湖北楓楊總黃酮對非小細胞肺癌A549細胞遷移、侵襲和鐵死亡的影響*

陳國慶， 董倩男， 楊 銳， 高 瑛， 劉人嘉， 袁 林， 向 陽，2，， 吳 昊，△

（1湖北恩施學院醫學部，湖北 恩施 445000；2湖北恩施學院附屬恩施慧宜中西醫結合風濕醫院，湖北 恩施 445000；3湖北民族大學風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000）

肺癌是目前全球發生率和致死率較高的腫瘤之一。據統計，2021年約有235萬新發肺癌病例和131萬肺癌死亡病例［1］。肺癌中占比80%～85%的是非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer， NSCLC），其中中晚期確診的人數比例較大，臨床上NSCLC治療方式主要包括傳統藥物治療、抗血管生成治療、免疫治療以及靶向治療等，但臨床效果仍不理想，且在治療過程中常發生不良反應［2-4］。因此，探索更多藥物及方法治療NSCLC具有重要意義。

研究發現，已有多種中藥的總黃酮成分可調控多靶點、多通路并有效抑制腫瘤細胞增殖，發揮抗腫瘤效應［5］。湖北楓楊作為恩施民間常用的抗風濕藥物，其中含有豐富的黃酮成分，湖北楓楊總黃酮（total flavonoids ofPterocarya hupehensisSkan， PHSTF）已被發現具有促進“類腫瘤樣”細胞MH7A凋亡以及能調控Fas介導的死亡受體以誘導A549細胞凋亡的作用［6］，提示PHSTF可能作為一種潛在的藥物治療NSCLC，但PHSTF是否能夠通過其他途徑干預NSCLC還需進一步研究。

鐵死亡是一種以細胞內鐵過載、脂質過氧化為特征的程序性細胞死亡方式［7］，研究發現誘導腫瘤細胞鐵死亡能夠有效抑制腫瘤增殖及腫瘤耐藥的發展［8］?；诖?，本研究以A549細胞為研究對象，探究湖北楓楊總黃酮對A549鐵死亡的影響，以期為臨床治療NSCLC提供研究基礎。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞株 A549細胞由湖北民族大學風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室贈與，培養液配制：RPMI 1640培養液、10%胎牛血清、1%青、鏈霉素混合，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2 藥物及制備 本研究純化的湖北楓楊總黃酮由湖北風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室贈與，蘆丁法測得總黃酮純度為78%。提取后先用DMSO初步溶解，使用時以培養液稀釋（最終DMSO終濃度不超過0.1%）。

1.3 主要試劑及儀器 RPMI 1640培養液（貨號：SH30027.01）購自Cytiva；胎牛血清（貨號：C2910-0500）購自上海逍鵬生物科技有限公司；青、鏈霉素（貨號：15140122）購自Gibco；蘆丁標準品（貨號S13033）購自廣州碩譜生物科技有限公司；DMSO（貨號：D1435）購 自Sigma；CCK-8試 劑 盒（貨 號：KR0009）購自武漢科瑞生物技術有限公司；Transwell小室（貨號：22521040）和Matrigel（貨號：356234）購自Corning；0.1%結晶紫溶液（貨號：G1063）購自北京索萊寶科技有限公司；谷胱甘肽（glutathione，GSH）測定試劑盒（貨號：A006-2-1）購自南京建成生物工程研究所；PMSF蛋白酶抑制劑（貨號：P1046）購自碧云天生物技術有限公司；RIPA裂解液（貨號：G2002）購自武漢塞維爾生物科技有限公司；預染蛋白Marker（貨號：26616）購自Thermo；PVDF膜和ECL發光液（貨號分別為ISEQ00010和WBKLS0500）購自Millipore；溶質載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11， SLC7A11）、谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）、Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein-1， Keap-1）、核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2， Nrf2）和血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1， HO-1）抗體（貨號分別為26864-1-AP、67763-1-Ig、10503-2-AP、80593-1-RR和10701-1-AP）購自Proteintech；山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG和β-actin抗體（貨號分別為B900610、SA00001-1和20536-1-AP）購自Proteintech；鐵死亡特異性抑制劑liproxstatin-1（Lip-1；貨號：HY-12726）購自上海陶素藥業有限公司。Multiscan Go酶標儀（Thermo Fisher Scientific）；IX73型倒置熒光顯微鏡（Olympus）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；311型CO2細胞培養箱（Thermo Fisher Scientific）；Light Cycler 480 II實時熒光定量PCR儀（Roche）；ImageQuant LAS 4000mini生物分子成像儀（GE）。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測細胞活力 取對數生長期的A549細胞，每孔取100 μL （細胞密度為5×103/mL）的細胞懸液接種于96孔板，細胞貼壁生長12 h后，加含0、25、50、100、150及200 μg/mL的湖北楓楊總黃酮的培養液培養，每組6個復孔，另設空白組，放入培養箱中分別培養24、48、72 h后，向每孔加入CCK-8工作液10 μL，再放入培養箱孵育1 h，酶標儀下測定波長450 nm處各孔吸光度（A）值，計算細胞活力，實驗獨立重復3次。

