補腎和脈方對老年自發性高血壓大鼠下丘腦蛋白質組學的影響*

史 琳 楊傳華

（山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250011）

老年高血壓多以收縮壓升高、脈壓差大、血壓晝夜節律異常、易發生直立性低血壓和并發癥多等為特征［1］，是腦出血、腦梗死、阿爾茲海默病、心力衰竭、腎功能衰竭等最常見的基礎病因，也是誘發心腦血管意外疾病的主要原因。從中醫角度而言，高血壓屬于中醫學“眩暈病”范疇，“腎虛”為老年高血壓病機之本，“絡脈自病”為老年高血壓的病機。楊傳華教授在多年的臨床實踐和實驗研究中，總結并提出了老年高血壓的病機關鍵在于“腎氣虧虛，血脈自病”“補腎氣，和血脈”的重要治療方法，制定補腎和脈方。既往研究證實補腎和脈方可有效地降低老年高血壓患者24 h 血壓、脈壓、脈搏波速度，明顯改善左室舒張功能、大動脈彈性和功能，對老年高血壓、高血壓腎虛證的療效甚佳［2-5］。本研究旨在通過觀察補腎和脈方對老年自發性高血壓大鼠下丘腦蛋白質組學的干預作用，探尋補腎和脈方的分子機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級16 月齡雄性自發性高血壓大鼠（SHR）20只，體質量347～372 g，同月齡雄性血壓正常的WKY 大鼠10 只，體質量482～502 g。SHR 和WKY 均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，經動物檢驗、檢疫合格。動物合格證編號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥物

補腎和脈方組成：生黃芪15 g，黃精15 g，桑寄生15 g，女貞子15 g，懷牛膝15 g，炒杜仲15 g，澤瀉9 g。藥材均購自山東中醫藥大學附屬醫院中藥房，由醫院煎藥室統一煎制濃縮。

1.3 儀器及試劑

全自動大小鼠無創血壓測量系統（型號：BP-300A），成都泰盟公司；96 孔型PCR 儀（型號：Arktik Thermal Cycler），美國Thermo Scientific 公司；實時熒光定量PCR 儀（型號：LightCycler 480Ⅱ），美國Roche 集團；低速自動平衡離心機（型號：ST8），美國Thermo Scientific 公司；高速冷凍離心機（型號：5424R），德國Eppendorf公司；渦旋振蕩器（型號：QL-901），海門市其林貝爾儀器制造有限公司；離心機（型號：PICO17），美國Thermo Scientific 公司；超聲波細胞破碎儀（型號：XO），南京先歐儀器制造有限公司；酶標儀（型號：Multiskan MK3），Thermo；恒溫孵浴器（型號：HH.S4），上海浦東榮豐科學儀器有限公司；10K 超濾管（型號：PN：UFC5010BK），Milipore；高效液相色譜儀（型號：EASYnLC 1000 System），Thermo Scientic；質譜系統（型號：Q-Exactive），Thermo。RNA 提取試劑TRIzoI，美國Invitrogen 公司；逆轉錄試劑盒，M-MLV 逆轉錄酶，Invitrogen 公司；dNTP，OligodT，Promega 公司；2XTaq PCR Master Mix，天根生化科技（北京）有限公司；山羊超敏二步法免疫組化檢測試劑盒，編號PV 9003，北京中杉金橋生物技術有限公司；酶底物顯色劑DAB 顯色試劑盒；丹麥DAKO，基因科技（上海）有限公司；封閉血清，羊封閉血清原液，北京中杉金橋生物技術有限公司；Cdc42 兔多克隆抗體（型號：10155-1-AP），SIRT2 兔多克隆抗體（型號15345-1-AP），PYK2兔多克隆抗體（型號：17592-1-AP），辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L）ZB-2305，辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）ZB-2301，DAB 顯色試劑盒ZLI-9018，北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4 給藥方法

補腎和脈方組給予藥物濃度為14.22 g/（kg·d），模型組和正常對照組給予等量生理鹽水，給藥容積為10 mL/kg，每天上午定時灌胃給藥，每周給藥6 d，連續8周。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 血壓 整個實驗周期采用尾套式尾動脈加壓法測量大鼠清醒和安靜狀態下的血壓，包括收縮壓、舒張壓、脈壓差、平均動脈壓。

1.5.2 血清中神經肽（NPY）、去甲腎上腺素（NE）、C反應蛋白（CRP）和血管緊張素Ⅱ（AngⅡ） ELISA 法檢測大鼠血清中NPY、NE、CRP和AngⅡ的濃度。

