南京椴花化學成分鑒定及不同發育時期黃酮類化合物差異分析

原 曉,王歡利,王奇志,3,黃 犀,嚴靈君,湯詩杰,3*

(1 南京中醫藥大學,南京 210023;2 江蘇省中國科學院 植物研究所,南京 210014;3 江蘇省植物資源研究與利用重點實驗室,南京 210014)

椴樹屬(TiliaLinn.)隸屬于錦葵科(Malvaceae)椴樹亞科(Tilioideae),落葉喬木,主要分布于溫帶及亞熱帶地區,全球共23種,東亞17種,其中中國特有15種。絕大多種分布于黃河流域以南,五嶺以北廣大溫帶及亞熱帶地區,只有少數種分布于北回歸線以南或華北及東北地區。另外,在20 世紀90年代,中國東北、華北及華東等地相繼開展了歐美椴樹品種的引種工作,包括心葉椴(TiliacordataMill.)和闊葉椴(T.platyphyllosScop.)等品種[1]。椴樹栽培歷史悠久,具有優良的觀賞及經濟價值,是優良的蜜源、材用、藥用、纖維用及園林觀賞植物[2]。南京椴作為華東地區特色的鄉土樹種,具有良好的生長適應性及開發應用前景。隨著南京椴繁殖及栽培技術的突破,目前江蘇省的南京椴苗木數量已初具規模。然而,在現有資源基礎上,開發南京椴相關產品,為苗木產業提質增效具有十分積極的作用。

歐洲藥典9.0中有關椴樹花(Tiliaeflos)的專論介紹,將其定義為采自T.platyphyllosScop.、T.cordataMill.、T.×vulgarisHayne(syn.T.×europaeaL.)的整枝干花或其混合物[3]。在中醫上用于治療偏頭痛、癔病、肝膽疾病、動脈硬化性高血壓、支氣管炎等,同時可作為鎮靜劑、利尿劑、祛痰劑以及發汗劑。歐洲委員會將其列為食品香料的天然來源(N2 類)[4]。此外,菩提茶具有保濕和收斂性,可作為化妝品的原料[5]。迄今為止,該屬植物中已分離到上百種天然產物,包括黃酮類(flavonoids)、有機酸(organic acids)、萜類(terpenes)、揮發油類(essential oils)、生物堿類(alkaloids)、甾體類(steroids)、烷烴類(alkanes)、糖類(saccharides)和苯丙素類(phenylpropanoids)等。

椴樹花的主要成分為黃酮類化合物[5]。Frezza等在銀毛椴花序中鑒定出13種化合物,主要由黃酮類化合物組成,其次是有機酸和五環三萜類化合物[6]。Karioti等在闊葉椴花序中鑒定到31種化合物,黃酮類化合物及其衍生物有23種[5]。小葉椴花中總黃酮含量達到13.32 mg/g[7],Fawzy等在小葉椴中鑒定并分離得到6種酚類物質(山奈酚、槲皮素、牡荊素、山奈酚 3-O-α-鼠李糖苷、槲皮素 3-O-β-半乳糖苷和山奈酚3-O-蕓香糖苷)[8]。黃酮類化合物最初被命名為維生素P,具有維持毛細血管通透性的作用[9];同時,黃酮類化合物可以干擾腫瘤細胞的增殖和轉移,抑制腫瘤組織血管的形成,誘導腫瘤細胞自噬或凋亡,并阻止腫瘤的侵襲[10];其次,黃酮類化合物具有清除自由基、調節脂蛋白、保護線粒體和改善心肌細胞纖維化,對心血管疾病具有治療潛力[11];另外,在控制體重和肥胖方面有潛在的作用,如黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶功能有抑制作用[12]。也有研究表明,黃酮類化合物不僅具有清除活性氧(reactive oxygen species)能力,還可以作為信號分子激活防御相關的信號通路[13]。

南京椴(T.miquelianaMaxim.)作為江蘇省的鄉土樹種,其花器官的化學成分尚未展開詳細研究,研究用UPLC-MS/MS鑒定南京椴花的化學成分,分析不同發育階段花中差異代謝物含量變化規律,為后續用多組學手段探究椴樹花中重要藥用化合物的代謝通路及調控機制解析奠定基礎,同時為椴樹花的采收提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 植物材料與處理

