不同混合比例茅臺酒糟與芭蕉葉對其青貯飼料營養品質、發酵品質和微生物群落的影響

趙圓圓 樊雪瑩 成啟明* 陳 超 陳玉連 李茂雅 雷 耀 王佳楚函 何湘江 王志軍 劉鷹昊

(1.貴州大學動物科學學院,貴陽 550025;2.內蒙古農業大學草原與資源環境學院,草地資源教育部重點實驗室,農業農村部飼草栽培、加工與高效利用重點實驗室,呼和浩特 010021;3.中國農業科學院草原研究所,呼和浩特 010010)

近年來,隨著畜牧業的高速發展,動物飼料的供需關系逐漸失衡,飼料的供不應求狀況是畜牧業急需解決的問題,開發和利用非常規飼料是目前有效解決飼料短缺的途徑之一[1]。我國貴州地區四季分明,雨季較多,冬季牧草緊缺,青貯調制可提高牧草利用率和適口性,是解決青綠飼料季節性不均衡問題的重要方法[2]。

芭蕉(MusabasjooSieb. Et Zucc.)是芭蕉科芭蕉屬植物,是生長于熱帶的多年生草本植物之一,在我國貴州、廣東、廣西、海南、四川、云南和臺灣等地均有分布[3]。芭蕉的果肉、花、葉和根中均含有豐富的糖類、氨基酸、纖維素、礦物質、微量元素及多種化合物成分[4],而芭蕉葉作為廢棄物,對其進行飼料化利用不僅可以緩解我國部分地區青綠飼料不足的問題,也能緩解資源浪費的問題[5]。芭蕉葉所含粗蛋白質(CP)(6.45% DM)和水溶性碳水化合物(WSC)較低,但其中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量較高,分別為53.35% DM和32.13% DM,單獨青貯會導致青貯品質不佳,所以需要選取另一種材料來進行養分互補,從而改善芭蕉葉的青貯品質[6]。

酒糟是釀酒過程中高粱、小麥等原料經過蒸煮、發酵和蒸餾出酒后留下的固體廢棄物,具有產量巨大、含水率高、酸度大及易腐爛變質的特點,如果處理不當會嚴重污染生態環境[7]。由于茅臺酒糟中含有較高的蛋白質、粗纖維和豐富的水解氨基酸[8],具有良好的飼用價值,可通過青貯的方式利用茅臺酒糟,緩解飼草緊缺問題,減少環境污染[9]。原現軍等[10]研究表明,在箭筈豌豆與葦狀羊茅(3∶7)混合青貯中添加10%青稞酒糟即能夠提高混合青貯發酵品質。任海偉等[11]研究表明,在白酒糟與菊芋渣混合比例為1.2∶1和1∶1.5時,能夠有效改善青貯發酵品質,提高飼用價值。由此推測,茅臺酒糟與芭蕉葉混合青貯可能能獲得優質的青貯飼料,而此前關于茅臺酒糟與芭蕉葉混合青貯的研究還未見報道。

因此,本試驗通過研究茅臺酒糟與芭蕉葉不同混合比例對其青貯品質的影響,并通過對其養分含量、發酵品質和微生物群落等指標進行綜合分析,篩選出茅臺酒糟與芭蕉葉混合青貯的最適比例,旨在為芭蕉葉和茅臺酒糟的飼料化利用提供科學依據,為緩解我國飼草資源緊缺和生產優質青貯產品提供參考,同時為茅臺酒糟的后續處理提供一個解決方案,緩解茅臺酒糟對環境的污染問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗材料為在貴州省關嶺縣種植的芭蕉上采集的芭蕉葉,以及從貴州省仁懷市茅臺鎮茅臺集團酒廠取回的茅臺酒糟。茅臺酒糟和芭蕉葉養分含量見表1。

表1 茅臺酒糟和芭蕉葉養分含量

1.2 試驗設計

以鮮重為基礎,本試驗共設置6個茅臺酒糟與芭蕉葉的混合比例,分別為:100%芭蕉葉單獨青貯(BCK組)、20%茅臺酒糟與80%芭蕉葉混合青貯(J20B80組)、40%茅臺酒糟與60%芭蕉葉混合青貯(J40B60組)、60%茅臺酒糟與40%芭蕉葉混合青貯(J60B40組)、80%茅臺酒糟與20%芭蕉葉混合青貯(J80B20組)以及100%茅臺酒糟單獨青貯(JCK組)。青貯60 d后,對各處理青貯飼料的養分含量、發酵品質和微生物群落進行測定,每個處理設置3個重復。

