APP/PS1 轉基因小鼠腦組織環狀RNA的差異表達譜及相關ceRNA構建

馬琳秋,侯明亮,李金平,楊紅巖,廖旗榮,李小雄,洪文娟,周華東,2

(1.蚌埠醫科大學第一附屬醫院 神經內科,安徽 蚌埠 233004;2.陸軍特色醫學中心 神經內科,重慶400020)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是老年人癡呆的最常見原因。它是一種中樞神經系統退行性疾病,主要病理特征為β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積和高度磷酸化的tau蛋白形成的神經纖維纏結[1-2]。由于該疾病的復雜性,其病理生理機制尚不完全清楚。盡管全球AD病人的數量在不斷增加,但目前尚無針對 AD 的有效治療方法。近年來人們發現非編碼 RNA可以通過多種不同機制控制基因表達程序來調節細胞功能。其中環狀RNA (circRNA)是一類具有完整閉環結構的非編碼RNA,在哺乳動物的神經元中非常豐富[3]。研究[4-5]表明,一些circRNA在神經炎癥、氧化應激和自噬以及Aβ的產生和降解中發揮重要的調節作用。因此,進一步研究circRNA在基因調控中的作用有利于增進對AD發病機制的研究,并通過尋找潛在的治療靶點為AD診斷和治療提供新策略。本研究使用APP/PS1轉基因小鼠模型,采用基因芯片技術篩選出差異表達的circRNA,預測并構建circRNA-miRNA-mRNA調控網絡,探討差異表達circRNA在AD發病機制中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取3只10月齡APP/PS1轉基因雄性小鼠,作為AD組,同窩10月齡C57BL小鼠3只作為空白對照組。實驗動物均購自南京君科生物工程有限公司,動物許可證號:SCXK(蘇)2020-0009。通過頸椎脫位法分別處死2組小鼠,將獲得的腦組織保存在液氮中備用。實驗過程中遵循實驗動物倫理規定。

1.2 儀器和試劑

NanoDrop ND-1000型分光光度儀購自美國NanoDrop公司,Agilent DNA微陣列掃描儀、Agilent Feature Extraction v11.0.1.1軟件和GeiieSpring GX v12.1軟件購自美國Agilent公司,9700型PCR儀購自美國 Applied Biosystems公司。Arraystar小鼠circRNA V4.0芯片、Arraystar表達譜芯片配套試劑盒及2×PCR master mix試劑盒購自美國Arraystar公司,Trizol試劑和SuperScriptTMⅢ RT master mix 試劑盒購自美國Invitrogen公司,RNeasy Mini Kit試劑盒購自美國Qiagen公司。

1.3 RNA 提取和芯片雜交

用RNA提取試劑盒Trizol從小鼠腦組織中提取總RNA。采用ND-1000紫外分光光度計測定 RNA的濃度并評估純度。RNA完整性通過標準變性凝膠電泳進行評估。使用Arraystar小鼠circRNA V 4.0 芯片和Arraystar表達譜芯片配套試劑盒進行基因芯片雜交,并應用Agilent Feature Extraction軟件獲得芯片信號強度圖和原始數據,對雜交圖像進行差異數據分析。

1.4 實時熒光定量PCR反應(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)

在差異表達的circRNA中隨機選擇 5個circRNA進行qRT-PCR驗證。按照SuperscriptTMⅢ RT轉錄試劑盒說明書步驟,反轉錄為互補DNA (complementary DNA,cDNA)。反轉錄條件為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40個循環。引物由上海數譜生物科技有限公司合成,各引物序列見表1。將所得 cDNA 按照2×PCR master mix試劑盒說明進行操作,反應條件為:95 ℃ 10 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 60 s,40 個循環。以GAPDH作為內參,由反應曲線得出閾值循環參數,應用QuantStudioTM5 real-time PCR儀分析熒光閾值(cycle threshold,Ct)。采用 2-△△Ct法計算相對表達量。

表1 目的基因引物序列

1.5 基因本體(gene ontology,GO)功能分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析

將差異表達的circRNA母源基因通過GO數據庫(http://www.geneontology.org)進行 GO 功能富集分析,通過 KEGG 數據庫(http://www.genome.jp/kegg)對差異表達的基因進行KEGG通路富集分析。