1.5.3 下丘腦蛋白質組學 1）組織蛋白提?。焊深A結束后處死動物，取下丘腦組織，剪碎后用4℃預冷的生理鹽水反復沖洗。加入適量的液氮，按照1∶10（W/V）加入樣品裂解緩沖液（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，0.1%CHAPS）及蛋白酶抑制劑PMSF研磨。4 ℃，15 000 r/min，離心15 min，吸取上清，分裝后，置于-80 ℃保存。2）蛋白定量（蛋白質濃度測定）：采用Bradford 法（考馬斯亮藍法）測定樣本蛋白濃度。準備標準曲線，設置10個管的標準品，每孔依次加0.2 μg/μL BSA為0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 μL，補加PBS至最終體積為20 μL，各孔濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.4、2.8、3.2、3.6 μg 蛋白。將樣本按照說明書用裂解緩沖液（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，0.1% CHAPS）稀釋至一定倍數，使終濃度落在測量范圍內，稀釋好的樣本和標準品的每個樣品各取10 μL至管中。加300 μL蛋白定量染料，避光，室溫孵育20 min。595 nm測量吸光度，繪制標準曲線。依據標準曲線計算出樣品濃度。3）蛋白酶解：蛋白定量后取200 μg 蛋白溶液置于離心管中，加入終濃度為25 mmol/L DTT，60 ℃反應1 h；反應后加入終濃度50 mmol/L 碘乙酰胺，室溫10 min。將還原烷基化后的蛋白溶液加入10 K 的超濾管中，12 000 r/min 離心20 min，棄掉收集管底部溶液。加入溶解緩沖液100 μL，12 000 r/min 離心20 min，棄掉收集管底部溶液，重復3次。更換新的收集管，在超濾管中加入胰蛋白酶，總量4 μg（與蛋白質量比1∶50），體積50 μL，37 ℃反應過夜。12 000 r/min 離心20 min，將酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底部；在超濾管中加入50 μL 溶解緩沖液，12 000 r/min再次離心20 min，與上一步合并，收集管底部共得到100 μL酶解后的樣品。凍干待上樣。4）鈉升級反相色譜-Q Exactive進行蛋白質分析：將高PH反相分離得到的組分用20 μL 12%甲醇，0.1%甲酸復溶；12 000 r/min 離心10 min，吸取上清上樣；上樣體積10 μL，采取夾心法上樣；Loading Pump 流速350 nL/min，15 min；分離流速300 nL/min，分離梯度見表1。

表1 分離梯度

質譜數據分析：選擇SwissProt數據庫，質譜分析由Thermo Q-Exactive 型質譜完成。使用Western blotting分析驗證差異蛋白結果。具體步驟：12%SDS-PAGE，上樣量為40 μg；電轉印后，以5%脫脂奶的TBST 室溫封閉1h。加入Cdc42（1∶1 000 稀釋）、SIRT2（1∶500 稀釋）、Ptk2b（1∶500稀釋），以GAPDH 為內參，4℃孵育過夜。次日，1×TBST洗滌5 min×5次，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）室溫孵育1.5 h，1×TBST 洗滌5min×4 次。ECL顯色，Fluor Chem Q下曝光、條帶半定量分析。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠血壓比較

見表2。與正常對照組相比，模型組大鼠收縮壓、舒張壓、脈壓差、平均動脈壓均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，補腎和脈方組大鼠收縮壓、舒張壓、脈壓、平均動脈壓均顯著下降（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血壓比較（mmHg，±s）

表2 各組大鼠血壓比較（mmHg，±s）

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05。下同。1 mmHg≈0.133 kPa。

組 別正常對照組模型組補腎和脈方組n 10 10 10收縮壓122.33±1.59 193.51±1.82*164.53±1.34△舒張壓76.29±2.79 133.09±1.30*112.58±0.82△脈壓差45.57±1.88 60.48±1.73*52.06±1.72△平均動脈壓91.86±1.94 153.19±1.20*131.21±3.49△

2.2 各組大鼠血清NPY、NE、CRP、AngⅡ表達比較

見表3。與正常對照組相比，模型組大鼠NPY、NE、CRP、AngⅡ均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，補腎和脈方組大鼠NPY、NE、CRP、AngⅡ均顯著下降（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清NPY、NE、CRP、AngⅡ表達比較（±s）

表3 各組大鼠血清NPY、NE、CRP、AngⅡ表達比較（±s）

組 別正常對照組模型組補腎和脈方組n 10 10 10 NPY（pg/mL）120.01±7.37 146.66±8.74*130.06±8.34△NE（pg/mL）192.02±5.82 214.27±7.56*201.92±7.16△CRP（μg/mL）4.29±0.62 9.71±0.82*6.13±0.75△Ang Ⅱ（ng/L）142.28±5.68 188.06±8.18*166.02±6.25△

