夏威夷果青皮發酵菌株的篩選及其對發酵后飼用價值的改善作用

黃海波 王永亮 李步豪 張成功 唐雄卓,2 譚碧娥,2 印遇龍,2,3 張 琛,2* 蔣 謙,2*

(1.湖南農業大學動物科學技術學院,動物營養基因組與種質創新研究中心,長沙 410128;2.云南循環農業產業研究院,普洱 665000;3.中國科學院亞熱帶農業生態研究所,長沙 410125)

夏威夷果即澳洲堅果,屬山龍眼科澳洲堅果屬[1],是南亞熱帶常綠喬木的果實。因其果仁營養豐富、口感香脆,深受消費者青睞,具有較高的經濟價值,在我國西南地區廣泛種植。根據農業農村部農墾局的統計,到2020年,我國夏威夷果種植面積達到266 133 hm2,占全球種植面積的60.9%,單位面積產量為1 185.00 kg/hm2[2]。夏威夷果青皮(macadamia green peel,MGP)是果殼外部的綠色表皮,是夏威夷果加工過程中的農業副產物,占鮮果重量的1/2,結合夏威夷果種植面積與產量推算,MGP的年產量可達15.8萬t,作為農業垃圾的MGP產量巨大。

研究表明,MGP中含有(18.36±0.32) mg/g的酚類物質和4.70～9.96 mg/g的黃酮[3-4],以及熊果苷、豆腐果苷、對羥基甲醇等多種活性物質[5-6],具有較強的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2′-聯氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)自由基清除能力以及抗氧化能力[7],其總抗氧化能力約為Trolox(水溶性維生素E)的1.7倍[4]。此外,MGP中含有5.04%～9.21%的粗蛋白質、0.9%～3.7%的可溶性糖[8],可作為一種潛在抗氧化型非常規飼料資源,緩解我國人畜爭糧的尷尬處境。然而,MGP中含有單寧(1.06%～2.16%)、蜀黍苷(1.34～5.74 mg/g)等抗營養成分和大量纖維素[8-9],嚴重限制了其在養殖生產中的應用,使得大量的MGP被視為農業廢棄物被直接丟棄或者露天堆肥,這不僅造成了環境污染,更造成了資源的浪費。

近年來,乳酸菌發酵技術由于在處理非常規飼料資源方面具有獨特優勢,受到飼料行業研究人員的高度關注。Roger等[10]研究發現,利用植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)A6和發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)N33發酵,可使玉米糊中的單寧含量分別減少98.8%和97.9%。馬靜靜等[11]研究發現,經復合乳酸菌SFC-2發酵處理,木薯渣中氰化物含量最多可減少49.68%。Odey等[12]研究發現,微生物發酵顯著降低了木薯中氰化物含量,并賦予產品獨特的香氣。但目前關于乳酸菌發酵MGP的研究鮮有報道。研究表明,MGP中的單寧具有廣譜抑菌性,對乳酸菌、枯草芽孢桿菌等發酵菌種具有抑制作用,且對革蘭氏陽性菌的抑制作用強于革蘭氏陰性菌[13],適用于發酵MGP的乳酸菌更無報道。因此,本試驗旨在選育適于MGP發酵的乳酸菌,并對其生物特性及其對MGP的發酵品質進行研究,以期為非常規飼料原料的生物發酵提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和菌株分離

采集新鮮的MGP(采自我國云南省瀾滄縣,22°33′N、99°55′E)。將樣品粉碎至約20 mm2,將10 g樣品與90 mL無菌生理鹽水(8.50 g/L NaCl)混合,37 ℃培養48 h,充分振蕩并吸取懸浮液,采用稀釋涂布法,涂布于MRS固體培養基上,在37 ℃厭氧條件下培養1～3 d。待菌落長出后,挑取單菌落進行分離純化。

1.2 菌株的鑒定

根據Kozaki等[14]的方法對純化的菌株進行形態學和生理生化鑒定,并用杜氏小管進行產氣試驗;參照Nayak等[15]的方法對菌株溶血特性進行分析。使用試劑盒(通用型,北京擎科生物科技有限公司)提取供試菌株的16S rRNA。16S rRNA通用擴增引物為:27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492R(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)[16]。由武漢擎科生物科技股份有限公司進行16S rRNA測序鑒定,將測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST分析,采用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。

