N-?；呓z氨酸內酯酶在肉雞中應用的耐受性評價

陳 星 鄭愛娟 陳志敏 張廣民 王澤棟 劉國華 常文環 蔡輝益

(中國農業科學院飼料研究所,農業農村部動物產品質量安全飼料源性因子風險評估實驗室,農業農村部飼料生物技術重點實驗室,北京 100081)

N-?；呓z氨酸內酯(N-acyl hyperserine lactone,AHL)是負責介導革蘭氏陰性菌群體感應(QS)的關鍵成員[1]。QS是細菌通訊的一個過程,調節生物膜的形成和其他毒力因子的產生,以便在宿主中建立致病機制[2]。抑制QS的過程稱為群體感應淬滅(QQ),通過酶促降解來調節自身誘導物的積累[3]。QS過程依賴于小的可擴散信號分子的產生、釋放和群體范圍的檢測,而這些信號分子通常是革蘭氏陰性菌中的AHL[4]。研究發現,N-?；呓z氨酸內酯酶(N-acyl-homoserine lactonase,AHLase)可以通過水解內酯鍵來降解AHL,抑制革蘭氏陰性病原體的毒力因子分泌和生物膜形成等致病因素[5]。此外,與抗生素相比,QS抑制劑如AHLase不會使細菌因為選擇壓力而產生耐藥性,這為其應用奠定了基礎[6]。前期研究發現,500 mg/kg的AHLase顯著改善了不同性別科寶肉仔雞的生長性能、屠宰性能和養分表觀代謝率,促進蛋白質和脂質在肉雞體內的代謝和周轉,并改善了腸道形態[7-8]。然而,關于高劑量AHLase對肉雞生長發育的研究報道較少。因此,本試驗依據《飼料和飼料添加劑畜禽靶動物耐受性評價試驗指南(試行)》對AHLase進行耐受性評價,探究高劑量AHLase(5 000 mg/kg)對肉雞生長性能、血液生理生化指標、器官指數和組織形態結構的影響,為AHLase在肉雞上的應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

AHLase外觀性狀為乳白色粉末,酶活性為104U/g。

1.2 試驗設計

本試驗采用雙因素試驗設計,選擇健康且體重相近的1日齡科寶肉仔雞360只作為研究對象,并將其隨機分為3組,每組6個重復,每個重復20只雞,公雞和母雞各占1/2,并進行分籠飼養。在保證各組之間體重差異不顯著(P>0.05)的情況下,科寶肉仔雞的初始體重為(46.20±0.45) g。對照組飼喂基礎飼糧,試驗組在基礎飼糧中分別添加500和5 000 mg/kg的AHLase(有效成分活性分別為5×103和5×104U/kg)?；A飼糧配制參考NY/T 33—2004標準,其組成及營養水平與本課題組前期研究相同[7-8]。肉雞每天的光照時長為16 h,黑暗時長為8 h。它們通過乳頭式飲水器供水,并可以自由采食。飼養過程中使用水循環式暖氣進行供熱,初始雞舍溫度為33 ℃,之后每周逐漸降低2 ℃,最終穩定在24 ℃。雞只在1日齡時接種馬立克疫苗,并在7日齡時進行滴鼻點眼、接種新城疫和腎傳支二聯苗。試驗期為42 d,期間肉雞的飼養管理、免疫規程以及雞舍的衛生管理都遵循科寶肉雞飼養規程。

1.3 指標測定

1.3.1 生長性能指標[9]

在1、21和42日齡時,對肉雞進行初重(BW)和末重(FW)的稱量,并計算平均日增重(ADG)。同時,記錄每日的喂料量、剩余料量和死亡數,以計算平均日采食量(ADFI)。根據ADG和ADFI的數據,計算料重比(F/G)。

1.3.2 血液生理生化指標

在42日齡時,每個重復隨機選取2只雞(公、母各1只),每組共計選取12只肉雞。通過使用醫用采血針從翅下靜脈采集血液,將一部分儲存在抗凝管中,以進行血液常規指標的測定;另一部分儲存在促凝管中,放置于離心機中離心分離血清,用于血清生化指標的測定。使用細胞檢測儀(TEK-Ⅱ mini全自動動物血液分析儀)檢測白細胞計數(WBC)、紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白濃度(HGB)、紅細胞比容(HCT)、紅細胞寬度變異系數(RDW-CV)、紅細胞平均體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)以及平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)。同時,使用全自動生化分析儀(日立7160,日本)測定血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)的活性,以及總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLB)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)和總膽紅素(TBill)的含量。

