基于微生物和代謝組學研究葡萄籽原花青素對鵝腸道健康的影響

任繼武 鄧 超 喬君毅 陳哲秀 郝瑞榮*

(1.山西農業大學經濟作物研究所,太原 030031;2.山西農業大學動物科學學院,太谷 030801)

在現代化大規模、高密度圈養條件下,鵝群應激增加,導致腸道組織形態改變、有害菌增殖、消化能力下降、飼料利用率降低、抵抗力下降以及炎癥等胃腸道疾病頻發。腸道是抵御感染的第1道防線,是動物免疫系統的關鍵組成部分,也是微生物定植的重要場所,腸道菌群對調節腸道免疫至關重要。鵝的胃腸道菌群和腸道生理紊亂可能引起免疫反應失調,引發疾病[1]。既往研究表明,腸道菌群失調不僅引起腸道疾病,還會通過增加腸-腎軸中腸源性脂多糖的滲漏,引發鵝的腎損傷和痛風[2]。胃腸道微生物及其代謝產物在鵝腸-腎軸的免疫激活中起著至關重要的作用[3]。因此,調節和維持腸道菌群平衡和內環境穩態可能是減少疾病發生、實現鵝健康養殖的有效措施。

葡萄籽原花青素(grape seed procyanidins,GSPs)是天然多酚類化合物,超強的抗氧化和調節腸道菌群功能使其在保健品領域備受青睞。近年來,其在飼料添加劑領域也引起了重視。已有研究表明,GSPs能夠調節動物腸道菌群,改善內環境穩態[4-5]。本課題組前期針對飼糧添加GSPs對仔豬及生長豬腸道菌群的影響進行了研究,表明GSPs對腸道菌群豐度、多樣性以及菌群組成均有改善作用[6-8]。本課題組前期對鵝的研究還表明,飼糧添加GSPs對鵝生長性能沒有顯著影響[9],但對腸道抗氧化的提升作用毋庸置疑[10]。在前期研究基礎上,本試驗擬進一步基于細菌基因組和代謝組學方法,探討飼糧添加GSPs對鵝盲腸菌群、代謝物及組織形態的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取35日齡健康且體重相近的四川白鵝144只,隨機分為4個組,每組6個重復,每個重復6只鵝。對照組飼喂基礎飼糧;3個GSPs添加組分別在基礎飼糧中添加50、100和150 mg/kg GSPs。預試期7 d,正試期21 d。

試驗在山西農業大學經濟作物研究所進行,動物試驗由山西農業大學實驗動物倫理委員會審核通過(許可證號:SXAU-EAW-2021G0305001)。試驗所用GSPs純度為95%,含79.28%的低聚原花青素?；A飼糧參照NRC(1994)鵝的營養需要配制,其組成及營養水平見表1。飼糧中粗蛋白質、鈣和粗纖維含量分別參照GB/T 6432—2018、GB/T 6436—2018和GB/T 6434—2006方法測定。飼糧營養水平計算公式如下:

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

某營養水平=∑每種原料該營養成分含量×飼糧中原料所占百分比。

1.2 樣品的采集

在63日齡時,每個重復隨機選取1只鵝,經二氧化碳麻醉后,通過頸椎脫臼安樂致死。采集盲腸內容物,于-80 ℃低溫保存,用于測定盲腸菌群以及代謝物和短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)含量。分離并截取盲腸中段組織約1 cm,使用生理鹽水浸泡并沖洗腸道內容物,并用多聚甲醛固定,進行組織形態學分析。

1.3 盲腸組織形態學分析

固定液中的樣品保存6～8 h后,取出盲腸組織,流水沖洗12～24 h,待固定液洗凈后經酒精梯度脫水并經透明、浸蠟、包埋、切片和蘇木精-伊紅(HE)染色,隨后用蓋玻片以及中性樹膠封存,使用ImageView軟件進行觀察及圖像截取。

1.4 盲腸微生物16S rDNA分析

使用MagPure Soil DNA LQ Kit分離盲腸內容物細菌DNA。使用NanoDrop 2000分光光度計測量DNA的濃度,并通過瓊脂糖凝膠電泳確定DNA的質量。采用正向引物343F(5′-TACGGRAGGCAGCAGC-3′)和反向引物798R(5′-AGGGTATCTAATCCT-3′)PCR擴增細菌16S rDNA基因V3～V4高變區。PCR擴增程序參考文獻[1]。PCR擴增產物純化后,使用Qubit進行濃度檢測,在Illumina NovaSeq 6000(Illumina Inc.,美國)上測序。