1.3 菌株生長及抑菌特性的測定

參照張琛等[17]的研究方法測定供試菌株的生長曲線和產酸曲線;以大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)K88、沙門氏菌(Salmonellaenteritidis,S.enteritidis)ATCC14028和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)ATCC25923為病原指示菌(由湖南農業大學動物醫學院惠贈),采用K-B法檢測供試菌株對指示菌的抑菌特性。取穩定期各菌液,并調節濃度至1×108CFU/mL,用無菌拭子蘸取指示菌涂布于LB固體培養基中,將20 μL的供試菌株菌液接種到附著在LB瓊脂平板上的空白藥敏紙(直徑6 mm)上,37 ℃培養24 h后測量抑菌圈直徑。

1.4 纖維素酶和發酵菌劑添加量的確定

根據纖維素酶使用說明,分別向MGP中添加0.15%、0.30%、0.60%、0.90%、1.20%的纖維素酶(購自北京挑戰生物技術有限公司,活性≥2×104U/g),充分混合后用真空包裝機抽真空,靜置于(30±2) ℃,并以未添加纖維素酶的MGP為對照。24 h后取樣,利用還原糖含量檢測試劑盒[亞科因(武漢)生物技術有限公司]檢測不同劑量纖維素酶處理下還原糖含量,以還原糖含量最高組所對應的劑量為纖維素酶最佳添加量。

在最佳纖維素酶添加量的基礎上,開展發酵菌劑最佳接種量試驗。取穩定期菌液,調整菌液濃度為1×108CFU/mL,分別向MGP中接種1%、2%、3%、4%、5%的供試菌劑,充分混合后用真空包裝機抽真空,靜置于(30±2) ℃,并以未接種的MGP為對照,發酵72 h后取樣[18],根據蔣媛媛等[19]的方法,采用Sartorius PB-10型pH計測定各組pH,以pH最低組對應的劑量為最佳接種量。

1.5 發酵試驗設計

以供試菌株(1×108CFU/mL)為發酵菌劑,以纖維素酶(活性≥2×104U/g)為發酵酶制劑。收集MGP,粉碎至1 cm2以下,調整水分含量為60%,添加0.90%的發酵酶制劑和4%的發酵菌劑,充分混合后裝入厭氧發酵袋,密封真空,在(30±2) ℃下發酵7 d;并以發酵前為原始樣品,保存于-20 ℃,待測。

1.6 營養成分分析

采用冷凍干燥法對發酵前后樣品進行干燥處理,根據AOAC(2000)[20]的方法測定樣品干物質(DM)、粗灰分(Ash)和粗蛋白質(CP)含量,根據Van Soest等[21]的方法測定樣品中粗纖維(CF)、酸性洗滌纖維(ADF)和中性洗滌纖維(NDF)含量。參照GB/T 6436—2018的方法測定樣品中鈣含量[22]。參照GB/T 6437—2018的方法測定樣品中磷含量[23]。樣品總能(GE)采用全自動量熱儀(SDAC6000全自動量熱儀,湖南三德科技股份有限公司)測定。利用乳酸(lactic acid,LA)試劑盒(北京盒子生工科技有限公司)檢測樣品中LA含量,參考Zhao等[24]的方法采用氣相色譜法測定樣品中乙酸(acetic acid,AA)、丙酸(propionic acid,PA)和丁酸(butyric acid,BA)含量。

1.7 感官質量和飼料價值的評價

采用磷鉬酸-鎢酸鈉比色法[25]測定單寧含量。采用異煙酸-吡唑酮分光光度法[26]測定氰化物濃度。按照Liu等[27]的評分方法對發酵飼料進行評估。

根據Rohweder等[28]的方法,計算MGP發酵前后的相對飼料價值(relative feed value,RFV)。

1.8 數據處理及統計分析

使用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較。試驗數據用Origin 2021軟件作圖分析。結果以平均值±標準差(mean±SD)表示,P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 發酵菌株的篩選、鑒定

本研究成功分離獲得1株可適應MGP環境的同源菌株,命名為ZC529。由圖1可見,菌株ZC529在MRS培養基上生長良好,菌落呈乳白色,凸起圓形,邊緣整齊,直徑為(2.0±0.1) mm。革蘭氏染色陽性,短桿菌。根據16S rRNA序列構建菌株ZC529的系統進化樹,菌株ZC529與發酵乳桿菌菌株MGB41-4(HM058137.1)趨同于一個分支,親緣關系最為密切。結合形態學觀察,最終鑒定菌株ZC529為發酵黏液乳桿菌(Limosilactobacillusfermentum)。

