四神丸對腹瀉型腸易激綜合征大鼠5-HT 信號通路表達的影響*

魏星旭 易夢妮 鄧 娜 藺曉源 周賽男△

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）是以腹脹、腹痛、腹瀉等癥狀反復發作的臨床最為常見的腸易激綜合征（IBS）亞型［1］，其發病率高，機制尚未明確，仍缺乏有效的治療手段。IBS-D 中醫病位在腸，屬“泄瀉”“腹痛”等范疇，脾失健運是其病機核心，亦與腎臟密切相關。命門火衰，火不暖土，則脾腎陽虛。四神丸是主治脾腎陽虛泄瀉的經典名方，臨床治療IBS-D 效果確切［2-3］，但其作用機制還不明確。目前一致認為腸道動力異常和內臟高敏感是IBS 主要的病理生理學基礎，與腦腸互動失調關系密切。5-羥色胺（5-HT）是影響IBS-D腸道功能活動的重要腦腸肽，5-HT信號通路在調節胃腸功能中具有重要的生理作用。5-HT 的合成、釋放、與相應的受體結合等信號系統中任一節點出現異常，都可引起胃腸運動紊亂及內臟高敏性［4］。為了進一步揭示四神丸治療IBS-D 的內臟敏感機制，本研究通過復制脾腎陽虛IBS-D大鼠模型，觀察了其對5-HT信號通路表達的影響?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠，32只，雄性，SPF級，體質量180～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院SPF 實驗動物中心，使用許可證號：SYXK（湘）2020-0010。經湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會批準研究。

1.2 實驗藥物

四神丸（北京同仁堂，國藥準字Z13020656，規格：27 g/瓶），用純凈水配成0.732 g/mL的藥液。匹維溴銨片（得舒特，法國蘇威制藥有限公司，國藥準字H20120127，規格：50 mg/片），用純凈水配成1.523 mg/mL 的藥液。番瀉葉購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，煎制成1.0 g/mL的藥液。

1.3 試劑與儀器

大鼠5-HT、SERT ELISA 試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號：ml003125、ml028312）；5-HT、5-HT4R 一抗（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-1126R、bs-12054R）。STP-120 組織脫水機、HistoStar包埋機、HM325 輪轉式切片機（英國賽默飛），BX43 熒光顯微鏡（日本奧林巴斯），Enspire 多功能酶標儀（美國Perkinelmer），Bio-Rad 蛋白印跡系統（美國伯樂），FluorChem R 超靈敏多色熒光成像分析系統（美國普諾森），Z32HK高速冷凍離心機（德國賀黙）。

1.4 分組與造模

將32 只大鼠隨機分為正常組、模型組、四神丸組、得舒特組各8 只。先灌胃番瀉葉水煎液（10 mL/kg，每日1次）28 d，后連續10 d進行避水應激，制備脾腎陽虛型IBS-D大鼠模型［5］。

1.5 給藥方法

四神丸組給予成人等效4 倍劑量（7.32 mg/kg）的四神丸藥液，得舒特組給予成人等效劑量（15.23 mg/kg）的得舒特藥液，模型組給予等體積量（10 mL/kg）的純凈水，給藥14 d。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 Bristol 糞便性狀量表評分 末次給藥后代謝籠收集大鼠糞便，按照Bristol 糞便性狀7 級評分標準進行性狀評分［6］。

1.6.2 內臟疼痛閾值 末次給藥后將大鼠放入自制的容器中限制活動，從肛門緩慢插入帶有球囊的導尿管，從20 mmHg（1 mmHg ≈0.133 kPa）開始，逐次給予遞增10 mmHg 的壓力刺激，當大鼠背部拱起或腹部抬離臺面所對應的壓力值即為疼痛閾值［7］。

1.6.3 ELISA 法檢測血清中5-HT、SERT 大鼠麻醉后心臟取血，離心取血清置-80 ℃冰箱保存。從冰箱中取出血清室溫復溶，嚴格按5-HT、SERT ELISA 試劑盒說明書操作步驟進行，使用450 nm 波長測量，建立標準曲線，計算所測樣品的含量。

