的相互作用,并且變形菌門對于魚類作用機制研究較少,還需要進一步明確。另外,本試驗中梭桿菌門和放線菌門在雜交群體的相對豐度較高,梭桿菌門和放線菌門具有降解多糖和蛋白質、緩解腸道炎癥以及增強對致病菌的抵抗力等作用,有助于維持腸道內穩態[33]。通過進一步分析大口黑鱸腸道內的核心菌群發現,所占比例較大的屬是厚壁菌門的支原體屬、梭桿菌門的鯨桿菌屬以及變形菌門的不動桿菌屬和鄰單胞菌屬。鯨桿菌屬作為一種益生菌,能改善魚類腸道健康,可以一定程度上抑制潛在致病菌的活性[34-35];不動桿菌屬是多數淡水魚類的優勢菌屬,具有抵抗病原菌感染、產生胞外酶等作用,可以增強魚體對蛋白質等營養物質的消化吸收[36];而支原體屬和鄰單胞菌屬中大多都是致病菌和機會致病菌,這些潛在致病菌會在魚類內外環境發生改變時導致魚類發病,影響魚類生長[37]。腸道微生物多樣性與宿主的健康情況和代謝能力密切相關,腸道微生物多樣性高說明腸道功能的穩定性高,宿主的抗病能力強[38]。本試驗中,雜交群體的物種組成與其他3個群體相差較大,物種數量更豐富且含量更高,目前研究表明腸道微生物之間復雜的相互作用能夠加速脂肪代謝及脂肪酸的積累[39],并且在維持腸道穩態從而促進腸道健康等方面發揮重要作用[40]。雜交育種可能不僅僅改善大口黑鱸的生長性能和肌肉品質,而且在提高腸道微生物的多樣性上發揮一定的雜交優勢。

本試驗采用PICRUSt2軟件預測分析了4個大口黑鱸群體的腸道微生物功能,表明不同群體之間存在相似的功能通路分布特征,主要集中在新陳代謝、遺傳信息處理以及環境信息處理等方面,這與大口黑鱸具有相同的優勢菌群有關,然而雜交群體在各通路的豐度均顯著高于其他群體,筆者認為這與雜交群體腸道微生物多樣性高于其他群體有關,而魚類腸道菌群結構差異與不同群體腸道內的選擇壓力密切相關,且宿主與腸道菌群之間相互作用,共同選擇進化[41],這也進一步說明雜交育種在提高腸道微生物多樣性上發揮了雜交優勢,并且使腸道為微生物的生理活動更加活躍,從而對宿主營養代謝產生一定的影響。通過斯皮爾曼相關性分析進一步發現,這些腸道微生物功能有利于后腸絨毛的發育,從而促進大口黑鱸對營養物質的消化吸收,降低飼料系數,提高肥滿度,這一結果也與上文的生長性能和腸道菌群組成結果一致,更加證實了腸道菌群的多樣性與魚體生長代謝緊密相連。

4 結 論

相較于其他群體,雜交群體大口黑鱸增重率、特定生長率以及肥滿度提高,并且肌肉中各類脂肪酸的積累增多,肌肉口感和品質得到提升。此外,雜交群體的腸道形態結構也得到顯著改善,腸道菌群的多樣性提高,腸道鯨桿菌屬相對豐度提高,從而促進了大口黑鱸對營養物質的消化吸收,降低了飼料系數,提高了生長性能,提升了選育的綜合效果。