1.6 circRNA-miRNA-mRNA 網絡的構建

差異表達的circRNA通過錯誤發現率(FDR)≤0.001及差異倍數篩選,利用TargetScan數據庫和miRanda的miRNA靶標預測軟件預測circRNA-miRNA和miRNA-mRNA之間的結合關系,應用Cytoscape3.4.0構建circRNA-miRNA-mRNA調控網絡,對circRNA競爭性網絡靶向mRNA進行GO和KEGG通路富集分析。

1.7 統計學方法

采用t檢驗。

2 結果

2.1 circRNA差異表達分析

AD組與對照組比較,通過circRNA芯片鑒定,定義差異倍數>1.5且P<0.05的circRNA具有差異表達,共篩選出52個差異有統計學意義的circRNA,其中28個上調,24個下調。根據差異表達的circRNA繪制熱圖(見圖1)和火山圖(見圖2),差異表達前10位的circRNA基本信息見表2。

表2 差異表達前10位的circRNA的基本信息

2.2 差異表達circRNA的qRT-PCR驗證結果

芯片結果存在假陽性,為保證研究可靠性,采用qRT-PCR驗證基因芯片的結果。結果顯示,選取的5個circRNA中,3個上調(mmu_circRNA_24012,mmu_circRNA_41461,mmu_circRNA_40341),2個下調(mmu_circRNA_29978,mmu_circRNA_35922)。除了mmu_circRNA_41461有上調趨勢但差異無統計學意義,其余4個circRNA變化趨勢與基因芯片結果一致,差異有統計學意義(P<0.05～P<0.01)(見表3)。

表3 2組小鼠腦組織目的基因的相對表達量

2.3 差異表達circRNA的GO功能富集分析

對差異表達circRNA的母源基因進行GO功能富集分析,發現上調的差異表達circRNA主要富集的生物過程為定位和神經系統發育,細胞組成為細胞投射和神經元投射,分子功能為蛋白質結合和 Rho GTPase蛋白結合;下調的差異表達circRNA主要富集的生物過程為細胞成分的組裝和突觸組織,細胞組成為質膜外側的錨定成分和突觸膜,分子功能為結合和蛋白質結合(見圖3A、3B)。KEGG通路富集分析結果提示,上調的差異表達的circRNA的親本基因主要富集于調控干細胞多能性的信號通路和Hippo信號通路等;下調的差異表達的circRNA的親本基因主要富集于RNA運輸,肌醇磷酸鹽代謝和催產素信號通路等(見圖4)。

2.4 競爭性內源RNA (competing endogenous RNA,ceRNA)網絡構建及生物信息學分析

為了進一步闡明差異circRNA的生物學功能,使用miRanda和TargetScan數據庫預測得到具有結合位點的circRNA-miRNA 和 miRNA-mRNA 關系對,構建circRNA-miRNA-mRNA 三元轉錄網(見圖5)。對ceRNA網絡mRNA進行GO功能富集及KEGG通路富集分析發現,GO富集的分子功能主要為蛋白質結合、催化活性、小分子結合;細胞成分主要為漿膜、漿膜約束的細胞投射、神經元投射;生物過程主要為對運輸的正向調節、定位、對定位的調節。根據KEGG通路富集分析提示其主要富集于cAMP信號通路、Rap1信號傳導途徑、C型凝集素受體信號通路、HIF-1信號傳導途徑等信號通路(見圖6、7)。

3 討論

AD是一種與年齡相關的破壞性神經退行性疾病,主要癥狀包括記憶力減退和學習能力下降。AD的發生發展涉及多種因素,其病理機制尚不完全清楚。作為非編碼RNA,circRNA雖然不能直接編碼翻譯蛋白質,但是能夠充當“miRNA海綿”,參與轉錄后調控。circRNA通過與miRNA反應原件結合,降低 miRNA 與下游靶向 mRNA 的結合,從而減少miRNA介導的基因抑制表達,影響靶基因的表達,即ceRNA調控機制[6-7]。許多研究已經證明circRNA可以參與多種疾病的病理過程,例如,XU等[8]發現circCCAC1 通過靶向 YY1 的 miR-514a-5p 促進膽管癌腫瘤發生;張兵等[9]報道可通過干擾circPTPRA來上調miR-140-5p的表達而抑制類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖和遷移。