試驗材料:選取種植于江蘇省中國科學院植物研究所種植園(32.05°N,118.83°E)的10年生南京椴植株,設置3 個生物學重復(3 個南京椴單株)。依據花朵形態將采樣期共分為5期(圖1):始蕾期(2022年4月25日,A)、中蕾期(5月14日,B),末蕾期(6月2日,C)、盛花期(6月2日,D)和敗花期(6月10日,E)。樣品采集后以錫箔紙包裹,液氮速凍后置于55 ℃烘箱內脫水至恒重,隨即存放于-20℃冰箱保存備用。

圖1 南京椴花不同時期采集的樣本A.始蕾期;B.中蕾期;C.末蕾期;D.盛花期;E.敗花期。比例尺代表1 cm。Fig.1 Phenotypic traits of T.miqueliana Maxim.flowers at various developmental stagesA.Bud initiation stage.B.Middle bud stage.C.Final bud stage.D.Flower-opening stage.E.Final flowering period.The bar in the top-left corner represents 1 cm.

1.2 試劑與儀器

甲醇(色譜級)、乙腈(色譜級)。標準品:對香豆酸(sangon biotech,A506158-0250)、綠原酸(中檢所110753-200413)、原兒茶酸(Y-031-130711)、兒茶素(E-011-130816)、槲皮素(中檢所,100081-200907)、蘆丁(中檢所,100080-9504)、黃芩苷(中檢所,110715-200514)。

液質聯用儀(Agilent 1260 UPLC-DAD-6030 ESI-QTOF,美國Aglient 公司)、超聲波清洗儀(KQ-400DE,昆山禾創超聲儀器有限公司)、真空干燥箱(GZX-9070MBE,上海博訊實業有限公司)、電子計重秤(ACS-10,凱豐集團有限公司);1/10 000電子天平(瑞士Mettler-Toledo AE240,瑞士蘇黎世梅特勒—托利多集團)、純水機(SPING-S5i,南京妙之儀電子科技有限公司)、一次性帶針注射器(1 mL,江陰市醫療器械有限公司)、一次性針式過濾器(0.45 μm,津騰實驗設備有限公司)、移液槍(100～1 000 μL,Dragonlab)、高通量組織研磨機(LISK-48,南京立思高儀器有限公司)。

1.3 化合物提取及成分鑒定

1.3.1 供試品、標準品制備

選取盛花期(D)樣本為試驗材料,準確稱量0.1 g南京椴花,按照1∶15料液比加入50%甲醇溶液,在350 W 下超聲提取20 min,取出后冷卻室溫,補足溶液并搖勻,用0.22 μm 濾膜過濾后備用。

對照品貯備液:稱取1 mg對香豆酸、綠原酸、原兒茶酸、兒茶素、槲皮素、蘆丁6種對照品,配制1 mg/mL儲備溶液。

1.3.2 LC-MS/MS

液質聯用儀,美國安捷倫Agilent 1260 UPLCDAD-6030 ESI-QTOF MS;LC-MS色譜柱,Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×100 mm,2.7 μm);流動相:水(0.1%甲酸,A 相)、乙腈(B相);梯度洗脫程序:0 min,8%B;0～10 min,8%B;10～20 min,8%B～13%B;20～50 min,13%B～35%B;50～70 min,35%B～100%B。流速0.3 mL/min;進樣量5 μL;柱溫30 ℃。質譜條件:質譜檢測器ESI離子源,負離子模式;全掃范圍100～1 700 m/z;霧化器壓力344 738 Pa;干燥氣流速10 mL/min;干燥氣溫度350 ℃;毛細管電壓3 500 V;碎裂電壓190 V。

1.3.3 數據處理

用agilent mass hunter qualitative analysis software (Version 10.0)對LC-MS數據文件進行初步評估,通過比對標準品、自建數據庫、本地數據庫(PCDL公共數據庫)和文獻資料,根據保留時間、分子離子峰、碎片離子峰和紫外吸收等鑒定南京椴花中的代謝物。

1.4 不同發育期間椴樹花代謝組份分析

1.4.1 樣品處理

真空冷凍干燥后的植物材料研磨并準確稱取0.1 g粉末置于離心管,溶解在50%甲醇溶液中,在30 ℃下加入1.5 mL溶劑超聲萃取20 min,隨后將試管在室溫下以10 000 r/min離心10 min,上清液用0.22 μm 濾膜過濾并轉移到色譜進樣瓶中,用于LC-MS/MS分析。選取黃芩苷Baicalin 化合物作為內標,購買自中國食品藥品鑒定研究院(110715-200514),濃度為0.05 mg/mL。