2.2 劃痕實驗檢測細胞遷移 取對數生長期的A549細胞，每孔取2 mL（每孔2×105個）的細胞懸液接種于6孔板中，待A549 細胞生長融合到達 80%后，在孔底部劃3條等間距的平行線，隨后用PBS反復沖洗3次，清除劃落細胞，加入無血清培養液以及含25、50、100 μg/mL湖北楓楊總黃酮無血清培養液培養，分別拍下三條劃痕照片，并用ImageJ軟件進行面積分析，劃痕愈合率（%）=（s0h-s24h或s48h）/s0h×100%。

2.3 Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲 取對數生長期的A549細胞每孔取2 mL（每孔2×105個）的細胞懸液接種于6孔板中，培養4 h后，加入無血清培養液以及含25、50、100 μg/mL湖北楓楊總黃酮無血清培養液培養24 h，收集細胞，并調整細胞密度為5.0×105/mL。將Transwell小室上室鋪Matrigel基質膠（遷移實驗時無基質膠），自然晾干。下室加入650 μL無血清DMEM，上室取100 μL各組細胞懸液。培養箱靜置培養24 h后，用4%多聚甲醛固定細胞，隨后用0.1%的結晶紫溶液染色，顯微鏡觀察并拍照，用ImageJ軟件計數，計算遷移、侵襲率的變化。

2.4 Lip-1與湖北楓楊總黃酮聯合處理對A549細胞活力的影響 取對數生長期的A549細胞，每孔取100 μL的細胞懸液（5×103/mL）接種于96孔板，設置對照（control）組、鐵死亡抑制劑Lip-1組、高劑量（200 μg/mL）PHSTF組和Lip-1+PHSTF （200 μg/mL）組。細胞貼壁生長12 h后，各給藥組分別加入含培養液稀釋的相應藥物，每組設置6個復孔，繼續培養24 h，按“2.1”項下方法測定細胞存活率。

2.5 細胞內GSH水平測定 取對數生長期的A549細胞，每孔取2 mL（每孔含2×105個細胞）細胞懸液接種于6孔板中，待細胞密度達80%后，設置對照組和湖北楓楊總黃酮100、150、200 μg/mL組，加入含相應藥物的培養液處理24 h，胰酶消化后離心收集細胞，對細胞進行超聲處理，操作過程中采用GSH試劑盒說明書中的步驟測定GSH水平。

2.6 RT-qPCR檢測 按“2.5”項處理，收集細胞，根據試劑盒說明書提取總RNA，使用Prime ScriptTMRT Master和TB Green?Premix Ex TaqTM說明書進行cDNA反轉錄和qPCR。以β-actin為內參照，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。序列如下：SLC7A11上游引物序列為5′-TCTCCAAAGGAGGTTACCTGC-3′，下游引物序列為5′-AGACTCCCCTCAGTAAAGTGAC-3′；GPX4上 游 引 物 序 列 為5′-GAGGCAAGACCGAAGTAAACTAC-3′，下游引物序列為5′-CCGAACTGGTTACACGGGAA-3′；β-actin上游引物序列為5′-TGGCACCAGCACAATGAA-3′，下游引物序列為5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，由上海生工合成。