微生物原始序列使用Trimmomatic(version 0.35)和FLASH(version 1.2.11)軟件處理。利用Vsearch(version 2.4.2)軟件將序列聚類為相似度≥97%的多個操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)。利用QIIME選擇每個OTU的所有代表性序列,輸入Silva數據庫(version 138),用RDP分類器(version 2.2)軟件進行比較和注釋。

1.5 氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)代謝組學分析

取盲腸內容物60 mg于1.5 mL EP管內,與20 μL標準溶液(0.3 mg/mLL-2-氯-苯丙氨酸,甲醇制)和360 μL甲醇∶水混合物(4∶1,體積比)混合,于-20 ℃靜置2 min,研磨(60 Hz,2 min);加入200 μL氯仿、400 μL水,渦旋2 min,冰水浴超聲提取30 min;于-20 ℃下靜置30 min后離心10 min(13 000 r/min,4 ℃)。取150 mL上清液于玻璃衍生小瓶,在冷凍濃縮離心干燥器中干燥。質控樣本(QC)由所有樣本的提取液等體積混合制備而成,加入80 μL甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液(15 mg/mL),渦旋振蕩2 min后,于37 ℃振蕩培養箱中孵育90 min,進行肟化反應。然后加入50 μL雙(三甲基硅烷基)氟乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷)、20 μL正己烷、10 μL內標,渦旋振蕩2 min后,于70 ℃反應60 min,室溫放置30 min,進行GC-MS代謝組學分析。

代謝組學分析使用Agilent 7890B氣相色譜系統和Agilent 5977A MSD系統進行(Agilent,美國)。采用DB-5MS融合硅膠毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)進行色譜分離。載氣為高純氦氣,流速1 mL/min;進樣器溫度為260 ℃;初始溫度為60 ℃,保持0.5 min,依次以8 ℃/min升溫至125 ℃、5 ℃/min升溫至210 ℃、10 ℃/min升溫至270 ℃、20 ℃/min升溫至305 ℃,保持5 min。設置質譜四極桿和離子源(電子撞擊)溫度分別為150和230 ℃,碰撞能量為70 eV,掃描范圍為質荷比(m/z)50～500。

1.6 盲腸內容物SCFAs含量的測定

盲腸內容物中SCFAs,包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸,采用氣相色譜法按照文獻[8]的方法進行測定,色譜條件為:初始溫度70 ℃,進樣溫度和檢測器溫度設置為220 ℃;載氣為氫氣,流速30 mL/min。

1.7 數據統計與分析

通過QIIME計算樣本生境內多樣性指數,采用Tukey’s HSD檢驗和Kruskal-Wallis H檢驗分析樣本組間α指數的差異;通過R項目中Unweighted Unifrac距離度量進行主坐標分析(principal coordinates analysis,PCoA);通過R項目中Adonis(也稱Permanova,變量的排列多元分析)評估樣本生境間多樣性的差異;采用單因素方差分析判定組間差異。分別以P<0.05和P<0.01為差異顯著和極顯著。采用Two-tailed Student’sT檢驗,分析并篩選差異顯著的組間代謝物[變量投影重要性(VIP)>1,P<0.05],使用京都基因與基因組百科全書(KEGG)數據庫(https://www.kegg.jp/)對所選的差異代謝物進行富集。采用SPSS 26.0統計軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏多重比較法分析鵝飼糧中添加GSPs對于盲腸組織形態及SCFAs含量的作用效果,采用正交多項式法分析GSPs水平的線性和二次效應。P<0.05為差異顯著,結果用平均值和均值標準誤表示。

2 結 果

2.1 飼糧添加GSPs對鵝盲腸組織形態的影響

如圖1所示,飼糧添加GSPs對鵝盲腸腸絨毛密度無明顯影響;測量腸絨毛高度及隱窩深度得到的結果見表2,相比于對照組,50 mg/kg GSPs添加組鵝盲腸絨毛高度顯著提高(P<0.05),飼糧添加不同水平GSPs對盲腸隱窩深度及絨毛高度/隱窩深度(V/C)值無顯著影響(P>0.05)。