1.6.4 免疫組化檢測結腸組織5-HT 的陽性表達 大鼠冰盒上剖腹，剪取兩段結腸PBS漂洗后，一部分裝入凍存管液氮中保存，一部分放入多聚甲醛液中固定。將用多聚甲醛固定好的結腸組織進行脫水、石蠟包埋、切片，滴加5-HT一抗（1∶200）4 ℃過夜、二抗37 ℃孵育30 min，DAB 顯色，400 倍鏡下選取棕黃色染色視野拍片分析，計算其免疫陽性染色的平均OD值。

1.6.5 Western blotting 法檢測結腸組織5-HT4R 的蛋白表達 取凍存的結腸組織，依次提取蛋白，制備SDSPAGE 膠，上樣，經電泳、濕轉膜、封閉后，加入5-HT4R 一抗（1∶1 000），二抗室溫孵育、顯色。以內參蛋白β-actin的灰度值為對照，計算5-HT4R的蛋白表達。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠Bristol糞便性狀量表評分比較

見表1。模型組大鼠Bristol 糞便性狀量表評分較正常組明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，四神丸組和得舒特組大鼠Bristol糞便性狀量表評分均明顯降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠Bristol糞便性狀量表評分和內臟疼痛閾值比較（分，±s）

表1 各組大鼠Bristol糞便性狀量表評分和內臟疼痛閾值比較（分，±s）

注：與正常組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同。

內臟疼痛閾值（mmHg）94.38±4.17 48.13±3.72**88.13±5.30△△84.38±4.17△△組 別正常組模型組四神丸組得舒特組n8888 Bristol（分）4.13±0.64 6.00±0.53*3.75±0.46△4.25±0.46△

2.2 各組大鼠內臟疼痛閾值比較

見表1。模型組大鼠內臟疼痛閾值較正常組顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，四神丸組和得舒特組大鼠內臟疼痛閾值均顯著升高（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠血清5-HT、SERT含量比較

見表2。與正常組比較，模型組血清5-HT 含量顯著升高、SERT 含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，四神丸組和得舒特組5-HT含量降低、SERT含量升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清5-HT、SERT含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清5-HT、SERT含量比較（±s）

組 別正常組模型組四神丸組得舒特組n8888 5-HT（ng/mL）6.22±0.47 11.83±0.59**7.45±0.60△8.11±0.61△SERT（pg/mL）204.32±15.97 164.08±12.77**191.03±16.40△183.13±12.79△

2.4 各組大鼠結腸組織5-HT陽性表達比較

見表3、圖1。模型組結腸組織5-HT 陽性表達較正常組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，四神丸組和得舒特組5-HT 的陽性表達均降低（P＜0.05 或P＜0.01），且四神丸組低于得舒特組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠結腸組織5-HT陽性和5-HT4R蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠結腸組織5-HT陽性和5-HT4R蛋白表達比較（±s）

注：與得舒特組比較，*P ＜0.05。

組 別正常組模型組四神丸組得舒特組5-HT4R/β-actin 0.45±0.04 0.07±0.02**0.29±0.03*△0.14±0.03△n8888 5-HT 0.15±0.02 0.54±0.05**0.18±0.03*△△0.35±0.04△

2.5 各組大鼠結腸組織5-HT4R蛋白表達比較

見表2、圖2。模型組結腸組織5-HT4R 蛋白表達較正常組顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，四神丸組和得舒特組5-HT4R 蛋白表達均升高（P＜0.05 或P＜0.01），且四神丸組高于得舒特組（P＜0.05）。

圖2 各組結腸組織5-HT4R蛋白電泳條帶

3 討 論

IBS-D 屬中醫學“泄瀉”范疇，脾腎陽虛證在泄瀉中的證型比例在9.21%以上［8］，因腎和脾乃先、后天之本，生理上相互補充，病理上相互影響，命門火衰，火不暖土，故見大便清稀甚至水樣便，完谷不化、腹痛喜溫、腰酸肢冷等癥狀。也有研究表明，脾腎陽虛證是IBSD 臨床最為多見的證型之一，貫穿IBS-D 發病的始終［9］。四神丸出自《內科摘要》，為治療脾腎陽虛型泄瀉的經典名方，臨床用于治療IBS-D 效果顯著；其重用補骨脂溫腎暖脾為君；臣以肉豆蔻溫脾暖胃、澀腸止瀉，吳茱萸溫中散寒；五味子酸斂固澀，合生姜溫胃散寒，大棗補脾養胃，共為佐使。Meta 分析研究表明，四神丸治療IBS-D 的臨床有效率優于西藥組，且四神丸安全性更高［10］。