2.7 Western blot檢測 按“2.5”項處理及收集細胞。加入含PMSF的RIPA裂解液在冰上裂解A549細胞，裂解完成后把樣本放入沸水中，加熱使其蛋白變性，完成后采用BCA法定量。隨后進行SDSPAGE實驗，電泳完成后轉至PVDF膜，TBST洗膜，用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h， TBST洗膜4次（每次8 min），分別加入SLC7A11、GPX4、Keap-1、Nrf2、HO-1及β-actin Ⅰ抗（均為1∶10 00）于4 ℃ 環境中孵育過夜，TBST洗膜，加入Ⅱ抗（1∶10 000），室溫孵育1.5 h后采用多功能凝膠成像儀進行化學發光顯影，采用ImageJ軟件進行灰度分析，統計蛋白相對表達量。

2.8 Lip-1與湖北楓楊總黃酮聯合處理對A549細胞鐵死亡相關蛋白表達的影響 按“2.4”項中分組處理細胞，待細胞密度達80%后，分別加入含相應藥物的培養液，于培養箱中培養24 h。收集細胞，Western blot檢測鐵死亡相關蛋白的表達。

3 統計學處理

采用GraphPad Prism 9.0軟件進行統計分析，計量數據以均數±標準差（mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 湖北楓楊總黃酮對A549細胞活力的影響

為了觀察湖北楓楊總黃酮在不同濃度以及不同處理時間下對A549細胞活力的影響，我們加入（25、50、100、150和200 μg/mL）的湖北楓楊總黃酮分別處理細胞24、48和72 h，并通過CCK-8法以及細胞結晶紫染色法檢測細胞活力。如圖1所示，與未經加藥處理的對照組相比，100、150、200 μg/mL的湖北楓楊總黃酮處理下的A549細胞活力均明顯降低（P＜0.01），且呈時間與劑量相關性。因此在后續的遷移及侵襲實驗中選用0、25、50、100 μg/mL的湖北楓楊總黃酮處理A549細胞；而在探究湖北楓楊總黃酮對A549細胞鐵死亡的影響時，選用100、150、200 μg/mL的湖北楓楊總黃酮處理A549細胞。

Figure 1.Effect of total flavonoids of Pterocarya hupehensis Skan （PHSTF） on the viability of A549 cells.A： the cells were treated with different concentrations （25， 50， 100， 150 and 200 μg/mL） of PHSTF for 24， 48 and 72 h， and the cell viability was detec-ted by CCK-8 assay；B： the morphological changes of A549 cells was observed by microscopy（×100）.Mean±SD.n=6.*P＜0.05， **P＜0.01 vs 0 μg/mL PHSTF group.圖1 湖北楓楊總黃酮對A549細胞活力的影響

2 湖北楓楊總黃酮對A549細胞遷移及侵襲的影響

為了探究湖北楓楊總黃酮能否通過抑制A549的遷移及侵襲，我們通過劃痕實驗以及Transwell實驗檢測發現，如圖2所示，與對照組相比，隨著湖北楓楊總黃酮給藥劑量的增大，A549細胞的傷口愈合面積明顯增大（P＜0.01），并且A549遷移與侵襲至下室的數量顯著減少（P＜0.01），A549細胞的遷移及侵襲能力顯著被抑制。實驗結果表明湖北楓楊總黃酮可抑制A549細胞的遷移及侵襲。

Figure 2.Effect of total flavonoids of Pterocarya hupehensis Skan （PHSTF） on the migration and invasion of A549 cells.A： the cells were treated with different concentrations （25， 50 and 100 μg/mL） of PHSTF for 24 and 48 h， and the cell migration ability was detected by scratch assay；B： the cells were treated with different concentrations （25， 50 and 100 μg/mL） of PHSTF for 24 h， and the cell migration and invasion abilities were detected by Transwell assay.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs 0 μg/mL PHSTF group.圖2 湖北楓楊總黃酮對A549細胞遷移及侵襲的影響

3 Lip-1與湖北楓楊總黃酮聯合處理對A549細胞活力的影響

為了探索湖北楓楊總黃酮能否通過除誘導A549細胞凋亡以外的途徑抑制細胞增殖，我們聯合鐵死亡抑制劑Lip-1與湖北楓楊總黃酮處理細胞，觀察Lip-1對湖北楓楊總黃酮引起的細胞活力下降的恢復效果，以此進一步論證其對A549細胞鐵死亡的影響。如圖3所示，CCK-8結果顯示Lip-1對湖北楓楊總黃酮所致的細胞活力下降有恢復作用（P＜0.01），提示湖北楓楊總黃酮可能通過誘導A549細胞鐵死亡抑制其增殖。