1.3 青貯調制

將收獲的新鮮芭蕉葉切成2～3 cm長小段,新鮮茅臺酒糟經風干晾曬后,按照試驗設計比例將茅臺酒糟與芭蕉葉充分混勻后,稱取300 g,裝入聚乙烯袋中,用真空機抽真空密封青貯。青貯袋封口后置于室溫下避光保存60 d。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 養分含量和發酵品質測定

青貯開袋后稱取120 g左右的樣品于65 ℃烘48 h至恒重。將烘干的青貯料打為草粉后,裝于自封袋中保存,用于后續養分含量的測定;青貯開袋后取10 g樣品,加入90 mL蒸餾水進行破壁,用4層紗布過濾后,得青貯提取液,于-20 ℃保存,用于發酵品質的測定。

pH采用精密pH計進行測定,氨態氮(NH3-N)含量采用苯酚-次氯酸鹽比色法[12]進行測定,乳酸(lactic acid,LA)、乙酸(acetic acid,AA)、丙酸(propionic acid,PA)和丁酸(butyric acid,BA)含量采用DB15/T 1458—2018方法[13]進行測定。CP含量采用凱氏定氮法使用定氮儀KN680進行測定[14],WSC含量采用蒽酮-硫酸法[15]進行測定,NDF和ADF含量采用濾袋分析法[16]使用自動纖維分析儀(ANKOM A-200i)進行測定。

1.4.2 微生物群落分析

青貯結束后進行開袋,每袋取出10 g樣品,放入90 mL無菌蒸餾水中,用低溫振蕩器在4 ℃、180 r/min下搖勻30 min,然后用4層紗布過濾得到濾液,再使用冷凍離心機在4 ℃、8 000 r/min離心15 min,最終獲得富含微生物的沉積物。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒提取青貯飼料中的微生物總DNA,進行16S rDNA基因擴增子測序和真菌轉錄間隔區(ITS)擴增子測序。16S rDNA基因擴增子測序采用的引物序列為:338F,5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′;806R,5′-GGACTACHVHHHTWTCTAAT-3′;ITS擴增子測序采用的引物序列為:SSU0817F,5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′;1196R,5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′。將擴增產物回收純化,采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫。使用MiSeq測序儀進行2×300 bp的雙端測序并對結果進行分析[17]。使用QIIME軟件進行各分類水平的分類學組成分析。

1.5 數據統計分析

采用Excel 2019對原始數據進行初步整理,再使用SPSS 20.0軟件對數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比較,結果以“平均值±標準誤”表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同混合比例茅臺酒糟與芭蕉葉對其青貯飼料養分含量的影響

由表2可知,JCK組、J60B40組、J80B20組、J40B60組和J20B80組青貯飼料CP含量均顯著高于BCK組(P<0.05),分別提高了94.60%、88.19%、86.66%、67.92%和40.30%;混合青貯組中,J60B40組CP含量最高,顯著高于J20B80組和J40B60組(P<0.05)。J60B40組、J40B60組、J80B20組和J20B80組青貯飼料WSC含量與BCK組相比均無顯著差異(P>0.05);JCK組WSC含量最高,顯著高于其他組(P<0.05)。JCK組青貯飼料NDF和ADF含量顯著低于其他組(P<0.05);隨著茅臺酒糟添加比例的提高,青貯飼料NDF含量呈現逐漸降低的趨勢;J40B60組ADF含量最高,顯著高于其他組(P<0.05),之后隨著茅臺酒糟添加比例的提高,青貯飼料ADF含量逐漸降低。由表1和表2對比可知,茅臺酒糟和芭蕉葉青貯飼料CP和NDF含量比原料中CP和NDF含量均有所下降。

表2 混合青貯飼料養分含量

2.2 不同混合比例茅臺酒糟與芭蕉葉對其青貯飼料發酵品質的影響

由表3可知,BCK組青貯飼料pH最高,顯著高于其他組(P<0.05);各混合青貯組pH均顯著高于JCK組(P<0.05)。J60B40組青貯飼料NH3-N含量最低,顯著低于除JCK組外的其他組(P<0.05);J20B80組、J40B60組和J80B20組之間NH3-N含量均無顯著差異(P>0.05)。J60B40組和J80B20組青貯飼料LA含量顯著高于其他組(P<0.05),J20B80組、JCK組和BCK組之間LA含量均無顯著差異(P>0.05);隨著茅臺酒糟添加比例的提高,青貯飼料LA含量呈現出先升高后降低的趨勢。有趣的是,在JCK組青貯飼料中未檢測到AA;J40B60組AA含量最高,顯著高于其他組(P<0.05);BCK組、J20B80組、J60B40組和J80B20組之間AA含量均無顯著差異(P>0.05)。J40B60組和J80B20組青貯飼料PA含量較高,顯著高于其他組(P<0.05);J60B40組PA含量顯著高于J20B80組、JCK組和BCK組(P<0.05)。所有組青貯飼料中均未檢測到BA。

