丁酸梭菌對愛拔益加肉雞生長性能、腸道健康和抗氧化能力的影響

王思夢 聶存喜* 姬琳堡 沈家坤 王 佩 張 濂 張 鑫

(1.石河子大學動物科技學院,石河子 832003;2.中國農業大學動物科學技術學院,動物營養學國家重點實驗室,北京 100193)

在畜牧業中,抗生素的過量使用可能對動物腸道菌群造成損害,導致腸道菌群失衡,進而影響動物的消化吸收和免疫功能[1]。因此,減少或替代抗生素在養殖生產中的應用已成為畜禽養殖業亟待解決的問題[2]。我國不僅對抗生素在畜禽養殖中的應用加強了監管力度,而且廣泛關注對抗生素替代品的研發工作。

作為一種生態友好且益于人類和動物健康的抗生素替代品,丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)不僅有助于腸道菌群的穩定,而且可以增強免疫力[3-4],這類抗生素替代品的開發因此受到了廣泛關注。丁酸梭菌具有優良的特性,如產生芽孢、耐酸、耐膽鹽及耐高溫等[5],使其成為理想的飼料添加劑。研究表明,在飼糧中添加丁酸梭菌可以降低肉雞盲腸中大腸桿菌、沙門氏菌數量,促進肉雞腸道有益菌群繁殖[6]。盡管丁酸梭菌在養殖業中有著廣泛的應用,但在家禽生產方面的研究還相對較少。因此,本研究旨在揭示飼糧添加丁酸梭菌對愛拔益加(AA)肉雞生長性能、腸道健康和抗氧化能力的影響,以期提供科學、高效的抗生素替代方案及為肉雞無抗養殖的實際應用提供一定的指導作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗采用丁酸梭菌(SLZX19-05,CN113583915B)作為試驗菌株,由農業農村部飼料工業中心分離保存。丁酸梭菌的活菌數為2.88×109CFU/g,菌株于-80 ℃低溫冰箱中保存,使用前需解凍并于平板培養基中接種。

試驗主要儀器包括:SPM-9500J3型原子力顯微鏡(日本島津),KD-BLⅣ型包埋機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司),HM315型輪轉式切片機(美國賽默飛),KD-THⅡ型攤烤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司),XI71型熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.2 試驗設計

選取1日齡AA肉仔雞120只,隨機分為2組,每組6個重復,每個重復10只,重復之間體重無顯著差異(P>0.05)。對照組飼喂基礎飼糧,基礎飼糧為參照NRC(1994)營養需要配制的粉狀配合飼料;丁酸梭菌組飼喂在基礎飼糧中添加0.5%丁酸梭菌的飼糧。飼糧組成及營養水平見表1。試驗期42 d,分為1～21日齡和22～42日齡2個階段。

表1 飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.3 飼養管理

試驗前對雞舍進行沖洗消毒,凈化通風后開始使用。試驗雞采用籠養,自由采食和飲水。光照24 h/d,溫度第1周保持37 ℃,后面每周降3 ℃,直到27 ℃為止。試驗雞的雞舍衛生管理、飼養管理及免疫規章均按照AA肉雞飼養方法進行。

1.4 樣品采集與指標測定

1.4.1 樣品采集

試驗結束時,每個重復隨機選取2只雞,翅靜脈采血,3 000 r/min離心15 min,取上清液于-20 ℃保存,用于血清抗氧化指標的測定;試驗雞采血后屠宰,采集1～2 cm十二指腸、空腸、回腸及其內容物迅速放入2 mL無菌EP管中,于-80 ℃保存;并采集2～3 cm的腸段放入裝有甲醛溶液的50 mL離心管中備用。

1.4.2 生長性能測定

飼養期間以重復為單位記錄雞的喂料量、剩余料量、初始體重和終末體重,計算試驗雞各階段的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G),計算公式為:

平均日增重=(終末體重-初始體重)/(試驗天數×肉雞只數);平均日采食量=總耗料量/(試驗天數×肉雞只數);料重比=平均日采食量/平均日增重。

1.4.3 腸道形態結構測定

將十二指腸、空腸和回腸樣品用0.9%生理鹽水沖洗后于組織固定液中固定24 h,制作石蠟切片,采用蘇木精-伊紅(HE)染色后進行鏡檢,測定絨毛高度和隱窩深度,并計算絨隱比(絨毛高度/隱窩深度)。

1.4.4 抗氧化能力測定

稱取0.1 g解凍的樣品,加入0.9 mL預冷的緩沖液,在冰浴條件下進行勻漿,然后于4 ℃、3 000 r/min離心10 min,取上清液。采用試劑盒測定血清和腸道總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPS-Px)活性以及總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)和丙二醛(MDA)含量,試劑盒由南京建成生物工程研究所提供,測定方法按照試劑盒說明書進行。