圖A、圖B、圖C和圖D分別代表對照組以及50、100和150 mg/kg GSPs添加組。

表2 飼糧添加GSPs對鵝盲腸組織形態的影響

2.2 飼糧添加GSPs對鵝盲腸菌群的影響

2.2.1 盲腸菌群生境內多樣性分析

盲腸菌群生境內多樣性分析如圖2所示。與對照組相比,飼糧添加GSPs顯著或極顯著提高了鵝盲腸菌群Chao1指數和可觀測物種(observed_species)數(P<0.05或P<0.01),顯示出豐富的微生物群落;飼糧添加GSPs顯著提高了盲腸菌群PD_whole_tree值(P<0.05);飼糧添加50和100 mg/kg GSPs顯著或極顯著提高了盲腸菌群Shannon指數(P<0.05或P<0.01),表明盲腸菌群豐富度增加。在本研究中,各組Good’s覆蓋度均大于0.986,表明測序的覆蓋率較高。

0 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg和150 mg/kg分別代表對照組以及50、100和150 mg/kg GSPs添加組。下圖同。0 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg and 150 mg/kg represented control group, 50, 100 and 150 mg/kg GSPs supplemental groups, respectively. The same as below.

2.2.2 盲腸菌群生境間多樣性分析

采用PCoA和非度量多維尺度(non-metric multidimensional scaling,NMDS)分析對生境間多樣性進行評價,結果如圖3所示。以群落為單位進行評估,空間距離越大說明群落的組間差異性越大。3個GSPs添加組與對照組的盲腸菌群在X軸上均有不同程度的分離,說明飼糧添加GSPs后,鵝盲腸菌群組成發生了有效的變化[在X軸上的可信度:主坐標1(PCo1)=84.53%,NMDS分析的應力(stress)值=0.011 7]。

圖3 生境間多樣性分析

2.2.3 盲腸菌群組成分析

在門、科以及屬水平上測得的鵝盲腸菌群組成如圖4所示。在門水平上(圖4-A),厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota)為優勢菌門。與對照組相比,各GSPs添加組盲腸厚壁菌門相對豐度提高,盲腸擬桿菌門相對豐度降低;100和150 mg/kg GSPs添加組盲腸變形菌門(Proteobacteria)相對豐度降低。在科水平上(圖4-B),與對照組相比,飼糧添加GSPs提高了盲腸瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、梭菌UCG-014(Clostridia_UCG-014)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)和產糞甾醇真細菌群([Eubacterium]_coprostanoligenes_group)的相對豐度,降低了顫螺菌科(Oscillospiraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)和擬桿菌科(Bacteroidaceae)的相對豐度。在屬水平上(圖4-C),擬桿菌屬(Bacteroides)、梭菌UCG-014、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、梭菌vadinBB60群(Clostridia_vadinBB60_group)、產糞甾醇真細菌群和糞桿菌屬(Faecalibacterium)是鵝盲腸內容物中的優勢菌屬。與對照組相比,飼糧添加GSPs提高了盲腸梭菌UCG-014相對豐度,降低了擬桿菌屬相對豐度;飼糧添加50和100 mg/kg GSPs提高了盲腸產糞甾醇真細菌群和糞桿菌屬的相對豐度。

A:門水平菌群組成;B:科水平菌群組成;C:屬水平菌群組成。圖C中點越大表明菌屬相對豐度越高。A: microbial composition at phylum level; B: microbial composition at family level; C: microbial composition at genus level. Larger dots in Fig.C indicated higher relative abundance of genus.

2.3 飼糧添加GSPs對鵝盲腸代謝物的影響

2.3.1 盲腸代謝物正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)

如圖5所示,OPLS-DA結果表明,3個GSPs添加組樣本與對照組樣本在橫坐標軸上呈現的距離均比較遠,GSPs添加組與對照組明顯分離,表明GSPs添加組與對照組間代謝物成分差異顯著(P<0.05)。圖5-D呈現了各GSPs添加組與對照組之間的盲腸差異代謝物數量,50、100和150 mg/kg GSPs添加組與對照組之間的差異代謝物數量分別為23、18和36種。

A:50 mg/kg GSPs添加組與對照組;B:100 mg/kg GSPs添加組與對照組;C:150 mg/kg GSPs添加組與對照組;D:各GSPs添加組與對照組差異代謝物統計圖。

2.3.2 盲腸差異代謝物聚類分析

盲腸差異代謝物聚類分析如圖6所示。50、100和150 mg/kg GSPs添加組與對照組之間的共有差異代謝物為亞精胺。與對照組相比,50、100和150 mg/kg GSPs添加組亞精胺表達豐度顯著下調(P<0.05);100和150 mg/kg GSPs添加組羥基丙酸、閃白酸和L-丙氨酸表達豐度顯著下調(P<0.05),戊二酸和3,7,11-三甲基-3,4-二羥基十二烷酸表達豐度顯著上調(P<0.05)。

A:50 mg/kg GSPs添加組與對照組;B:100 mg/kg GSPs添加組與對照組;C:150 mg/kg GSPs添加組與對照組。圖7同。A: 50 mg/kg GSPs supplemental group vs control group; B: 100 mg/kg GSPs supplemental group vs control group; C: 150 mg/kg GSPs supplemental group vs control group. The same as Fig.7.