circRNA是一類在神經系統中高度表達的非編碼RNA,研究表明circRNA在神經元發育和衰老過程中是動態調節的,它們在突觸水平上富集,并在突觸可塑性中發揮重要作用,突觸可塑性是學習和記憶的基礎[10],可能參與了AD 和其他神經退行性疾病的發生發展。例如,散發型AD病人海馬CA1區circRNA CDR1as/ciRS-7的表達被下調[11]。由于降低了ciRS-7“海綿”效應,miR-7活性增加,可以下調AD相關靶標,包括泛素蛋白連接酶UBE2A,這是AD中清除淀粉樣肽所必需的蛋白。此外,在SH-SY5Y細胞中,最近發現ciRS-7以NF-κB依賴性方式促進APP和BACE1的降解[12]。WU等[13]報道circ-LPAR1在AD病人中高表達,通過靶向CHP-212和IMR-32細胞中的miR-212-3p,提高Aβ刺激的神經元凋亡、炎癥和氧化應激。CHEN等[14]報道circ-NF1-419通過結合AD樣小鼠的Adaptor protein 2b1和Dynamin-1來調節老年癡呆。LI等[15]報道circ-AXL可促進AD細胞模型神經元損傷和炎癥反應,通過靶向miR-328介導BACE1加速AD的進展。

為了探討circRNA在AD中的潛在作用,本研究利用circRNA的基因芯片分析AD小鼠模型存在的差異表達circRNA。結果表明,與對照組相比,AD小鼠模型腦組織中共篩查出52個差異表達的circRNA,其中表達上調有28個,表達下調有24個。我們對差異表達circRNA的母源基因進行了GO和KEGG分析。GO功能富集分析發現上調的差異表達circRNA主要富集的生物過程為定位和神經系統發育,細胞組成為細胞投射和神經元投射,分子功能為蛋白質結合和 Rho GTPase蛋白結合;下調的差異表達circRNA主要富集的生物過程為細胞成分的組裝和突觸組織;細胞組成為質膜外側的錨定成分和突出膜;分子功能為結合和蛋白質結合。在KEGG分析中發現差異表達的circRNA的親本基因主要富集于調控干細胞多能性的信號通路、Hippo信號通路、RNA運輸磷脂酰肌醇信號傳導通路等。Hippo信號通路在細胞功能中發揮著重要作用。Hippo信號傳導的激活誘導細胞死亡,而Hippo信號傳導的失活則引發細胞增殖[16]。最近的研究[17]表明,Hippo途徑在AD的發病機制中起著重要作用,Hippo信號的過度激活可以導致Aβ42毒性增強,并影響Aβ42介導的神經退行性,而下調Hippo信號通路可以挽救Aβ42介導的神經退行性。提示差異circRNA可能參與AD的多個調控機制。

目前,circRNA-miRNA-mRNA競爭系統已被發現是AD中一個重要的表觀遺傳調控環[18]。為此,本研究通過miRanda等數據庫預測與差異circRNA存在結合位點的miRNA和miRNA-mRNA關系對構建ceRNA調控網絡。本研究中預測的mmu_circRNA_ 35922是通過靶向 miR-346-3p調節鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ a(CaMKⅡa)。CaMKⅡa是一種多功能蛋白激酶,是鈣信號傳導的關鍵參與者,在記憶處理,學習和神經可塑性中起著至關重要的作用[19]。CaMKⅡa失調也是AD發展的關鍵和早期信號。淀粉樣蛋白前體蛋白和tau蛋白可被過度活躍的CaMKⅡa磷酸化,導致Aβ和神經原纖維纏結形成[20-21]。這些結果表明差異表達的circRNA相關ceRNA網絡可以為AD提供新的見解,從而為該疾病提出新的治療方法。

綜上所述,本研究篩選出AD小鼠腦組織中多種差異表達的circRNA,如表達上調的 mmu_circRNA_24012、 mmu_circRNA_40341,表達下調的 mmu_circRNA_29978、mmu_circRNA_35922,這些差異基因可能通過circRNA-miRNA-mRNA調節網絡參與AD發生的分子調控。本研究有望為 AD的診療及發生發展提供新的研究靶點和方向。而關于circRNA如何通過ceRNA網絡具體參與AD的發病機制尚不清楚,后續可通過細胞和動物實驗作更深入的研究。