Lactobacillus fermentum strain:發酵乳桿菌菌株;Limosilactobacillus sp. strain:羅伊氏乳桿菌菌株。

菌株ZC529生理生化鑒定結果見表1,該菌無觸媒反應,葡萄糖產氣,無溶血反應,可以利用麥芽糖、甘露醇、蔗糖、棉子糖等常規碳源,但不可利用纖維二糖、山梨醇和七葉苷,結合鏡鑒及生理生化特征,初步鑒定菌株ZC529為桿狀乳酸菌。

2.2 菌株ZC529的生長特性、抑菌特性及藥物敏感性

菌株ZC529的生長、pH曲線和抑菌效果如圖2所示。發酵液的吸光度(OD)值在2 h內明顯變化,菌株ZC529處于延滯期;2～10 h內呈對數增長,菌株ZC529處于對數期;10 h后趨于穩定,菌株ZC529進入穩定期。發酵液的pH隨OD值的增加而降低,在穩定期趨于穩定,并達到最低值約4.0。對E.coli、S.aureus和S.enteritidis均表現出抑制作用,供試菌對指示致病菌的抑制作用由強到弱依次為E.coli>S.aureus>S.enteritidis,其中菌株ZC529對E.colli的抑制作用最強,抑菌圈直徑顯著大于S.aureus和S.enteritidis(P<0.05)。菌株ZC529對不同抗生素的耐藥性結果見表2,菌株對10種抗生素均敏感,說明該菌具有較高的可控性和安全性。

表2 菌株ZC529對不同抗生素的耐藥性結果

A:生長和pH曲線 growth and pH curves;B:抑菌圈直徑 diameter of inhibition zone;C:金黃色葡萄球菌 S. aureus;D:大腸桿菌 E. coli;E:沙門氏菌 S. enteritidis。

2.3 MGP中還原糖含量和pH的變化

不同劑量纖維素酶對MGP中還原糖含量的影響如圖3-A所示,MGP中還原糖含量隨纖維素酶添加量的增加,呈先增加后減少的趨勢,當纖維素酶添加量為0.90%時還原糖含量最高,顯著高于其他添加量(P<0.05)。發酵菌劑接種量對MGP中pH的影響如圖3-B所示,MGP中pH隨著接種量的增加而逐漸降低并趨于穩定,接種量為4%時pH顯著低于接種量為0、1%、2%和3%時(P<0.05)。綜上所述,確定纖維素酶添加量為0.9%,發酵菌劑接種量為4%。

圖3 MGP中還原糖含量和pH的變化

2.4 菌株ZC529對MGP營養成分和發酵品質的影響

MGP發酵前后的營養成分和發酵品質如表3所示。與發酵前相比,發酵后MGP中Ash和CP含量顯著升高(P<0.05),NDF和ADF含量均顯著降低(P<0.05);此外,發酵后MGP中LA、AA和PA含量顯著提高(P<0.05),未檢測出BA。

表3 MGP發酵前后的營養成分和發酵品質(干物質基礎)

2.5 MGP中抗營養因子和飼用價值的變化

發酵前后MGP中抗營養因子和飼用價值的變化如圖4所示。經菌株ZC529發酵后,MGP中單寧和氰化物含量均顯著低于發酵前(P<0.05),分別降低了83.78%和73.63%;并且發酵后MGP的RFV從88.85提高到了108.34,感官評分從4.31提高到了8.43,均差異顯著(P<0.05)。