目前四神丸治療IBS-D 的實驗研究主要涉及腸黏膜屏障保護、胃腸道功能改善、腸道菌群調節相關方面［11］。IBS-D 的發病機制復雜，而作為中樞神經系統（CNS）與胃腸道之間信號傳導的腦腸軸則對調控腸道動力和內臟敏感性起著至關重要的作用［12］。課題組前期基于腦腸軸調控紊亂在IBS-D 發病中的作用開展了大量研究工作，從腸道動力異常角度進行了四神丸治療脾腎陽虛IBS-D 的作用機制探討。研究表明，四神丸治療脾腎陽虛型IBS-D 的作用與調節腦腸肽Ghrelin、CRF 的表達有關［5，13］。盡管如此，在脾腎相關的腦腸軸理論指導下［14］，四神丸治療IBS-D 的內臟敏感機制仍亟待研究。課題組在大量的動物實驗中進行了四神丸治療IBS-D 的量效關系研究，即四神丸高（7.32 mg/kg）、中（3.66 mg/kg）、低（1.83 mg/kg）劑量組分別給予成人等效劑量的4、2、1 倍灌胃，結果均顯示以高劑量組效果最優［5，15-16］。因此，在已明確其量效關系的前提下本研究未做量效關系探討，而直接選取高劑量給藥。

5-HT是一種廣泛分布于胃腸道平滑肌、腸神經系統和胃腸道傳入感覺神經系統中的重要腦腸肽［17］。當胃腸受到刺激后，5-HT可通過參與腦腸軸中化學信號的改變；當CNS 和胃腸道5-HT 水平明顯升高，堆積后可能觸發興奮性毒性，使迷走神經調控功能受損，引發內臟高敏感［18］。5-HT 可通過與不同受體結合產生作用，從而引發IBS-D，其中5-HT4R 與IBS-D 內臟高敏機制關系較為密切。5-HT 與5-HT4R 結合后，可開放電壓敏感性鈣通道，促進乙酰膽堿等神經遞質釋放，導致腹部疼痛不適以及內臟敏感性增強等［19］。此外，腸道中5-HT4R 也可直接參與內臟感覺信號傳遞［20］。SERT 作為5-HT 失活的重要跨膜轉運蛋白，對5-HT具有高選擇性親和力，當5-HT發揮作用后，SERT轉運蛋白快速轉運5-HT 至細胞內失活，進而降低細胞外液中5-HT 的濃度［21］。故SERT 基因的表達和蛋白功能的降低會導致5-HT 的過量累積，出現腦腸軸功能失調。研究發現，IBS-D 大鼠腦、腸、血清中5-HT 水平均上升，SERT 水平下降，且SERT 蛋白及基因表達降低，內臟敏感性升高［22］。本研究顯示，IBS-D模型大鼠血清中5-HT 含量增加、SERT 含量減少，結腸組織中5-HT 的陽性表達升高、5-HT4R 的蛋白表達降低，與文獻報道結果一致。

本研究觀察了四神丸對IBS-D 模型大鼠5-HT 信號通路表達的影響，結果顯示，IBS-D 模型大鼠Bristol糞便性狀量表評分升高，內臟疼痛閾值降低，內臟敏感性增強，說明模型大鼠出現了IBS-D 的內臟高敏癥狀。經四神丸治療后，IBS-D大鼠Bristol糞便性狀量表評分降低、內臟疼痛閾值升高，內臟敏感性減弱，提示四神丸可以有效改善IBS-D大鼠的內臟高敏感。同時，其還能降低血清5-HT 水平、升高SERT 水平，減少5-HT 在結腸組織中的陽性表達，增加5-HT4R 的蛋白表達，表明四神丸改善IBS-D 大鼠內臟高敏的作用與調控5-HT、SERT的含量及5-HT、5-HT4R的表達有關。

綜上可知，四神丸可通過調節腦腸軸5-HT信號通路，改善內臟高敏感，達到治療IBS-D 的目的。然而其調節IBS-D內臟敏感機制的其他途徑仍有待深入研究。