1.3.3 器官指數

在42日齡時,每個重復隨機取2只肉雞(公、母各1只),每組共計選取12只肉雞。經頸靜脈放血致死后,取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、胰腺、嗉囊、肌胃、腺胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸和法氏囊,稱重后計算器官指數,計算公式如下:

器官指數(g/kg)=器官重/活體重。

1.3.4 組織形態結構觀察

在42日齡,每個重復選取體重接近的2只肉雞(公、母各1只),頸靜脈放血致死,分別取肉雞的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰腺、肌胃、十二指腸、空腸、回腸和直腸,保存于4%多聚甲醛溶液中。將固定好的組織樣品經脫水、透明、浸蠟、包埋后,用全自動旋轉石蠟切片機(HM355S, Thermo Fisher Scientific Inc.,美國)進行切片,經自動染色機(A81500101, Thermo Scientifific,英國)染色后用中性樹脂密封,光鏡觀察并拍照(400×)。

1.4 數據分析

采用SPSS 17.0軟件進行AHLase添加水平和性別雙因素方差分析,對主效應顯著的指標進行Tukey’s多重比較。對AHLase添加水平和性別間交互效應顯著的指標,公、母分別進行單因素方差分析,對主效應顯著的指標進行Tukey’s多重比較。P<0.05為差異顯著,0.05

2 結果與分析

2.1 AHLase對肉雞生長性能的影響

2.1.1 AHLase對1～21日齡肉雞生長性能的影響

AHLase對1～21日齡肉雞生長性能的影響見表1。對于公雞,與對照組相比,AHLase-5000組肉雞平均日采食量顯著提高(P<0.05),但與AHLase-500組之間無顯著差異(P>0.05)。對照組、AHLase-500組和AHLase-5000組間在平均日增重和料重比無顯著差異(P>0.05)。對于母雞,飼糧中添加AHLase對肉雞初重、末重、平均日增重、平均日采食量和料重比均無顯著影響(P>0.05)。

表1 飼糧中添加AHLase對1～21日齡肉雞生長性能的影響

主效應分析表明,在性別方面,公雞平均日增重和平均日采食量顯著高于母雞(P<0.05),而末重(P=0.079)和料重比(P=0.075)則有升高的趨勢。在AHLase添加水平方面,隨著AHLase添加水平的增加,AHLase-5000組的平均日采食量顯著升高(P<0.05),平均日增重有升高的趨勢(P=0.052),而料重比則顯著降低(P<0.05)。肉雞的性別和AHLase添加水平在平均日采食量中表現出顯著互作效應(P<0.05)。

2.1.2 AHLase對22～42日齡肉雞生長性能的影響

AHLase對22～42日齡肉雞生長性能的影響見表2。對于公雞,與對照組相比,AHLase-500組和AHLase-5000組肉雞的料重比顯著降低(P<0.05),但平均日增重和平均日采食量無顯著變化(P>0.05)。對于母雞,飼糧中添加AHLase對肉雞平均日增重、平均日采食量和料重比均無顯著影響(P>0.05),但AHLase-5000組的末重顯著高于對照組(P<0.05)。

表2 飼糧中添加N-?；呓z氨酸內酯酶對22～42日齡肉雞生長性能的影響

主效應分析表明,在性別方面,公雞末重、平均日增重和平均日采食量顯著高于母雞(P<0.05),而料重比則無顯著差異(P>0.05)。在AHLase添加水平方面,與對照組相比,AHLase-5000組的末重顯著提高(P<0.05),AHLase-500組和AHLase-5000組的平均日采食和料重比顯著降低(P<0.05),而平均日增重則無顯著差異(P>0.05)。肉雞的性別和AHLase添加水平在平均日采食量中表現出顯著互作效應(P<0.05),而在料重比中表現出互作趨勢(P=0.069)。

