SOX9調控肝星狀細胞活化與增殖促進肝纖維化進展

熊敏莉 龔曉媛 萬舒淇 羅聲政

肝纖維化是各種肝臟疾病不斷進展的共同階段,包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、遺傳性肝病等[1-3]。當肝臟遭受外界損傷后,肝細胞會釋放大量細胞因子,招募巨噬細胞遷移至肝臟,并且誘發肝星狀細胞由靜息態轉換成活化態。肝星狀細胞是肝纖維化進程中的主要效應細胞,當肝星狀細胞活化后,細胞內將合成大量的膠原纖維并沉積在細胞基質中。肝小葉中的膠原纖維不斷沉積會破壞原有正常肝小葉結構,導致肝臟假小葉生成,嚴重損害肝臟的正常功能[4-5]。肝星狀細胞的激活是肝臟遭遇損傷的自我修復過程,細胞外基質的膠原合成與分解是處在一個動態平衡之中的。因此肝星狀細胞的活化與凋亡是調控肝纖維化進程的關鍵因素。目前一般認為,當外界損傷因素消失后,早期的肝纖維化是可以逆轉的。但持續的肝纖維化進程會導致肝硬化甚至肝癌,嚴重影響人類的健康[6-7]。因此探究緩解甚至逆轉肝纖維化的分子機制有著十分重要的意義。

性別決定區域Y相關的高遷移率族框9基因(SRY-related high mobility group-box gene 9)是SOX基因家族的重要成員。SOX基因家族是一類轉錄調控因子,在機體的生長發育、機體損傷修復等功能中發揮著重要的作用[8-9]。但是目前SOX9基因是否在肝纖維化的進程中發揮了作用尚不明確。本研究評估SOX9基因在肝纖維化中可能發揮的潛在作用。

材料與方法

一、材料與試劑

實驗小鼠購買并飼養于上海斯萊克實驗動物中心。LX2細胞系購買于武漢普諾賽生物科技有限公司,高糖DMEM培養基、青霉素-鏈霉素雙抗、胎牛血清等細胞培養試劑購買于美國Gibco生物科技公司,用于構建肝纖維化小鼠模型的四氯化碳及玉米油等試劑購買自阿拉丁生物科技有限公司。用于敲減細胞SOX9基因表達的小干擾RNA購買自上海吉瑪生物科技有限公司,Lipofectamine3000轉染試劑購買自美國Invitrogen生物科技公司。用于qPCR檢測的引物購買自上海生工生物技術有限公司,SYBR mix試劑盒購買自上海翌圣生物科技有限公司。用于Western Blot的抗體購買自美國Abcam生物科技公司。

二、方法

(一)動物模型構建 肝纖維化小鼠模型被分為兩組,即對照組和肝纖維化造模組。12只6周齡大小的雄性C57BL/6J小鼠被隨機分配至兩個組中,每組6只。每組小鼠每周分別注射三次15%的四氯化碳或等量玉米油,注射量為2 μL/g體質量,持續注射六周。造模完成后,收集小鼠血清及肝臟標本用于后續實驗。

(二)肝臟組織病理檢查及肝酶檢測 造模完成后,取適當大小的肝臟組織置于4%的多聚甲醛溶液中固定48小時。固定完成后將肝臟組織放置于包埋盒中,使用自動脫水機將肝組織進行脫水。脫水完成后的肝組織放置于溶解的石蠟池中進行包埋,制成肝組織石蠟塊。將包埋于石蠟塊肝組織以5 μm的厚度切片制成白片,以用于組織切片染色。

將制成的肝組織石蠟切片經由烤片、脫蠟、水化步驟后,將切片按照HE染色試劑盒及天狼星紅染色試劑盒說明書相應步驟進行切片染色。染色完成后使用中性樹膠封片,在光學顯微鏡下觀察組織染色情況,并拍照存檔。

(三)LX2細胞培養及活化誘導 以10%胎牛血清+1%雙抗的比例加入高糖DMEM培養基中,配制成完全培養基,將LX2細胞接種于10 cm培養皿中置于37 ℃、50% CO2、飽和濕度的培養箱中培養。待細胞密度長至70%左右,細胞形態良好時,行細胞接種。棄去原培養基,用PBS潤洗培養皿中加入0.25%的胰酶消化細胞,以1×105密度將細胞接種于12孔板中,使用完全培養基培養24 h。將細胞分為兩組即靜息組與活化組,在活化組使用5 ng/mL濃度的TGFβ1細胞因子刺激LX2細胞促進細胞活化。