Figure 3.Effect of total flavonoids of Pterocarya hupehensis Skan （PHSTF） combined with ferroptosis inhibitor liproxstatin-1 （Lip-1） on the viability of A549 cells.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs PHSTF group.圖3 湖北楓楊總黃酮與鐵死亡抑制劑Lip-1聯合處理對A549細胞活力的影響

4 湖北楓楊總黃酮對A549細胞GSH水平的影響

鐵死亡的發生常伴隨著GSH水平下降，為了進一步探討湖北楓楊總黃酮對A549細胞鐵死亡的誘導作用，我們通過GSH試劑盒檢測發現，如圖4所示，與未經過湖北楓楊總黃酮處理組比較，湖北楓楊總黃酮組隨著給藥量的增大，A549細胞GSH的含量逐漸降低（P＜0.01），提示在湖北楓楊總黃酮干預A549細胞后，A549細胞內脂質過氧化水平升高。

Figure 4.Effect of total flavonoids of Pterocarya hupehensis Skan （PHSTF） on GSH level in A549 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 0 μg/mL PHSTF group.圖4 湖北楓楊總黃酮對A549細胞內GSH水平的影響

5 湖北楓楊總黃酮對A549細胞鐵死亡相關標志物mRNA表達的影響

通過RT-qPCR檢測鐵死亡相關標志物SLC7A11以及GPX4的mRNA表達水平，與未經過加藥處理組比較，各劑量湖北楓楊總黃酮組A549細胞鐵死亡標志物SLC7A11和GPX4 mRNA表達量隨著藥物劑量的升高顯著降低（P＜0.01），見圖5。實驗結果表明湖北楓楊總黃酮能通過調控A549鐵死亡抑制其增殖。

Figure 5.Effect of total flavonoids of Pterocarya hupehensis Skan （PHSTF） on the mRNA expression of ferroptosis markers in A549 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 0 μg/mL PHSTF group.圖5 湖北楓楊總黃酮對A549細胞鐵死亡標志物mRNA表達的影響

6 湖北楓楊總黃酮對A549細胞鐵死亡相關蛋白表達的影響

為了繼續探索湖北楓楊總黃酮誘導A549細胞鐵死亡的關鍵通路，我們通過Western blot實驗發現，如圖6所示，與未加藥處理組比較，經湖北楓楊總黃酮干預后A549細胞內Keap-1蛋白表達水平隨著湖北楓楊總黃酮劑量的增大顯著升高（P＜0.01），SLC7A11、GPX4、Nrf2、HO-1蛋白表達水平隨著湖北楓楊總黃酮劑量的增大明顯下降（P＜0.01），表明Keap-1/Nrf2/HO-1通路可能是湖北楓楊總黃酮激活鐵死亡的途徑。

Figure 6.Effect of total flavonoids of Pterocarya hupehensis Skan （PHSTF） on ferroptosis-related protein expression in A549 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 0 μg/mL PHSTF group.圖6 湖北楓楊總黃酮對A549細胞鐵死亡相關蛋白表達的影響

7 Lip-1與湖北楓楊總黃酮聯合處理對 A549 細胞鐵死亡相關蛋白表達

如圖7所示，與湖北楓楊總黃酮組比較，Lip-1顯著升高湖北楓楊總黃酮誘導的SLC7A11，GPX4，Nrf2、HO-1蛋白的表達水平（P＜0.01），顯著下調湖北楓楊總黃酮誘導的Keap-1蛋白的表達水平（P＜0.01），進一步說明湖北楓楊總黃酮可通過調控Keap-1/Nrf2/HO-1通路誘導A549細胞鐵死亡。

Figure 7.Effect of total flavonoids of Pterocarya hupehensis Skan （PHSTF） combined with ferroptosis inhibitors liproxstatin-1（Lip-1） on the expression levels of ferroptosis-related proteins in A549 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs PHSTF group.圖7 湖北楓楊總黃酮與鐵死亡抑制劑Lip-1聯合處理A549細胞對鐵死亡相關蛋白表達水平的影響