表3 混合青貯飼料發酵品質

2.3 不同混合比例茅臺酒糟與芭蕉葉對其青貯飼料微生物群落的影響

如圖1-A所示,僅JCK組青貯飼料的優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria),其余各組的優勢菌門均為厚壁菌門(Firmicutes),其次是變形菌門;除此之外,各組還存在少量的擬桿菌門(Bacteroidota)和放線菌門(Actinobacteria);JCK組和J80B20組均存在少量的疣微菌門(Verrucomicrobiota)。

圖1 混合青貯飼料細菌在門(A)和屬(B)水平上的分布

如圖1-B所示,J60B40組和J80B20組青貯飼料的優勢菌屬為乳桿菌屬(Lactobacillus),相對豐度分別為72.76%和50.92%;J40B60組的優勢菌屬為腸球菌屬(Enterococcus),其余組的優勢菌屬均為其他(others);J40B60組和J20B80組乳桿菌屬的相對豐度低于BCK組和JCK組,而腸球菌屬的相對豐度高于其他組。

如圖2-A所示,僅J40B60組青貯飼料的優勢菌門為其他(others),其余各組的優勢菌門均為子囊菌門(Ascomycota),且JCK組子囊菌門的相對豐度最高,達到98.25%。J80B20組、J60B40組、J40B60組、J20B80組和BCK組均含有少量的擔子菌門(Basidiomycota),相對豐度分別為8.06%、16.86%、3.95%、3.18%和3.34%。

圖2 混合青貯飼料真菌在門(A)和屬(B)水平上的分布

如圖2-B所示,所有組青貯飼料的優勢菌屬均為其他(others),其次是畢赤酵母屬(Pichia),相對豐度分別為J80B20組24.29%、J60B40組32.57%、J40B60組13.10%、J20B80組37.61%、BCK組30.48%以及JCK組21.38%;所有組均含有少量的裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)。此外,JCK組含有相對豐度為23.03%的Kazachstania-Candidaclade,J60B40組含有相對豐度為8.72%的Wickerhamomyces-Candidaclade。

3 討 論

3.1 不同混合比例茅臺酒糟與芭蕉葉對其青貯飼料養分含量的影響

本試驗中,新鮮茅臺酒糟的各養分含量均優于新鮮芭蕉葉,因此將兩者進行混合青貯能夠提高芭蕉葉的青貯品質。牧草種類、CP含量和WSC含量等因素都會影響青貯飼料的營養品質[18]。本研究結果顯示,單一茅臺酒糟青貯飼料(JCK組)的CP含量較高(19.11% DM),而單一芭蕉葉發酵飼料(BCK組)的CP含量較低(9.82% DM),茅臺酒糟與芭蕉葉混合青貯后克服了芭蕉葉在CP含量上的不足,使混合青貯飼料中CP含量高于單一芭蕉青貯,這與陳冬梅等[19]、劉雯雯等[20]的研究結果一致?；旌锨噘ACP含量增高可能與混合青貯組pH降低和LA含量升高有關,酒糟中殘留的乙醇可促進LA發酵,使pH下降,進而抑制蛋白酶活性,從而降低蛋白質分解[21]。WSC是青貯發酵的重要底物,要有足夠的可溶性糖分,乳酸菌才能產生足夠數量的LA[22]。本研究中,混合青貯組青貯飼料中WSC含量與BCK組沒有顯著性差異,這與韓健寶[23]在添加啤酒糟對稻秸與桔子皮、干蘋果渣和苜?；旌锨噘A研究中的結果一致。此外,本試驗中單一茅臺酒糟青貯飼料的NDF含量較低,而單一芭蕉葉發酵飼料的NDF含量較高,通過在芭蕉葉中添加不同比例的茅臺酒糟,混合青貯組的NDF含量隨著茅臺酒糟添加比例的提高而不斷降低,這與賴思蓉等[24]的結果一致,即添加一定比例的酒糟能使NDF含量顯著降低。由于J60B40組青貯飼料CP含量高,NDF和ADF含量低,所以J60B40組的青貯營養品質最好。青貯60 d后,茅臺酒糟和芭蕉葉的CP和NDF含量比原料中的CP和NDF含量均有所下降,其原因是好氧腐敗菌在發酵初期利用青貯袋中殘留的氧氣大量繁殖,從而消耗了青貯原料的營養物質。

