驢脂肪酸去飽和酶2基因克隆及組織表達規律的研究

黃 飛 杜心怡 劉桂芹 王長法 周苗苗

(聊城大學農學與農業工程學院,毛驢高效繁育與生態飼養研究院,聊城 252000)

脂肪酸去飽和酶2(fatty acid desaturase 2,FADS2)是脂肪酸去飽和酶家族成員之一,是多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)合成代謝途徑中關鍵的限速酶[1]。眾多研究表明,FADS2在脂肪酸代謝過程中發揮重要作用。歐小倩等[2]研究發現,FADS2能調節雞肉中不飽和脂肪酸含量,進而影響雞肉的品質和風味。陳興勇等[3]研究發現,育肥期皖西白鵝肝臟中FADS2基因相對表達量上升伴隨著肌肉中單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)含量的增加和不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)/飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)比值的上升。馬小婭等[4]研究發現,FADS2可以調控奶牛乳腺上皮細胞中脂質的合成,干擾或過表達FADS2基因均可降低奶牛乳腺細胞中甘油三酯的含量。王夢琦等[5]研究了中國荷斯坦牛FADS2基因c.908 C>T突變對泌乳性能和乳中脂肪酸組成的影響,結果發現FADS2基因編碼區c.908 C>T有CC、CT和TT 3種基因型,其中TT基因型具有較高的日產奶量、總固體和C16∶1含量及C16和C18不飽和指數。鄔嬌等[6]研究了原代奶山羊乳腺上皮細胞中PUFAs及其衍生物合成的代謝調控,結果發現FADS2能夠調控奶山羊乳腺中PUFAs合成及甘油三酯代謝。此外,很多研究證實FADS2參與了魚[7-10]、豬[11-13]、豚鼠[14]等動物體內的脂肪酸代謝調控。亦有研究表明,FADS2與人肥胖、胰島素抵抗和皮膚病等疾病有關[1]。

驢肉中的SFAs含量較低,PUFAs含量較高,營養指標優于傳統的牛肉和豬肉[15]。驢乳脂肪酸組成也主要以UFAs為主,含量高達62.9%,其中C18∶2與C18∶3的含量約占24%,與人乳和牛乳分別占8%和4%相比,驢乳的脂肪酸組成是比較理想的[16];此外,驢乳中乳脂共軛亞油酸含量高,具有抗腫瘤、抗氧化等功效[17]。目前關于驢UFAs合成調控方面的研究較少,鑒于此,本研究擬通過設計驢FADS2基因引物,PCR克隆得到其CDS序列,進行生物信息學分析并檢測其在驢不同組織中的相對表達量,初步探討FADS2在驢UFAs合成中的作用,旨在為進一步研究驢UFAs的合成調控機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本采集

選取4頭健康的德州驢母驢,屠宰后采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、乳腺和皮下脂肪,液氮速凍,-80 ℃冷凍保存。

1.1.2 主要試劑

Trizol試劑、Lipofectamine 3000、pcDNA3.1/Myc-His 載體,購自美國 Invitrogen公司;PrimeScript?RT反轉錄試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態細胞,購自TaKaRa公司;Pfu高保真聚合酶,購自北京Transgen Biotech公司;膠回收試劑盒,購自廣州Magen公司;EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶,購自Bio-Lab公司;胎牛血清,購自杭州四季青生物工程材料有限公司;Ham’s F12培養液,購自美國Gibco公司;細胞裂解液,購自瑞士Roche公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取和全長cDNA克隆

Trizol法提取驢肝臟總RNA。PrimeScript?RT反轉錄試劑盒合成cDNA。使用高保真酶以FADS2基因的cDNA為模板擴增;PCR引物見表1,本試驗所用PCR反應體系總體積為50 μL:5×Buffer 10 μL、脫氧核糖核苷三磷酸(2.5 mmol/L)4 μL、上游引物(10 μmol/L)1.5 μL、下游引物(10 μmol/L)1.5 μL、酶(2.5 U/μL)0.5 μL、模板2.0 μL、雙蒸水30.5 μL。PCR反應條件為:98 ℃ 10 s→55 ℃ 5 s→72 ℃ 1.75 min(擴增35個循環)→72 ℃ 5 min。PCR產物在電泳檢測后,用膠回收試劑盒(Magen)回收并純化目的產物。膠回收產物連接克隆載體pTOPO-Blunt cloning kit(CV16)轉化DH5α感受態細胞,涂布于含100 μg/mL的氨芐青霉素LB平板于37 ℃培養過夜后,挑取陽性菌落PCR鑒定,并交由公司測序。

1.2.2 FADS2生物信息學分析

通過ORF Finder推導氨基酸序列;利用計算機pI/Mw工具(ExPASy Proteomics Server)、NetNglyc、NetPhos等在線預測工具,預測FADS2蛋白的分子質量、理論等電點、二級結構、跨膜區等,生物信息學分析見表2;通過Clustalx、DNAstar等工具對FADS2基因編碼區進行多重比對和同源性分析,再利用MEGA11構建系統進化樹[18]。