1.4.5 空腸抗氧化和炎癥相關基因表達量測定

根據RNA提取試劑盒說明,從每組各取4個空腸樣本,從空腸組織中提取總RNA[7]。采用分光光度計對RNA濃度進行測定,當260～280 nm處吸光度值在1.8～2.2,說明提取的RNA質量較好。使用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ進行逆轉錄,擴增總體積為10 μL,其中包括0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、1.0 μL cDNA、5.0 μL TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ和3.2 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水。實時熒光定量PCR程序如下:95 ℃變性30 s,95 ℃變性5 s,然后60 ℃退火和延伸20 s,40個循環。目標基因和參考基因(β-肌動蛋白)的引物序列見表2,目標基因的mRNA相對表達量采用2-ΔΔCt方法進行計算。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.5 數據統計分析

試驗數據采用SPSS 20.0軟件進行組間t檢驗分析,結果數據用“平均值±標準差”表示,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響

丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響見表3。與對照組相比,丁酸梭菌組肉雞42日齡體重以及22～42日齡和1～42日齡平均日增重顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01),22～42日齡料重比顯著降低(P<0.05);飼糧添加丁酸梭菌對肉雞平均日采食量無顯著影響(P>0.05)。由此可見,飼糧添加丁酸梭菌可以提高肉雞生長性能,特別是對生長后期提高作用更加明顯。

表3 丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響

2.2 丁酸梭菌對肉雞腸道形態結構的影響

丁酸梭菌對肉雞腸道形態結構的影響如圖1和圖2所示。無論是對照組還是丁酸梭菌組肉雞,其腸道各腸段絨毛結構均較為完整,沒有觀察到明顯的脫落或損傷,絨毛密度也沒有明顯變化。與對照組相比,丁酸梭菌組肉雞十二指腸絨毛高度極顯著提高(P<0.01),回腸隱窩深度顯著降低(P<0.05),回腸和十二指腸絨隱比顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01)。結果表明,飼糧添加丁酸梭菌能夠改善肉雞腸道形態結構。

A:空腸 jejunum;B:回腸 ileum;C:十二指腸 duodenum。

*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.3 丁酸梭菌對肉雞抗氧化能力的影響

丁酸梭菌對肉雞血清抗氧化指標的影響見表4。與對照組相比,丁酸梭菌組肉雞血清T-SOD活性顯著提高(P<0.05),血清MDA含量極顯著降低(P<0.01),其他血清抗氧化指標無顯著差異(P>0.05)。丁酸梭菌對肉雞腸道抗氧化指標的影響見表5。與對照組相比,丁酸梭菌組肉雞空腸T-AOC和回腸T-SOD活性極顯著提高(P<0.01),回腸MDA含量極顯著降低(P<0.01)。結果表明,飼糧添加丁酸梭菌能夠提高肉雞抗氧化能力。

表4 丁酸梭菌對肉雞血清抗氧化指標的影響

表5 丁酸梭菌對肉雞腸道抗氧化指標的影響

丁酸梭菌對肉雞空腸抗氧化相關基因表達的影響如圖3所示。與對照組相比,丁酸梭菌組肉雞空腸中核因子E2相關因子2(Nrf2)、CAT和血紅素氧合酶-1(HO-1)的mRNA相對表達量顯著提高(P<0.05),空腸中超氧化物歧化酶(SOD)和GSH-Px的mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)。

圖3 丁酸梭菌對肉雞空腸抗氧化相關基因表達的影響

2.4 丁酸梭菌對肉雞空腸炎癥相關基因表達的影響

丁酸梭菌對肉雞空腸炎癥相關基因表達的影響如圖4所示。與對照組相比,丁酸梭菌組肉雞空腸中閉合蛋白(occludin)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)和白細胞介素-1β(IL-1β)的mRNA相對表達量均無顯著差異(P>0.05)。結果表明,飼糧添加丁酸梭菌對肉雞空腸炎癥相關基因表達沒有顯著影響。

圖4 丁酸梭菌對肉雞空腸炎癥相關基因表達的影響

3 討 論

3.1 丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響

丁酸梭菌能夠促進益生菌的生成,減少疾病的產生,從而維護宿主健康[8];丁酸梭菌還能夠顯著改善畜禽的生產和飼喂效率,其在腸黏膜中合成的丁酸能夠刺激腸黏膜的增生,提高胃腸的消化能力[9]。本試驗結果表明,飼糧添加丁酸梭菌能夠提高肉雞42日齡體重以及22～42日齡和1～42日齡平均日增重,降低22～42日齡料重比。研究表明,飼糧添加250 mg/kg丁酸梭菌對鵝的生長發育、腸道抗氧化能力和腸道微生物組成均有積極影響[10]。飼糧添加1×109CFU/kg丁酸梭菌能夠改善AA肉雞生長性能和平均日增重[11]。這主要是因為丁酸梭菌能夠產生淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶等,提高有益菌群在腸道中的定植,進一步促進養分的吸收和利用,從而提高了肉雞的生長發育速度[12]。也有研究表明,在飼糧中添加丁酸梭菌后,肉雞的生長發育沒有變化[13]。這可能是由于飼糧類型、肉雞品種和生長階段以及添加劑量不同等原因造成的。