圖4 MGP中抗營養因子和飼用價值的變化

3 討 論

利用微生物發酵來開發利用植物非常規飼料是解決農業廢棄物的重要方向[29],其中乳酸菌應用最為廣泛[30]。植物附生的天然乳酸菌具有較強的特異性,對同源植物的適應性強,對發酵品質的促進效果顯著[31]。舒剛欽等[32]研究表明,構樹來源的乳酸菌更耐受構樹單寧環境。陳開瓊等[33]研究表明,枸杞葉源的乳酸菌相較同種商品菌株,對枸杞葉發酵營養品質的改善作用更強。為此本研究以新鮮MGP為原材料,從中篩選適于發酵MGP的同源乳酸菌。所獲菌株ZC529,經鑒定為發酵黏液乳桿菌,發酵黏液乳桿菌即發酵乳桿菌,具有改善食品風味、增加營養、抑制致病菌、防腐、提高機體免疫、促進腸道健康等益生作用[34-35]。美國及歐洲食品和藥物管理局均將其評估為食品用微生物菌種,我國已將其列為《可用于食品的菌種名單》[35]。本試驗所獲得的菌株ZC529,對E.coli、S.aureus和S.enteritidis均有抑制作用,此外,菌株ZC529生長迅速可在10 h內達到穩定期并將發酵體系pH降至4左右,且無溶血反應,對供試的10類抗生素均敏感,表明該菌株具有良好的發酵特性和較高的生物安全性,可滿足飼料發酵及飼用安全的相關需求,可用作為MGP發酵的微生物菌劑。

還原糖作為微生物的直接能量來源,是乳酸菌快速增殖的先決條件,提高發酵底物的可溶性糖含量是保證發酵成功的條件[36]。本研究發現,MGP中還原糖含量較低,難以支持菌株ZC529在短時間內大量增殖。研究表明,適當使用纖維素酶制劑能有效提高發酵底物中還原糖含量,促進豆皮、藜麥秸稈等高纖維類非常規飼料原料的發酵[36-37]。在本研究中,經單因素試驗確定,添加0.90%的纖維素酶可顯著提高MGP中還原糖含量,為乳酸菌在發酵初期快速繁殖提供充足底物。本試驗采用菌株ZC529與纖維素酶協同發酵,纖維素酶的添加使MGP中的纖維素酶解為還原糖,為菌株ZC529的快速增殖提供大量的碳源,而菌株ZC529的迅速增殖的同時分泌大量有機酸,使發酵體系pH迅速降低,進而抑制了纖維素酶活性,纖維素分解受到抑制;同時,CF中除含有纖維素外,還含有半纖維素、木質素等成分[38],難以被纖維素酶分解利用。菌株ZC529為異型發酵乳酸菌,受菌株自身新陳代謝影響,MGP中的營養被菌株ZC529消耗,使得發酵后MGP中DM含量降低,因此發酵后的MGP中CF含量相對發酵前略有升高,但無顯著差異。

植物性非常規飼料原料往往具有CF含量高、抗營養因子或有毒物質種類多、適口性差、營養價值低等特點[29-30]。MGP中纖維素含量較高,同時還有較高的單寧和氰化物含量,是限制MGP在畜牧生產應用的關鍵因素。Li等[39]指出,菌酶協同處理是發酵和酶解的有機結合,通過該方法對飼料原料進行加工處理,可達到更好的飼用效果。微生物和酶組合可以對基質中的大分子物質和抗營養因子進行更充分的發酵和降解[40]。在本研究中,結合MGP原料物料特性,采用菌酶協同一次發酵工藝,通過添加纖維素酶與菌株ZC529協同作用完成對MGP的發酵與酶解。發酵菌株ZC529與夏威夷果同源,可耐受MGP的單寧和氰化物環境,在MGP環境中迅速增殖,有效改善MGP中的常規營養成分,顯著增加了發酵MGP中的LA、AA和PA等有機酸含量,提高了MGP的發酵品質和飼用價值。且發酵黏液乳桿菌產生的單寧酶可降解MGP中的縮合單寧[41],乳酸菌發酵在發酵過程中分泌的氰化物水合酶可將生氰糖苷分解為二氧化碳(CO2)、氨和甲酸,并為其生長繁殖提供碳源[42-43],使發酵基質中氰化物和單寧等抗營養因子的含量顯著降低,改善了MGP的適口性和營養品質。

4 結 論

本試驗從MGP中分離獲得1株發酵黏液乳桿菌ZC529,該菌株無溶血反應,并對10種抗生素敏感,安全性高,同時對E.coli、S.aureus和S.enteritidis均有抑制作用。在纖維素酶協同作用下,經菌株ZC529發酵,可將MGP中單寧和氰化物含量分別降低83.78%和73.63%,并可降低NDF、ADF含量,提高飼用價值,改善MGP的營養品質和發酵品質。