2.1.3 AHLase對1～42日齡肉雞生長性能的影響

AHLase對1～42日齡肉雞生長性能的影響見表3。對于公雞,與對照組相比,AHLase-5000組料重比顯著降低(P<0.05),而平均日增重和平均日采食量無顯著差異(P>0.05)。對于母雞,對照組、AHLase-500組和AHLase-5000組平均日增重無顯著差異(P>0.05)。飼糧中添加AHLase顯著降低母雞的平均日采食量(P<0.05),但AHLase-500組和AHLase-5000組之間無顯著差異(P>0.05)。

表3 飼糧中添加AHLase對1～42日齡肉雞生長性能的影響

主效應分析表明,在性別方面,公雞平均日增重和平均日采食量均高于母雞(P<0.05),而料重比顯著降低(P<0.05)。在AHLase添加水平方面,AHLase-500組和AHLase-5000組的料重比顯著降低(P<0.05),平均日采食量有降低的趨勢(P=0.065),而平均日增重則無顯著差異(P>0.05)。肉雞的性別和AHLase添加水平在料重比中表現出顯著互作效應(P<0.05),而在平均日增重中表現出互作趨勢(P=0.064)。

2.2 AHLase對42日齡肉雞血常規指標的影響

AHLase對42日齡肉雞血常規指標的影響見表4。與對照組相比,AHLase-500組和AHLase-5000組肉雞白細胞計數、血紅蛋白濃度、紅細胞計數、紅細胞比積、紅細胞寬度變異系數、紅細胞平均體積、平均紅細胞血紅蛋白含量以及平均紅細胞血紅蛋白濃度均無顯著影響(P>0.05)。

表4 飼糧中添加AHLase對42日齡肉雞血常規指標的影響

2.3 AHLase對42日齡肉雞血清生化指標的影響

AHLase對42日齡肉雞血清生化指標的影響見表5。飼糧中添加500和5 000 mg/kg的AHLase對肉雞血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、堿性磷酸酶活性及葡萄糖、總蛋白、白蛋白、尿素、肌酐和總膽紅素含量均無顯著影響(P>0.05)。

表5 飼糧中添加AHLase對42日齡肉雞血清生化指標的影響

2.4 AHLase對42日齡肉雞器官指數的影響

AHLase對42日齡肉雞器官指數的影響見表6。飼糧中添加AHLase對42日齡肉雞心臟、肝臟、肺臟、腎臟、嗉囊、腺胃、肌胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸、胰腺、脾臟、胸腺和法氏囊指數均無顯著影響(P>0.05)。

表6 飼糧中添加AHLase對42日齡肉雞器官指數的影響

主效應分析表明,在性別方面,與母雞相比,公雞直腸指數有降低的趨勢(P=0.088),脾臟指數有升高的趨勢(P=0.079)。在AHLase添加水平方面,相比于對照組和AHLase-5000組,AHLase-500組空腸指數有升高的趨勢(P=0.059)。肉雞的性別和AHLase添加水平在心臟指數中表現出互作趨勢(P=0.089)。

2.5 AHLase對42日齡肉雞組織形態結構的影響

AHLase對42日齡肉雞組織形態結構的影響見圖1。AHLase-500組和AHLase-5000組肉雞心臟中心肌纖維結構清晰,排列緊密,肌纖維間未見炎性細胞浸潤及水腫。肺臟結構清楚,肺泡間隔、肺泡腔及小支氣管均未見明顯異常。肝臟中肝細胞呈多邊形,細胞核清晰;肝細胞呈輻射狀排列在中央靜脈的周圍;中央靜脈可見少量血液,竇狀隙未見擴張。脾臟中脾臟紅、白髓相間分布;脾竇狹窄,脾竇內有大量血細胞、脾小體輪廓清晰、大小不等、脾臟組織整體結構正常。腎臟組織皮質小葉和髓質小葉結構清晰,皮質小葉中腎小體分布在中央靜脈周圍,腎間質可見少量淤血,腎小球和腎小管結構正常。胰腺腺泡輪廓清晰,胰島大小不等,散在分布,胰腺整體結構較正常。十二指腸、空腸、回腸和直腸絨毛長而直且黏膜上皮完整,杯狀細胞夾雜在腸柱狀上皮細胞之間,固有層中可見大量腸腺,結構完整清晰,整體結構正常。