表2 生物信息學分析

1.2.3FADS2基因組織表達分析

Trizol法分別提取各組織的總RNA,參考文獻[19]中操作流程,取1 mg RNA,用Prime Script?RT試劑盒合成cDNA。然后用SYBR?TrimeScriptTM試劑盒在ABI 7500上測定FADS2基因相對表達量。RT-qPCR反應體系為20 μL。PCR引物序列見表1。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參,采用2-△△Ct的方法計算FADS2基因相對表達量[20-21]。每個樣品重復3次,超純水替代樣品做陰性對照。

1.3 統計與分析

本研究所有數據用SAS 9.2進行分析,2組數據間比較采用t檢驗,多組數據間采用單因素方差分析,數據用柱狀圖表示,誤差線為標準差。當P<0.05時認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 FADS2基因的提取及克隆

Trizol法提取驢肝臟組織總RNA,RNA電泳圖見圖1-a。PCR特異性擴增FADS2基因,然后將PCR擴增產物進行電泳檢測并回收。目的基因進行PCR后,進行瓊脂糖凝膠電泳,可見1條約1 500 bp大小的條帶(圖1-b)。重組后菌液PCR產物電泳結果如圖1-c。

a:1為Marker DL2000,2為FADS2 RNA;b:1為Marker DL2000,2～4為FADS2擴增產物;c:1為Marker DL2000,2～4為FADS2菌液PCR結果。

2.2 生物信息學分析

2.2.1FADS2基因序列同源性比對及系統進化樹分析

經測序驗證成功擴增FADS2基因。序列比對分析表明FADS2的開放閱讀框為1 335 bp,可編碼444個氨基酸殘基組成的多肽鏈(圖2)。首先,運用DNASTAR中的MegAlign軟件將驢FADS2基因與GenBank中豬(Susscrofa,登錄號:NM_001171750.1)、大鼠(Rattusnorvegicus,登錄號:NM_031344.2)、狗(Canislupusfamiliaris,登錄號:XM_014120904.3)、馬(Equuscaballus,登錄號:XM_023654186.1)、綿羊(Ovisaries,登錄號:XM_015103138.3)、牛(Bostaurus,登錄號:XM_015461240.2)、人(Homosapiens,登錄號:NM_004265.4)、小鼠(Musmusculus,登錄號:NM_019699.2)序列進行同源比對,結果如圖3所示。運用MEGA11生成的驢FADS2基因編碼序列與不同動物FADS2基因序列構建的系統進化樹如圖4所示。

圖2 驢FADS2基因CDS及對應氨基酸序列

圖3 驢與8個物種FADS2基因編碼序列同源性比對

圖4 基于不同動物FADS2的氨基酸序列的系統進化樹

2.2.2 FADS2蛋白理化性質及親/疏水性表達分析

利用ProtParam軟件對FADS2蛋白進行預測,得出其分子式為C2451H3614N638O625S13;分子質量為52.43 ku;脂肪族指數為85;帶負電荷殘基總數(色氨酸、谷氨酸)為43個;帶正電荷殘基(精氨酸、賴氨酸)總數為45個;等電點為8.29,屬于堿性蛋白;不穩定指數37.22,基因編碼產物不穩定指數小于40,表明該基因編碼產物穩定[22],屬于穩定蛋白。氨基酸組成分析結果顯示,FADS2蛋白含有20種氨基酸,其中占比最高的是亮氨酸(Leu),占9.0%;其次是苯丙氨酸(Phe),占7.9%;最低的是半胱氨酸(Cys),僅占0.5%。

利用ProScale分析驢FADS2蛋白親/疏水性,發現在該蛋白質138位點上存在最大疏水值3.1;在102位點上存在最小疏水值-2.7(親水);疏水性平均值為-0.231,屬于親水蛋白質(圖5)。

圖5 FADS2蛋白疏水性分析

2.2.3 FADS2蛋白二級結構及二硫鍵預測

通過NovoPro在線工具預測FADS2蛋白二級結構,發現FADS2蛋白二級結構中有230個α-螺旋(Hh)、47個β-折疊(Ee)和167個無規則卷曲(Cc),占比分別為51.80%、10.59%和37.61%(圖6)。利用SCRATCH Protein Predictor在線工具預測,FADS2蛋白存在2個Cys和1個二硫鍵。二硫鍵的位置可能在蛋白質的364和407個氨基酸殘基之間,可知2個Cys也分別位于肽鏈的364和407位置。