3.2 丁酸梭菌對肉雞腸道形態結構的影響

腸道組織形態是評價腸道健康的重要依據,絨毛高度、隱窩深度和絨隱比反映了機體對營養物質消化和吸收的效率,是衡量腸道功能的重要指標。農斯偉等[14]研究發現,飼糧添加丁酸梭菌有提高廣西黎村黃雞十二指腸、空腸和回腸絨毛高度的趨勢,顯著降低空腸隱窩深度,并顯著提高空腸和回腸絨隱比。李瑩等[12]研究表明,飼糧添加丁酸梭菌能夠顯著提高白羽肉雞十二指腸絨毛高度和絨隱比,顯著降低其隱窩深度,并顯著提高回腸絨毛高度和絨隱比。本試驗結果表明,飼糧添加丁酸梭菌顯著提高了肉雞十二指腸絨毛高以及回腸和十二指腸絨隱比,并顯著降低了回腸隱窩深度。這說明丁酸梭菌能夠通過促進肉雞腸道的發育,保持腸道健康。

3.3 丁酸梭菌對肉雞抗氧化能力的影響

氧化應激是一種普遍存在于生物體中表現為機體活性氧(ROS)升高的現象,能夠引起脂質、蛋白質及DNA等的破壞[15-16]。研究發現,飼糧添加丁酸梭菌能夠顯著提高蛋雞血清T-AOC,降低血清和回腸MDA含量,并提高血清和回腸T-SOD活性[17]。研究還發現,在仔豬飼糧添加丁酸梭菌能夠降低機體的氧化壓力,并使其氧化還原達到均衡狀態[18]。本試驗結果表明,飼糧添加丁酸梭菌顯著提高肉雞血清T-SOD活性、空腸T-AOC和回腸T-SOD活性,顯著降低血清和回腸MDA含量。前人的研究結果也證實了這一結論,在獺兔飼糧中添加1.0×105CFU/g的丁酸梭菌,能夠改善腸道形態結構和抗氧化狀態[19];飼糧添加5×108CFU/g丁酸梭菌可以提高肉雞血清T-SOD活性和T-AOC,降低血清MDA含量[20]。

3.4 丁酸梭菌對肉雞空腸抗氧化和炎癥相關基因表達的影響

在氧化應激反應中,Nrf2作為一個關鍵的轉錄因子,能夠激活下游途徑的抗氧化蛋白,包括HO-1和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)[NAD(P)H],以及刺激具有抗氧化特性蛋白的產生來控制細胞的氧化應激[21]。腸道黏膜屏障作為免疫系統的第一道防線,對維持腸道免疫系統的穩定十分重要[22]。腸道黏膜屏障受損會使腸道菌群發生遷移,從而引發炎癥[23]。occludin作為腸道上皮細胞之間緊密連接的結構蛋白,不僅能夠反映腸道的炎癥程度,而且在腸道黏膜愈合過程中起著至關重要的作用[24-25]。丁酸梭菌可調控腸黏膜微生態及pH,在維持腸黏膜結構及功能方面發揮著重要功能[9]。本研究發現,飼糧添加丁酸梭菌可以顯著提高肉雞空腸中Nrf2、CAT和HO-1的mRNA相對表達量,提高腸道的抗氧化能力,這與以前的研究結果[26]一致。研究表明,丁酸梭菌能夠激活Nrf2信號通路,提高Nrf2、HO-1、SOD和CAT的表達量[27]。不過,丁酸梭菌對空腸中SOD和GSH-Px的mRNA相對表達量無顯著影響,這可能是因為Nrf2路徑對SOD和GSH-Px的調控機制較為復雜,或者需要更長時間才能觀察到丁酸梭菌的影響。盡管如此,本試驗結果仍然突顯了丁酸梭菌對肉雞腸道抗氧化能力的積極效果,且可能是通過激活Nrf2路徑,進一步增強Nrf2、CAT和HO-1的表達實現的。

IL-6和IL-10可以反映機體炎癥水平,炎癥的發生和IL-6的產生會改變許多器官的功能,并導致整個循環系統許多化學反應的發生,包括轉鐵蛋白、纖維蛋白和白蛋白水平的降低[28]。在免疫反應的急性階段,IL-10通過降低促炎癥細胞因子水平和促進組織修復來保護宿主免受組織損傷,從而限制促炎癥反應[29]。在一些物種中,IL-10已被證明是控制宿主防御期間腸道平衡的最有力的抗炎細胞因子之一[30]。本研究發現,飼糧添加丁酸梭菌對肉雞空腸occludin、IL-6、IL-10和IL-1βmRNA相對表達量均無顯著影響,這可能與生長階段和添加的丁酸梭菌數量有關。

4 結 論

① 飼糧添加丁酸梭菌能夠提高肉雞生長性能,特別是對生長后期提高作用更加明顯。

② 飼糧添加丁酸梭菌可以改善肉雞腸道形態結構。

③ 飼糧添加丁酸梭菌可以提高血清T-SOD活性,降低血清MDA含量,并通過Nrf2信號通路提高腸道抗氧化能力。