3.2 不同混合比例茅臺酒糟與芭蕉葉對其青貯飼料發酵品質的影響

研究表明,pH是反映青貯飼料優劣的一個重要指標,較低的pH可以確保青貯飼料良好的保存,優質青貯飼料的pH在3.8～4.2[25]。本研究結果顯示,4個混合青貯組青貯飼料pH(4.05～4.11)都符合優質青貯飼料標準,且都顯著低于BCK組,而顯著高于JCK組。J40B60組、J60B40組和J80B20組青貯飼料LA含量顯著高于BCK組,由此可見,在芭蕉葉中添加一定比例的茅臺酒糟能夠提高青貯飼料LA含量,這與李茂雅等[26]的研究結果一致,且其中J60B40組LA含量最高。PA在青貯過程中能夠提高青貯飼料的有氧穩定性[27],本試驗中混合青貯組青貯飼料PA含量均顯著高于BCK組,說明茅臺酒糟與芭蕉葉混合青貯可能會提高青貯飼料的有氧穩定性。研究表明,青貯發酵前期以同型乳酸菌發酵為主,后期以異型乳酸菌發酵為主,由于后期異型乳酸發酵菌的存在,所以會導致部分LA轉化為AA,從而導致AA含量升高[28]。本試驗中,所有組青貯飼料LA/AA值均大于3,說明可能均以同型乳酸菌發酵為主。NH3-N含量越高,說明蛋白質分解越多,意味著青貯過程中養分保存不好[29]。本試驗中,茅臺酒糟與芭蕉葉混合青貯組青貯飼料NH3-N含量均低于BCK組,表明在芭蕉葉中添加茅臺酒糟進行混合青貯能夠減少蛋白質分解,有效保存青貯中的養分。綜上可知,由于J60B40組青貯飼料的LA含量最高,PA含量較高,AA含量最低,且NH3-N含量最低,所以J60B40組的青貯飼料發酵品質最好。

3.3 不同混合比例茅臺酒糟與芭蕉葉對其青貯飼料微生物群落的影響

微生物種類和數量的變化會導致青貯品質發生變化。厚壁菌門中的細菌可以降解纖維素、淀粉和蛋白質等物質;變形菌門中的細菌會跟乳酸菌競爭發酵底物,影響青貯的發酵品質[30]。本研究中,JCK組青貯飼料的優勢菌門為變形菌門,其余組的優勢菌門為厚壁菌門,其次是變形菌門,這與黃媛等[31]的研究結果一致。由此表明,茅臺酒糟與芭蕉混合青貯能夠抑制青貯飼料中的有害菌,促進有益菌的生長。從屬水平看,茅臺酒糟或芭蕉單獨青貯組的優勢菌屬均為其他,乳桿菌屬和腸球菌屬等有益菌屬相對豐度較低,不適宜青貯[32]。J60B40組和J80B20組的優勢菌屬為乳桿菌屬,相對豐度分別為72.76%和50.92%;而J40B60組的優勢菌屬為腸球菌屬,因此得出在芭蕉葉中添加40%的茅臺酒糟能夠提高混合青貯飼料中的腸球菌屬相對豐度。從微生物多樣性的角度來看,茅臺酒糟與芭蕉葉混合比例為6∶4時有益微生物相對豐度較高,其青貯品質較好。

青貯過程中有氧暴露會產生真菌[33]。目前關于青貯飼料中的真菌群落研究較少。在本研究中,從門水平真菌群落看,除J40B60組外,其余組青貯飼料的優勢菌門均為子囊菌門,這與孫安琪[34]的研究結果一致。相較于BCK組,混合青貯組青貯飼料的子囊菌門相對豐度均有一定程度的降低。從屬水平真菌群落看,所有組青貯飼料的優勢菌屬均為其他,其次是畢赤酵母屬,且均含有少量的裂殖酵母屬。研究表明,畢赤酵母屬在青貯過程中可以利用LA進行發酵[35]。酵母菌和霉菌被認為是與青貯有氧變質有關的主要微生物,會導致營養和能量損失[36]。本試驗中,未檢測出超過1%的霉菌,但有較多的酵母菌,其中J40B60組的酵母菌相對豐度較低。

4 結 論

將茅臺酒糟與芭蕉葉按一定比例混合青貯后能提高其青貯飼料營養品質和發酵品質,其中二者比例為6∶4時,青貯飼料CP和LA含量較高,pH以及NH3-N和NDF含量較低;混合青貯組青貯飼料中乳桿菌屬等有益菌的相對豐度較高,不明菌群和有害菌的相對豐度較低。結合養分含量、發酵品質和微生物群落等指標綜合分析,茅臺酒糟與芭蕉葉混合比例為6∶4時,其混合青貯發酵品質較好。