圖6 FADS2蛋白二級結構預測

2.2.4 FADS2蛋白修飾位點預測

通過NetNGlyc 1.0、NetPhos 3.1預測驢FADS2蛋白糖基化修飾位點和磷酸化位點。發現在第45位氨基酸處存在N-糖基化位點,存在的可能性高達0.798 8;預測FADS2蛋白磷酸化位點結果顯示FADS2蛋白有14個絲氨酸(Ser)、10個蘇氨酸(Thr)和2個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點,共26個。

2.3 FADS2基因組織表達分析

通過實時熒光定量PCR技術檢測驢8個組織中FADS2基因相對表達量,發現在所有被檢測組織中均檢測到了FADS2基因。其中脂肪和乳腺組織中相對表達量最高,顯著高于肺臟、腎臟、心臟、肝臟和肌肉組織(P<0.05);肝臟中FADS2基因相對表達量較低,僅顯著高于肌肉組織(P<0.05)(圖7)。

數據柱標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

FADS2是合成PUFAs過程中的第1個限速酶,在PUFAs的合成調控中起關鍵作用[23]。有研究表明,在高能量飼糧中添加藻類,可以通過上調FADS2等脂質代謝相關基因表達增加綿羊肝臟和肌肉中PUFA的含量[24]。給奶牛飼喂含有魚油或微藻類飼糧,則下調了FADS2基因表達,降低了脂肪酸去飽和酶活性,最終降低了乳中UFAs的含量[25]。Huang等[26]研究表明,在山羊乳腺上皮細胞中miR-145通過調節FADS2等基因表達量來降低或升高UFAs比例,從而改善羊奶品質。Shi等[27]在山羊乳腺上皮細胞中的研究表明,抑制FADS2基因的表達,可以降低16碳UFAs的含量。另有研究表明,FADS2缺失會顯著降低斑馬魚脂肪酸的去飽和作用,FADS2是高UFA合成過程中的必需酶[28]。

驢脂肪具有UFAs含量高的特點[15,29],但目前關于其形成機理研究較少。鑒于此,本試驗進行了驢FADS2基因克隆及組織表達規律研究,結果發現,驢FADS2基因CDS長1 335 bp,可編碼444個氨基酸,蛋白質分子質量為52.43 ku,等電點為8.29,不穩定指數為37.22,疏水性總平均值為-0.231,屬于穩定堿性親水蛋白?，F有研究表明,FADS2基因在人、牛、水牛、小鼠、火雞、雞、瓦氏黃顙魚、鱸魚和山羊中普遍存在,在蜥蜴和腔棘魚中不存在或尚未被注釋[6,11,24-25,30-32]。覃川杰等[30]研究表明,瓦氏黃顙魚FADS2 cDNA片段長2 041 bp,編碼447個氨基酸。鄔嬌等[6]研究發現,在奶山羊中FADS2基因可編碼443個氨基酸,比驢中少編碼1個氨基酸;Geay等[9]研究發現,在歐亞鱸魚中FADS2基因則可編碼445個氨基酸;Li等[33]研究發現,人FADS2蛋白分子質量52.2 ku,比驢少230 u;在水牛中,馬小婭等[34]研究發現,FADS2蛋白的分子質量比驢多80 u。

組織表達研究結果發現,在所有檢測驢組織中均有FADS2基因表達,其相對表達量從高到低依次為脂肪、乳腺、脾臟、肺臟、腎臟、心臟、肝臟和肌肉。已有研究表明,FADS2表達受組織類型、生長周期、飼糧和激素等眾多因素的影響。在奶牛中,泌乳期不同,FADS2表達量不同[35]。覃川杰等[30]研究發現,FADS2在瓦氏黃顙魚腦和肝臟的表達量最高,顯著高于腸道、脾臟、腎臟和鰓等組織。張丁丁等[31]研究亦發現,FADS2在雞肝臟中的表達水平最高,在腎臟中的表達水平相對較高。Geay等[9]研究表明,在歐亞鱸魚中FADS2主要在肝臟中表達。上述研究認為具有合成高UFAs的關鍵酶FADS2在肝臟中表達較高,這與肝臟為合成高UFAs的主要場所相符[30]。但是與上述研究結果不同,驢肝臟中FADS2相對表達量較低。推測其原因可能是受飼糧等其他因素的影響,具體分子機制有待進一步研究。本研究中,FADS2在驢脂肪和乳腺組織中相對表達量最高,提示驢脂肪和乳腺是合成高UFAs的主要場所。眾多研究表明,驢脂肪和乳脂中UFAs含量較高,本研究結果表明,FADS2在驢脂肪和乳腺等組織脂肪酸代謝過程中可能發揮重要作用。

4 結 論

① 本試驗成功擴增出驢FADS2基因,序列分析表明FADS2基因的開放閱讀框為1 335 bp,可編碼444個氨基酸殘基組成的多肽鏈。

② 研究證實,FADS2基因在驢組織中普遍表達,其相對表達量從高到低依次為脂肪、乳腺、脾臟、肺臟、腎臟、心臟、肝臟和肌肉。