2.3.3 盲腸代謝物KEGG代謝通路富集分析

盲腸代謝物KEGG代謝途徑富集分析如圖7所示。50 mg/kg GSPs添加組對比對照組極顯著富集的代謝通路為β-丙氨酸代謝和ABC轉運體(P<0.01),100 mg/kg GSPs添加組對比對照組極顯著富集的代謝通路為β-丙氨酸代謝和以及精氨酸和脯氨酸代謝(P<0.01),150 mg/kg GSPs添加組對比對照組極顯著富集的代謝通路為丙酸鹽代謝、β-丙氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝以及ABC轉運體(P<0.01);3個GSPs添加組與對照組之間共有的代謝通路為β-丙氨酸代謝。

富集評分越高,富集程度越大;顏色由藍到紅表示P值依次降低;點越大,說明富集到該通路上的代謝物數目越多。The higher the enrichment score, the higher the enrichment degree. The color from blue to red indicated that the P-value was decreased in turn. The larger the dot, the greater the number of metabolites enriched to the pathway.

2.3.4 飼糧添加GSPs對鵝盲腸SCFAs含量的影響

飼糧添加GSPs對鵝盲腸SCFAs含量的影響如圖8所示。與對照組相比,飼糧添加GSPs顯著提高盲腸乙酸和丙酸含量(P<0.05),飼糧添加50和100 mg/kg GSPs顯著提高盲腸丁酸含量(P<0.05);隨著飼糧GSPs添加水平的提高,盲腸乙酸、丙酸和丁酸含量呈線性和二次變化(P<0.05)。

同一組數據柱標有不同字母表示差異顯著(P<0.05),無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 飼糧添加GSPs對鵝盲腸組織形態的影響

在現代高密度集約化養殖模式下,應激或腸道代謝紊亂是鵝生產中普遍存在的問題,通常會導致免疫力下降、抗氧化能力減弱、腸黏膜受損以及腸道微生物多樣性降低。腸道抗氧化性能直接影響腸道內環境穩態和抵抗應激的能力。本課題組前期的研究已經證實,飼糧添加GSPs對鵝腸道抗氧化有顯著的促進作用[10],同時還表明GSPs有助于維持腸道上皮的緊密連接,抑制二胺氧化酶、D-乳酸和內毒素等物質從腸道進入外周循環[1]。在本研究中,與對照組相比,50 mg/kg GSPs添加組鵝盲腸絨毛高度顯著提高,這進一步表明GSPs對于改善盲腸組織形態有一定的積極作用。

3.2 飼糧添加GSPs對鵝盲腸菌群的影響

飼糧中只有少量GSPs可以通過小腸被吸收進入循環系統,大部分未被消化的GSPs或Ⅱ相代謝產物則進入大腸,在腸道微生物的作用下發生芳香環裂變、去羥基化以及去酯化等一系列復雜反應[11]。因此,腸道菌群對GSPs等多酚類物質在體內的生物轉化、吸收、代謝和生理活動具有重要意義。此外,GSPs及其代謝產物對微生物區系的豐富度和組成也會產生一系列積極影響。這表明GSPs與腸道微生物互惠互利,共同維持大腸健康。