(四)RT-qPCR檢測相關基因mRNA表達 建模后的小鼠組織及轉染后的LX2細胞按照說明書使用TRIZOL提取總RNA,使用分光度儀器檢測RNA濃度以及純度。將RNA逆轉錄成cDNA文庫用于qPCR檢測。使用SYBR Premix染料進行qPCR擴增,以GAPDH基因為內參檢測,相對表達量為2-△△Ct計算組織及細胞內各目的基因的相對表達。內參基因及目的基因均設三個復孔。使用的各基因擴增引物序列見下表1。

表1 qPCR相關引物序列

三、統計分析

使用SPSS 19.0軟件進行統計學處理。所有實驗數據以平均值±標準差表示,使用GraphPad軟件進行作圖。兩組之間的數據統計差異使用配對t檢驗進行分析。P<0.05被認為差異有統計學意義。

結 果

一、肝纖維化小鼠模型組織染色情況

與造模組比,HE染色可見對照組小鼠肝臟小葉結構完整,肝細胞形態良好,排列整齊,沿小葉中央靜脈放射狀分布,無明顯的炎細胞浸潤。造模組可見肝小葉結構明顯被破壞,肝細胞排列紊亂,出現了明顯的細胞變性及炎細胞浸潤于肝臟血管周圍。Masson染色顯示,對照組小鼠肝臟內無明顯膠原沉積,造模組小鼠中出現了大量藍色膠原纖維沉積于肝小葉中,肝臟正常結構被明顯破壞,出現了明顯肝纖維化的表現。

圖1 各組小鼠肝組織HE染色(×100)、Masson染色結果(×100)

二、肝纖維化小鼠模型中,膠原相關基因及SOX9基因表達明顯上升

檢測二組小鼠肝臟組織中膠原相關基因的表達,結果表明(表1)與對照組相比,造模組小鼠肝臟中膠原合成的標志基因α-SMA(造模組:2.568±0.726 vs對照組:1.000±0.272,t=4.518,P=0.002)與Col1(造模組:3.125±0.775 vs對照組:1.000±0.398,t=5.454,P=0.001)的表達明顯上升,這表明纖維化小鼠肝臟中的膠原生成明顯增加,小鼠肝臟出現明細纖維化表現。此外SOX9基因的表達也在造模組中顯著升高(造模組:1.986±0.643 vs對照組:1.000±0.288,t=3.126,P=0.014)。SOX9基因的異常升高提示其可能參與小鼠肝纖維化的進展。

三、活化的肝星狀細胞中,膠原合成相關基因及SOX9基因表達顯著上升

本研究使用5 ng/mL濃度的TGFβ1因子刺激LX2細胞48 h誘導肝星狀細胞活化,發現LX2細胞內標志膠原生成的α-SMA(活化組:1.856±0.342 vs對照組:1.000±0.191,t=4.874,P=0.001)與Col1(活化組:2.133±0.494 vs對照組:1.000±0.129,t=4.963,P=0.001)基因表達都出現了顯著升高(表2)。與肝纖維化小鼠模型相似,活化的LX2細胞中SOX9基因的表達也上升了1.718倍(表2),進一步表明了SOX9基因可能在小鼠肝纖維化的進程中發揮了重要的作用。