2.3 各組大鼠下丘腦蛋白質組學情況

與模型組相比，補腎和脈方組大鼠的下丘腦中共檢出2 753 個差異蛋白點，其中有316 個蛋白有統計學差異（P＜0.05），其中201 個蛋白表達升高，115 個蛋白表達降低。下丘腦差異最大的前30 個蛋白為：Acan、Serpinh1、Nub1、Slc25a25、Hapln1、Syt2、Rpl23、Pvalb、Ahnak、Uqcrh、Nbas、Cpm、Ggt7、Sez6l、Aarsd1、Lgi3、Esyt1、Nefh、Ptges2、Cst3、Cdc42、Metap2、Mag、RGD1302996、Pacsin3、Epm2aip1、Tfrc、Tstd3、Coq9、Gabrg2（均為表達上調）；Dgkb、Vps51、C2cd2l、Limch1、Ptk2b、Lactb、Npy、Cpne7、Arhgap21、Cpne5、Trio、Golga2、Ccdc177、Nop56、Sarm1、Ntrk2、Sec16a、Adgrg1、Dclk1、Nup50、Chgb、Ngef、Coro2a、Rab3b、Btbd8、Zc2hc1a、Txndc12、Wfs1、Ift172、Syngap1（均為表達下調）。

2.3.1 下丘腦差異蛋白功能分析 下丘腦中差異蛋白主要集中在轉運酶活性和離子通道活性方面（表4），差異蛋白主要集中在細胞質和細胞膜方面（表5）；生物學功能主要集中在代謝、磷酸化和發育方面（表6、圖1）。

圖1 下丘腦中差異蛋白的GO富集分析

表4 下丘腦中蛋白分子功能注釋分類

表5 下丘腦中蛋白細胞定位注釋分類

表6 下丘腦中蛋白生物學途徑注釋分類

2.3.2 下丘腦KEGG 通路分析 見表7、圖2。采用DAVIA網站分析了差異蛋白在KEGG通路中的富集情況。結果如下，與模型組相比，補腎和脈方干預后的SHR 下丘腦中差異蛋白涉及的信號通路涉及cAMP 信號傳導途徑、GABA突觸和酒精中毒通路。

圖2 下丘腦中差異蛋白信號通路

表7 各組大鼠下丘腦差異蛋白的mRNA相對表達水平比較（分，±s）

表7 各組大鼠下丘腦差異蛋白的mRNA相對表達水平比較（分，±s）

組 別正常對照組模型組補腎和脈方組Cdc42 1.00±0.04 0.30±0.10*0.77±0.18△SIRT2 1.00±0.04 0.58±0.12*0.87±0.10△Ptk2b 1.00±0.09 4.13±0.16*2.16±0.45△

表7 下丘腦中差異蛋白信號通路

2.3.3 String 網絡數據庫建立差異蛋白互作網絡 通過String 在線數據庫分析差異蛋白的互作網絡，具體分析結果如圖3所示。

圖3 下丘腦中String蛋白互作網絡

2.4 各組大鼠下丘腦差異蛋白的mRNA 相對表達水平比較

見表7。與正常對照組相比，模型組大鼠Cdc42、SIRT2 mRNA 水平顯著下降（P＜0.05），Ptk2b mRNA 相對表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，補腎和脈方組大鼠Cdc42、SIRT2 mRNA 相對表達水平顯著升高（P＜0.05）及Ptk2b mRNA 相對表達水平均顯著降低（P＜0.05）。

3 討 論

老年高血壓病的病機在于“腎虛為本，絡脈自病”，腎虛為病機根本，標實為痰濁瘀血，屬本虛標實之證。高血壓病多起病隱匿，病程較長，“初病在氣，久病在血；初病在經，久病入絡”，絡脈“溝通表里、滲灌氣血”，而絡病久、瘀、頑、雜，使得疾病遷延難愈。治療原則應遵循“平衡陰陽，調整氣血”。治法上應補益腎氣，調和血脈。方中重用生黃芪為君藥，“補一身之虛”，氣血通暢調達，脈絡自和，乃補腎和脈之首要，配合黃精、桑寄生，共奏滋腎填精、補腎通絡之功?！吧蒲a陽者，必于陰中求陽，則陽得陰助，而生化無窮；善補陰者，必于陽中求陰，則陰得陽升，而泉源不竭”，故方中臣以女貞子、炒杜仲合用以陰陽雙補，平補腎之陰陽氣血，使腎氣充盛，懷牛膝引血下行，佐以甘寒之澤瀉，補腎虛，泄腎濁，既能降濕濁，又可制約溫燥諸藥化熱傷津、防補品滋膩戀邪之弊?？v觀本方，共奏補腎益氣、陰陽雙補、活血行氣通絡之功。