1.4.2 數據處理

用Agilent MassHunter Profinder(Version 10.0)和MPP(mass profiler professional,Version 15.1)對南京椴花不同期液質檢測數據開展批量預處理,提高數據分析的質量。用SIMCA 14.1 (Umetrics,瑞典)軟件進行主成分分析(principal component analysis,PCA)、偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial leastsquares discrimination analysis,OPLS-DA)。用OriginPro 2023進行聚類分析(hierarchical clustering analysis,HCA),用SPSS 27.0 軟件進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 南京椴花中化合物成分鑒定

用超高效液相色譜-串聯質譜法對南京椴花進行UPLC-MS/MS分析。解析負離子模式下南京椴花醇提物一、二級質譜圖,比對數據庫和文獻,根據分子離子峰、碎片離子峰、保留時間、紫外吸收波長等指標對化合物進行鑒定,初步分析得到46種化合物(見表1)。有機酸及其衍生物13種;香豆素及其衍生物4種;1種酯;類黃酮28種,包括4種黃酮,16種黃酮醇,5種黃烷-3-醇和3種二氫黃酮。

表1 南京椴花化合物鑒定Table 1 Identification of compounds from flowers of T.miqueliana Maxim.

2.2 主成分分析和OPLS-DA分析

用MPP軟件對不同期液質檢測數據進行均一化處理,根據P＜0.05結合差異性倍數(FC≥2)篩選組間差異代謝物,在5個時期南京椴花中共篩選出差異代謝物620種。為了分析樣品組內和組間的變異度,對15個樣本進行PCA 分析(圖2)。

圖2 PCA 分析、PLS-DA 分析、OPLS-DA 分析和OPLS-DA 驗證模型圖中的數字(1-3)表示5個時期樣本的3個生物學重復。Fig.2 Analysis of PCA,PLS-DA,OPLS-DA and validation model of OPLS-DAThe numbers (1-3)i n the figure represent the three biological replicates of samples from five different periods.

5個樣品之間的總體化合物差異主成分分析結果顯示:第一和第二主成分分別占52.5%和17.5%的差異,化合物組分的差異對不同時期樣品的特征解釋率為70.0%(PC1+PC2),基本可以反映南京椴花的主要特征信息;樣品組內變異度均較小,說明實驗重復性好;不同期樣本呈分離趨勢,說明組間差異較大;與蕾期相比,開花后代謝物變化明顯,其中盛花期(D)和敗花期(E)明顯區別于其他期。

為了闡明南京椴花中代謝物在不同時期的變化規律,用(圖2)PLS-DA 和OPLS-DA 模型對5個不同樣本中化合物種類和豐度進行整合,以確定不同階段化合物的差異。在OPLS-DA 模型中,自變量擬合指數(R2X)、因變量擬合指數(R2Y)和模型預測指數(Q2)值分別為0.94、0.997和0.989,表明該模型的高精度和穩定性,以及解釋樣本變化的可靠性[30]。OPLS-DA 置換檢驗結果表明模型不存在擬合現象,可用于后續代謝物的篩選工作。蕾期到花期代謝物組間差異顯著,由此推測,盛花期是南京椴花代謝產物發生顯著變化的分界點。

2.3 黃酮類化合物聚類分析

目前,已經從不同的來源分離出5 000多種黃酮類化合物,并確定了它們的結構。椴屬中已被報道的黃酮類化合物約有80種。根據OPLS-DA 模型的變量重要性投影(variable importance in projection,VIP)鑒定差異代謝物[31],設置VIP值大于1,在5個時期花中共篩選得到244種差異代謝物,進一步得到26種黃酮類差異代謝物(圖3),包括4種黃酮,分別是田薊苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸、木犀草素和木犀草苷;10種黃酮醇,分別是阿福豆苷、山奈苷、槲皮苷、蘆丁、槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、鼠李秦素、番石榴苷、山奈酚、異槲皮素和槲皮素;5種二氫黃酮,分別是橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、圣草酚和圣草酚-O-己糖苷;1種二氫黃酮醇,是花旗松素;5種黃烷-3-醇,分別是表兒茶素、原花青素A2、原花青素三聚體Ⅰ、原花青素三聚體Ⅱ、原花青素三聚體Ⅲ;1種異黃酮,是奧洛波爾。

圖3 26種關鍵黃酮類化合物在5個時期內含量變化Fig.3 Variation of the content of 26 flavonoids within five stages