圖1 飼糧中添加AHLase對42日齡肉雞組織形態結構的影響

3 討 論

3.1 AHLase對肉雞生長性能的影響

前期研究中發現,飼糧補充AHLase顯著提高試驗期肉雞的平均日采食量和料重比,而對平均日增重則無顯著影響[7]。本試驗基于前期研究的適宜添加水平,依據《飼料和飼料添加劑畜禽靶動物耐受性評價試驗指南(試行)》對AHLase進行了耐受性評價試驗。在本研究中,AHLase-500組和AHLase-5000組肉雞的平均日增重、平均日采食量和料重比之間均無顯著差異,這表明科寶肉雞可以耐受5 000 mg/kg的AHLase添加水平且不會造成負面影響。與對照組相比,AHLase-5000組肉雞的平均日采食量和料重比降低。這個結果可能闡釋了飼糧中添加5 000 mg/kg的AHLase依舊可以發揮淬滅AHL介導的病原菌之間群體感應機制的能力,通過內酯鍵的酶促水解降解AHL的功效[10]。此外,AHLase也可通過促進宿主抗感染和抗炎因子的表達,提高肉雞抵抗病原菌侵染的能力,這也可能是生產性能改善的原因之一[11]。同時,觀察到公雞的平均日增重和平均日采食量均顯著高于母雞。與母雞相比,公雞對于營養物質的吸收能力較強,可以將更多的營養物質儲存在機體中,進而提高肉雞的平均日增重[12-13]。

3.2 AHLase對肉雞血常規指標的影響

血常規是判斷家禽機體健康的重要指標之一[14]。白細胞是體內重要的免疫細胞,通過分泌白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子等參與機體炎癥和免疫調節[15]。紅細胞的變化則往往代表著機體內環境的失衡,而血小板和血小板壓積通常與機體健康密不可分[16]。在本試驗中,與對照組相比,AHLase-500組和AHLase-5000組肉雞的血常規指標均無顯著差異,表明飼糧中添加5 000 mg/kg的AHLase并未引發肉雞相關的血液和免疫等生理方面的疾病。

3.3 AHLase對肉雞血清生化指標的影響

血清中的蛋白質在動物的生理和病理活動中扮演著重要角色[17]?？偟鞍缀靠梢苑从成矬w的營養狀況,而白蛋白和球蛋白在調節免疫系統中起關鍵作用[18]。尿素作為動物蛋白質分解代謝的最終產物,通過肝臟中的鳥氨酸循環合成,并隨后在腎臟中排泄[19]。此外,谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶和堿性磷酸酶的活性對于評估肝臟毒性非常重要,任何病理表現或毒性都可能導致谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性的增加[20]。同時,谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性也可以作為衡量肝臟損傷程度的特定指標[21]。飼糧中添加500和5 000 mg/kg的AHLase對肉雞血清中谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、堿性磷酸酶活性及葡萄糖、總蛋白、白蛋白、尿素、肌酐和總膽紅素含量無顯著影響,表明添加5 000 mg/kg的AHLase并未造成肉雞機體生化代謝異常。

3.4 AHLase對肉雞器官指數以及組織形態結構的影響

器官指數,即器官的相對重量,是衡量家禽細菌感染和免疫功能狀況的重要指標[22]。免疫器官的發育與免疫功能密切相關,在一定程度上來說,器官指數越高,則免疫功能越強[23]。胸腺和法氏囊作為中樞免疫器官,是淋巴細胞發育、分化和成熟的主要場所。脾臟是主要的外周淋巴器官,它與肝臟一起包含大量的免疫細胞,因此是細胞和體液免疫反應的重要場所[24]。在本試驗中,飼糧中添加500和5 000 mg/kg的AHLase對肉雞心臟、肝臟、肺臟、腎臟、嗉囊、腺胃、肌胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸、胰腺、脾臟、胸腺和法氏囊指數均無顯著影響。此外,本試驗還對心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、胰腺、肌胃、十二指腸、空腸、回腸和直腸進行了組織形態結構觀察,結果顯示飼喂500和5 000 mg/kg的AHLase的肉雞組織無病理變化,表明5 000 mg/kg AHLase的添加水平并不會引發組織病變。

4 結 論

本試驗未發現飼糧中添加5 000 mg/kg的AHLase對肉雞生長性能、血液生理生化指標、器官指數以及組織形態結構造成顯著影響。綜上所述,5 000 mg/kg AHLase在肉雞飼糧中的添加水平是安全的。