下丘腦是血壓調節的內分泌系統和神經系統的接口，下丘腦室旁核（PVN）是通過調節心血管、神經內分泌和其他功能來維持體內平衡的關鍵區域［6］。有證據支持下丘腦神經元活動的改變是導致交感神經驅動力增加和血壓升高的主要因素［7］，下丘腦可以調節中樞神經元信號傳導、炎癥反應、氧化應激、血管緊張素分泌等過程。

本研究顯示，GO功能富集分析提示下丘腦中差異蛋白主要集中在轉運酶活性、離子通道活性、代謝、磷酸化和發育方面；差異蛋白主要集中分布在細胞質和細胞膜方面。采用DAVIA網站分析差異蛋白在KEGG通路中的富集情況，發現與SHR 模型組相比，補腎和脈方干預后的SHR 大鼠下丘腦中差異蛋白有關的信號通路涉及cAMP信號傳導途徑、GABA 突觸和酒精中毒通路。cAMP 信號通路在代謝、分泌、鈣穩態、肌肉收縮、細胞命運和基因轉錄方面具有重要的調節作用。cAMP 是最普遍和多功能的第二信使之一，cAMP 信號通路對于細胞適應復雜環境的過程非常重要，涉及多個下游信號分子家族，例如G 蛋白偶聯受體（GPCRs），鳥嘌呤核苷酸結合蛋白（G 蛋白），腺苷酸環化酶（AC），PDE 和包括A 型激酶錨定蛋白（AKAPs）在內的支架蛋白等［8］。cAMP 在細胞中的功能主要由蛋白激酶A（cAMP 依賴的蛋白激酶EPAC）和直接由cAMP 激活的交換蛋白（cAMP 調節的鳥嘌呤核苷酸交換因子cAMP-GEF）執行。cAMP 可以嚴密地監控包括代謝、分泌和肌肉收縮在內的多種生理病理過程，在血壓的調節過程中具有重要的作用［9］。GPCRs 是cAMP 信號通路中重要的分子，是治療高血壓的重要靶標。GPCRs 通過轉導激素信號改變細胞內第二信使水平、效應酶和通道活性。第二信使的降低可以抑制血管的擴張［10］。下丘腦神經元細胞通過分泌抗利尿激素，增加腎臟對水的重吸收和收縮血管，增加血壓。當血壓升高時，壓力反射通過激活γ-氨基丁酸（GABA）抑制血管升壓素神經元活動，進而降低血壓。

Cdc42 編碼了含191 個氨基酸、21.3 kDa 的小GTPase 蛋白質，屬于Ras GTP 酶超級家族中的Rho 家族。Cdc42 參與肌動蛋白和細胞極性的調節。Cdc42與多種細胞過程密切相關，如軸突髓鞘、細胞內轉運、基因轉錄、細胞周期調控和細胞命運的調控。Cdc42 還參與細胞遷移和趨化，主要包括巨噬細胞，T 細胞，成纖維細胞等［11］。在原發性小鼠胚胎成纖維細胞中，Cdc42 的缺失會導致異常細胞的擴散，減少對纖維蛋白的黏附，導致傷口愈合的缺陷，并隨血清梯度下降其趨化性減弱［12］。有研究發現SIRT2 在神經生長和神經細胞神經活動的調節中發揮作用［13］。研究發現，AngⅡ和機械拉伸通過SIRT2 刺激內皮細胞的微管再分布和去乙?；?，在高血壓誘導的血管重塑中發揮重要作用［14］。Ptk2b 與高血壓密切相關。與正常血壓小鼠相比，神經源性高血壓小鼠下丘腦中Ptk2b 表達明顯減低［15］。AngⅡ誘導的Ptk2b 磷酸化促進VSMC 增殖［16］。AngⅡ通過細胞膜上GPCR受體信號傳導，激活pyk2（ptk2b），通過MAPK 信號通路，磷酸化MEK 和ERK，間接促進細胞增殖和細胞分化。大樣本的高血壓人群研究顯示Ptk2b 與高血壓相關［17］。有研究顯示血管緊張素、血管收縮、鈉/鉀調節與Ptk2b 相關［18］。

因此，研究發現補腎和脈方對下丘腦的保護可能是通過上調Cdc42 從而促進神經元細胞活力實現的。SIRT2 可能通過抑制炎癥反應和促進細胞的活力促進下丘腦組織的功能進而影響大鼠的血壓。Ptk2b 可能通過改變下丘腦神經元細胞活力對下丘腦起到保護性的作用，進而延緩高血壓病的發生。