阿福豆苷含量在A 和C 期較低,在B、D 和E期升高。新橙皮苷、蘆丁和槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷含量在A 和D 期比其他期較低,在B、C和D 期含量均有所升高。原花青素 A2和山奈苷含量在C和D 期最高,A、B和E期含量降低?；ㄆ焖伤?、橙皮苷和槲皮苷呈現先降低后上升趨勢,在A期含量較高,B 和C 期稍有降低,D 和E 期含量又升高。芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸含量在D 期顯著區別于其他時期,含量最高。

原花青素三聚體Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3種黃烷-3-醇和柚皮苷在生長階段有著相同的變化趨勢,在A 期含量最低,隨后含量升高并保持穩定。

奧洛波爾和鼠李秦素含量在南京椴花的整個生長周期內無明顯變化,在D期略有降低;番石榴苷、山奈酚、木犀草素、木犀草苷、異槲皮素含量在B、C、D和E期略高于A期;槲皮素、圣草酚和圣草酚-O-己糖苷含量在C、D和E期稍高于前兩期;表兒茶素和田薊苷含量在B期降低,其他時期含量基本無明顯變化。

聚類熱圖結果(圖3)顯示,26種黃酮類化合物含量變化主要呈現以下5種趨勢:(1)隨著時間延長差異代謝物含量呈升高趨勢,且在盛花期(D)含量較高,包括槲皮素、異槲皮素、山奈酚、木犀草素、木犀草苷、原花青素三聚體,Ⅰ、原花青素三聚體Ⅱ、原花青素三聚體Ⅲ、柚皮苷、圣草酚和圣草酚-O-己糖苷。(2)隨時間延長含量先升高后降低,原花青素A2、山奈苷、番石榴苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸、蘆丁和槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷,前4 種化合物在D 期含量較高,后2種化合物在A 和D 期含量最低。(3)隨時間延長含量先降低后升高,表兒茶素、田薊苷、槲皮苷、橙皮苷、花旗松素和鼠里秦素,前5種化合物在A 和D 期含量相對較高,鼠里秦素在D 期略有降低。(4)隨時間延長含量先升高后降低再升高,阿福豆苷在D 期含量相對較高,新橙皮苷在D 期含量降低。(5)隨時間延長含量呈先降低后升高再降低,奧洛波爾在D 期含量有所降低。

2.4 黃酮類化合物顯著性分析

對不同時期南京椴花中黃酮類化合物進行單因素方差分析,表2顯示了26種黃酮類化合物在5個時期內相對平均含量。多重比較分析表明,這些化合物在不同時期花中含量差異顯著(P＜0.05),說明發育狀態是判斷南京椴花中次級代謝物含量的重要因素。

表2 不同時期花中黃酮類化合物相對含量平均值Table 2 Mean values of flavonoid relative content in inflorescences at different time periods

A 期橙皮苷和槲皮苷含量最高,分別為12.770,15.216;B期新橙皮苷、柚皮苷、原花青素三聚體、鼠里秦素和山奈酚含量最高,分別為15.746,0.567,1.756,0.195,1.180;C 期新橙皮苷、原花青素 A2、山奈苷、花旗松素、柚皮苷、原花青素三聚體、蘆丁、槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、奧洛波爾、山奈酚、木犀草素、木犀草苷、槲皮素、異槲皮素、圣草酚和圣草酚-O-己糖苷16種化合物含量最高,分別為15.639,18.352,14.863,7.017,0.485,2.332,1.151,3.787,2.153,1.645,1.661,1.534,1.774,2.202,2.438,2.086;D 期山奈苷、花旗松素、橙皮苷、槲皮苷、柚皮苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸、田薊苷、番石榴苷和圣草酚-O-己糖苷9種化合物含量最高,分別為15.492,10.244,15.195,13.617,1.213,15.598,1.683,2.905,1.921;E 期阿福豆苷、新橙皮苷、花旗松素、橙皮苷、原花青素三聚體、槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、表兒茶素、田薊苷、鼠里秦素和槲皮素含量最高,分別是16.351,16.367,10.530,15.719,1.924,0.630,3.063,1.796,0.341,1.710。