腸道菌群多樣性和豐富度與腸道健康有關,豐富的微生物種類通常有利于腸道的調節。盲腸菌群中的Good’s覆蓋度顯示了樣本的測序深度,其值越接近1,說明測序結果越全面,結果越可靠,在本研究中,各組Good’s覆蓋度均大于0.986,說明測序結果可靠。Chao1指數和可觀測物種數反映樣品中群落的豐富度,數值越大,說明樣品中物種越豐富。Shannon指數、Simpson指數以及PD_whole_tree值反映群落的多樣性,受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響。本研究表明,飼糧添加GSPs提高了鵝盲腸菌群多樣性及豐富度。一些有益細菌參與生物功能,如產生消化酶,通過增加白細胞活性來增強免疫力,甚至為身體提供必要的維生素和氨基酸[12]。相反,有害細菌會產生毒素,侵入腸道,影響腸道和機體的正常功能。有害細菌的增殖也會導致生態失調、真菌感染和炎癥。既往研究表明,GSPs可以調節動物腸道菌群,加強黏膜屏障,改善腸道功能[4]。本試驗結果表明,飼糧添加GSPs可提高鵝盲腸中厚壁菌門的相對豐度,降低盲腸中擬桿菌門的相對豐度。厚壁菌門大多數屬有益菌,主要在腸道纖維降解發酵過程中產生SCFAs。SCFAs能夠促進有益細菌增殖,為腸道提供弱酸性環境,對部分致病菌有抑制作用。同樣的,Li等[13]的研究也表明,多酚作用于動物腸道時,可以顯著提高厚壁菌門的相對豐度,降低擬桿菌門相對豐度。此外,本研究還表明,飼糧添加100和150 mg/kg GSPs還可以顯著降低鵝盲腸變形菌門相對豐度,變形菌門均屬于革蘭氏陰性菌,包含很多病原菌種類,如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌和幽門螺桿菌等,這些菌種是胃腸道疾病的重要致病因素。在屬水平上,飼糧添加GSPs顯著降低了鵝盲腸中擬桿菌屬的相對豐度,提高了盲腸中梭菌UCG-014、產糞甾醇真細菌群和糞桿菌屬的相對豐度。擬桿菌屬相對豐度的升高與小鼠腸道炎癥、胃腸道功能紊亂有關[14-15]。梭菌UCG-014、產糞甾醇真細菌群和糞桿菌屬已被認為能夠不同程度地促進動物機體健康。其中,梭菌UCG-014是一種與色氨酸代謝相關的有益菌,產糞甾醇真細菌群通過其代謝產物鞘氨醇改善由高脂肪飲食引起的血脂異常,該代謝產物位于糖-鞘氨脂生物合成途徑的上游[16]?；啬c鞘脂合成的增加可以激活鵝腸道上皮細胞的增殖和腸絨毛的生長,維持腸道結構的完整性[17]。綜上所述,飼糧添加GSPs可以通過增加鵝腸道菌群多樣性,調節菌群組成,增加部分有益菌的豐度,改善鵝腸道環境,增強鵝腸道功能。

3.3 飼糧添加GSPs對鵝盲腸代謝物的影響

大多數食物中的GSPs由于在小腸中不能被消化,進入大腸后在那里通過微生物發酵轉化為代謝物[18]。少數代謝產物可以直接影響動物,而大多數代謝產物通過參與代謝和合成過程,間接影響機體的調節。在本研究中,飼糧添加不同水平的GSPs后,上調鵝盲腸的差異代謝物主要為有機酸及其衍生物,3個GSPs添加組盲腸亞精胺表達豐度顯著下調。亞精胺是精氨酸和脯氨酸代謝過程中的關鍵物質,由精胺氧化酶催化精胺產生,與精胺和腐胺同屬于多胺類;多胺可以誘導活性氧(reactive oxygen species,ROS)的聚集,降低細胞內還原型谷胱甘肽的含量,誘導RNA損傷和凋亡[19-20],且過量的ROS是體內氧化應激的主要原因。因此,亞精胺的下調可以減少ROS的產生,降低機體氧化損傷。KEGG代謝通路分析表明,GSPs可能通過β-丙氨酸代謝以及精氨酸和脯氨酸代謝影響鵝腸道健康。

棲息在鵝盲腸的微生物可以將小腸中未消化的食糜分解成對機體有用的營養物質,如SCFAs,降低腸道pH,抑制致病菌的生長[21],并減少脂多糖向細胞的轉運,從而削弱致病菌對機體的影響[22]。乙酸被認為是一種抗炎物質,有助于維持腸道穩態;丙酸可以調節肝臟膽固醇的合成[23-24];丁酸通過激活單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK),抑制核因子-κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子-α等炎癥介質,提高緊密連接蛋白基因表達,增強腸道屏障功能[24]。在本研究中,飼喂飼糧添加GSPs的鵝盲腸中乙酸、丙酸和丁酸含量提高。因此,GSPs通過提高產生SCFAs的細菌的豐度和降低分泌內毒素的細菌的豐度,對腸道產生直接的有益影響或調節腸道微生物群落組成。

4 結 論

本試驗結果表明,飼糧添加GSPs可通過提高鵝盲腸菌群的多樣性和豐富度,促進有益細菌(如梭菌UCG-014、產糞甾醇真細菌群和糞桿菌屬)的增殖,提高盲腸乙酸、丙酸和丁酸含量,并通過β-丙氨酸代謝以及精氨酸和脯氨酸代謝改善鵝腸道健康。