表2 qPCR檢測各組小鼠肝組織膠原合成基因及SOX9基因相對表達

四、在LX2細胞中敲減SOX9基因后,膠原合成與細胞增殖相關基因表達降低

為了進一步了解SOX9基因在肝纖維化進程中發揮的作用,我們在活化的肝星狀細胞中轉染了SOX9小干擾RNA來降低活化LX2細胞內SOX9基因的表達。經小干擾RNA轉染后,LX2細胞內SOX9基因的表達將為原來的0.32倍(表3),小干擾RNA敲減效果良好。隨后我們檢測細胞內膠原合成相關基因α-SMA(活化組:0.621±0.142 vs對照組:1.000±0.188,t=3.590,P=0.007)及Col1(活化組:0.558±0.170 vs對照組:1.000±0.130,t=4.608,P=0.002)的表達,發現兩個基因均出現了顯著降低(表3)。此外細胞增殖的相關基因CyclinD1(活化組:0.614±0.106 vs對照組:1.000±0.166,t=4.392,P=0.002)和PCNA(活化組:0.525±0.138 vs對照組:1.000±0.234,t=3.897,P=0.005)的表達也出現了明顯下降(表3),這表明細胞增殖也被顯著抑制。以上的結果表明,在體外模型中SOX9基因可以調控活化的LX2細胞的活化與增殖,敲減LX2細胞中的SOX9基因有可能起到緩解肝纖維化的作用。

表3 qPCR檢測LX2細胞膠原合成基因及SOX9基因相對表達

表4 敲減SOX9基因后檢測細胞活化與增殖相關基因

討 論

肝纖維化是不同肝臟疾病進展的共同階段,持續的肝纖維化進展常伴隨著多種預后不良的表現,如肝硬化、門脈高壓、肝性腦病、肝腎綜合征等,嚴重影響了人類的健康[10-11]。目前慢性肝病已經成為了慢性疾病的最主要原因之一,包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病等都是重大的公共衛生問題。肝纖維化是慢性肝病發展的終末階段,但是目前仍沒有有效的治療手段。因此深入探討肝纖維化的病理生理學機制并且尋找到有效的治療靶點就顯得尤為重要。

目前對于肝纖維化的治療主要是以病因治療及對癥治療為主。針對病毒性肝炎主要是對應的抗病毒治療治療,NAFLD則是飲食習慣的調整及運動改善,自身免疫性肝病則是相對應的激素及膽汁酸治療。但是這些治療手段都有一定的局限性,因此尋找肝纖維化的治療靶點有很好臨床轉化研究意義。在本項研究中,我們構建了肝纖維化小鼠模型以及使用了LX2人肝星狀細胞系來評估SOX9基因在肝纖維化中發揮的作用。首先我們使用經典的四氯化碳腹腔注射的方向構建肝纖維化小鼠模型以及使用TGFβ1誘導LX2細胞,促進細胞活化。我們發現在纖維化的小鼠肝臟及活化的LX2細胞中,SOX9基因出現了明顯的上升。因此我們推測SOX9基因可能參與了肝纖維化的進展。隨后我們在活化的LX2細胞中敲減了SOX9基因的表達,我們發現膠原合成的相關基因α-SMA、Col1的表達都出現了明顯下降,這表明肝星狀細胞的活化受到了顯著的抑制。此外細胞增殖的相關基因包括PCNA、CyclinD1的表達也出現了明顯下降,這表明肝星狀細胞的增殖也被明顯抑制。肝星狀細胞細胞的活化與增殖是肝纖維化進展中最主要的標志事件。結果表明敲減SOX9基因可以顯著抑制這一過程。

SOX9基因是SOX基因家族的重要成員之一。SOX基因家族是一類與胚胎發育相關的核轉錄因子,由于這個基因家族與男性Y染色體上的SRY(Sex-determining region of Y chromosome)基因同源而得名[12]。SOX9基因已經被發現了在心肌纖維化和肺纖維化中都發揮了重要的作用。Gu等[13]的研究發現敲低SOX9可以通過Wnt/β-catenin信號通路減輕氣管纖維化,Raza等人[14]的結果發現SOX9基因可以通過激活NAV3驅動腎臟成纖維細胞的激活,導致腎纖維化。Scharf等[15]的結果發現SOX9基因在心肌纖維化的進程中同樣發揮了重要的作用,高表達的SOX9基因可以顯著促進心肌細胞的的炎癥反應,促進纖維化的進展。

目前SOX9基因在肝纖維化中的作用尚不明確,因此我們的研究證明了SOX9基因在肝纖維化的進程中表達明顯提升,敲減SOX9基因后肝星狀細胞的活化與增殖受到了顯著的抑制,肝纖維化可以得以緩解,這些結果提示SOX9基因可能成為治療肝纖維化重要的治療靶點。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。