3 討論

黃酮類化合物是椴樹屬植物的主要次生代謝產物[32],目前,已經從椴樹屬植物中發現約80種黃酮類化合物。Pavlovic'等基于高分辨質譜儀(HRMS)在4種椴樹花序樣本中初步鑒定了46種代謝產物,包含14種酚酸及其衍生物、24種黃酮類化合物及其衍生物和8種原花青素[23]。Ziaja等在5種椴樹花序中檢測到42種酚類化合物,并用兒茶素、表兒茶素、蒙花苷和4種槲皮素衍生物對心葉椴(Tilia cordataMill.)、闊葉椴(TiliaplatyphyllosScop.)、Tilia×vulgarisHayne、銀毛椴(TiliatomentosaMoench.)、美洲椴(TiliaamericanaL.)5 個椴樹種進行了區分[3]。本研究基于UPLC-MS/MS在南京椴花中檢測到46種化合物,包括13種有機酸(9種酚酸及其衍生物);4種香豆素及其衍生物;1 種酯;28種類黃酮(4種黃酮,16種黃酮醇,5種黃烷-3-醇,3種二氫黃酮)。此外,通過比對標準品,在南京椴花中檢測到蘆丁的存在,可將其與銀毛椴花進行區分;并未檢測到兒茶素的存在,此前研究已證明美洲椴花中無兒茶素[3]。

Szücs等通過分析闊葉椴苞片整個發育期間的代謝組變化,發現苞片在早期發育階段含有大量的兒茶素衍生物和黃酮苷,在果實生長階段含有豐富的秦皮苷和奎寧酸衍生物[14]。練冬梅等研究發現,黃秋葵花黃酮從花蕾期至花謝期呈現出累積過程,花謝期黃酮含量達到最高[33]。邵郅勝等研究表明歐李葉片的各酚類物質含量隨著生長期推進均呈現先升高后降低的趨勢,均于果實膨大期達到最高[34]。本文著重研究南京椴花不同時期黃酮類化合物的含量變化。OPLS-DA 分析結果顯示,盛花期是南京椴花中代謝物發生顯著變化的分界點,現蕾期和開花期代謝物差異較大。顯著性分析可知,黃酮類化合物含量在不同時期花中差異顯著(P＜0.05)。在黃酮醇生物合成途徑上[35],山奈苷、阿福豆苷和槲皮苷這3種化合物顯著積累,在盛花期含量極高,Fawzy等通過角叉菜膠誘導的大鼠足腫脹法表明山奈酚及衍生物、槲皮素及衍生物有強烈的抗炎作用[8];相反,槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷和蘆丁2種槲皮素衍生物在盛花期含量極低。原花青素A2和原花青素三聚體等黃烷-3-醇類化合物含量在末蕾期最高,前者在盛花期含量也較高,Czerwinska等分離和鑒定了小葉椴花中的10種原花青素,都能減少N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(f-mlp)刺激的中性粒細胞產生的活性氧且大多數都能抑制脂多糖(LPS)誘導的IL-8釋放[36];表兒茶素在敗花期含量最高,Lee等研究發現表兒茶素對谷氨酸誘導的HT22細胞神經毒性具有明顯的保護作用[37]。橙皮苷和花旗松素含量在發育后期增加,橙皮苷已經被證明有降脂[38]和神經保護活性[39];花旗松素可用于治療胃癌[40]和脊髓損傷[41]。芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸含量在盛花期最高,Hu等研究表明該物質可抑制LPS 誘導的炎癥反應[42]。絕大多數黃酮類化合物含量在末蕾期或盛花期達到最高,末蕾期的標志性化合物是原花青素A2,盛花期的標志性化合物是芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸,末蕾期和盛花期均具有采收價值。

4 結論

該研究基于UPLC-MS/MS檢測和自建數據庫對南京椴花化學成分進行鑒定,初步分析得到46種化合物,包括13種有機酸(9種酚酸及其衍生物);4種香豆素及其衍生物;1種酯;28種類黃酮(4種黃酮,16種黃酮醇,5種黃烷-3-醇,3種二氫黃酮)。多元分析結果表明,蕾期到花期代謝物組間差異顯著,盛花期是南京椴花中代謝物發生顯著變化的分界點。多重比較分析表明,26種黃酮類化合物含量在5個時期花中差異顯著(P＜0.05),阿福豆苷、山奈苷、槲皮苷、橙皮苷、花旗松素和芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸含量在盛花期相對較高,槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷和蘆丁含量在始蕾期和盛花期極低,原花青素 A2和3種原花青素三聚體含量在末蕾期較高。因此,發育狀態可作為判斷南京椴花中次級代謝物含量的重要因素,后續可借助轉錄組學揭示有效成分的生物合成途徑,篩選南京椴花中藥理活性成分調控基因并驗證其功能。