討 論

在預防及治療癌癥過程中，通過誘導腫瘤細胞程序性死亡以及抑制腫瘤細胞的遷移與侵襲是癌癥治療的常見策略［9-10］。本研究中我們通過劃痕以及Transwell實驗發現湖北楓楊總黃酮可抑制A549細胞的遷移及侵襲且具有藥物劑量依賴性，提示湖北楓楊總黃酮具有干預NSCLC的潛在特性。此外，有研究發現湖北楓楊總黃酮可通過誘導A549細胞凋亡從而抑制細胞增殖。為了探索湖北楓楊總黃酮能否通過其他途徑抑制A549細胞增殖，在本研究中我們使用鐵死亡抑制劑Lip-1聯合湖北楓楊總黃酮處理A549細胞，觀察到Lip-1可恢復湖北楓楊總黃酮對A549細胞活力的抑制。已有研究證明Lip-1能通過逆轉tiliroside誘導的肝癌細胞鐵死亡進而保護肝癌細胞存活［11］，表明湖北楓楊總黃酮具有潛在誘導A549細胞鐵死亡從而抑制其增殖的特性。鐵死亡作為一種獨特的非凋亡型細胞程序性死亡方式，其發生的主要標志為脂質過氧化物升高，包括抗氧化的SLC7A11、GPX4蛋白活性降低以及GSH消耗等［12-13］。在本研究中我們發現隨著湖北楓楊總黃酮劑量的增大，A549細胞中GSH含量以及SLC7A11、GPX4 mRNA及蛋白表達量顯著減少，A549細胞脂質過氧化水平明顯增高，表明湖北楓楊總黃酮可能誘導A549細胞鐵死亡。為了進一步驗證湖北楓楊總黃酮可通過誘導A549細胞鐵死亡從而抑制細胞增殖，在本研究中我們發現Lip-1可升高湖北楓楊總黃酮所抑制的SLC7A11、GPX4蛋白表達量，提示湖北楓楊總黃酮能通過影響A549鐵死亡從而抑制細胞增殖。

Keap-1/Nrf2/HO-1通路作為調控細胞鐵死亡的關鍵通路之一，其中Nrf2是一種能通過抑制細胞內應激反應從而提高腫瘤細胞抗氧化能力的轉錄因子［14］。正常生理狀態下，Nrf2在受Keap-1刺激后發生泛素化及蛋白酶降解，Nrf2表達水平降低，從而使若干下游抗氧化酶（如HO-1）的表達降低；然而在腫瘤細胞發生發展過程中Nrf2降解狀態解除，隨之Nrf2的激活促進下游HO-1等一系列抗氧化蛋白表達的升高，抑制腫瘤細胞內脂質過氧化水平，腫瘤細胞產生鐵死亡抵抗，抑制Nrf2可以增強肺癌細胞對化療藥物的敏感性［15-17］。有研究發現麥冬皂苷B通過抑制Nrf2/HO-1通路誘導A549細胞鐵死亡從而干預非小細胞肺癌的進展，柴胡皂苷A可通過抑制Nrf2/HO-1通路誘導A549鐵死亡并增強順鉑對A549細胞的敏感性［18-19］。本研究發現湖北楓楊總黃酮可升高Keap-1的表達，降低A549細胞Nrf2、HO-1的表達，提示湖北楓楊總黃酮可能通過Keap-1/Nrf2/HO-1通路誘導A549細胞鐵死亡。本研究使用湖北楓楊總黃酮聯合鐵死亡特異性抑制劑Lip-1處理A549細胞，我們發現Lip-1可升高湖北楓楊總黃酮抑制的Nrf2、HO-1蛋白表達，并降低湖北楓楊總黃酮誘導的Keap-1蛋白表達。

綜上所述，本實驗表明湖北楓楊總黃酮也可通過非凋亡的鐵死亡途徑抑制A549細胞增殖，其作用機制與降低SLC7A11以及GPX4的表達并升高A549細胞脂質過氧化水平有關，Keap-1/Nrf2/HO-1通路在該過程中發揮關鍵作用。后續對于湖北楓楊總黃酮誘導A549鐵死亡的其他途徑以及聯合現有化療藥物能否達到更好的結果有待進一步研究。