HMGB1 中和抗體抑制細胞焦亡改善系統性紅斑狼瘡小鼠肺損傷的機制研究

李鳴遠 ,孟巖 ,武云

新疆醫科大學第一附屬醫院1全科醫學科,2風濕免疫科 烏魯木齊市,830054

系統性紅斑狼瘡 (systemic lupus erythematosus,SLE) 是一種累及多個臟器的自身免疫性疾病,其特征在于自身免疫系統過度激活,先天性和適應性免疫細胞功能異常,并產生大量針對核酸和核酸結合蛋白的自身抗體[1]。鑒于SLE 的高度復雜性和異質性,該疾病的發病機制仍不完全清楚,研究認為其涉及遺傳因素和環境因素兩大方面。肺部受累在SLE 中普遍存在,大約50 %～70 %的SLE 患者存在肺損傷,臨床表現為胸膜受累、急性肺炎、間質性肺疾病和彌漫性肺泡出血等[2-3],對人類健康造成了巨大威脅。

高遷移率族蛋白1 (high-mobility group box 1,HMGB1) 是高遷移率組蛋白家族的成員。在細胞核中,HMGB1 通過彎曲DNA 螺旋結構來穩定染色質結構并調節基因轉錄。HMGB1 還可以從受損細胞或活化的免疫細胞中釋放出來作為細胞外的損傷相關分子模式,通過與細胞表面受體如晚期糖基化終產物受體 (receptor of advanced glycation end products,RAGE) 結合參與下游促炎細胞因子的分泌,從而促進多種炎癥性疾病和自身免疫性疾病的發生和發展[4-5]。HMGB1 的促炎和免疫刺激功能表明其與自身免疫性疾病相關,此外,已在SLE 患者血清中檢測到HMGB1 水平顯著升高,并被確定為含DNA 的免疫復合物中增強促炎細胞因子產生的成分之一[6]。由此說明,HMGB1 可能作為SLE中一種新的炎癥相關因子,然而,其在SLE 發病肺損傷期間的確切作用及機制尚不清楚。本研究擬采用HMGB1 中和抗體作用MRL/lpr 小鼠以探究其對SLE 肺損傷的影響及其可能的作用機制,為今后治療SLE 合并肺損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康C57BL/6 小鼠和MRL/lpr 小鼠(該小鼠為研究狼瘡發病的代表性動物,能自發產生與人類疾病類似的狼瘡癥狀),均為雌性,6～8 周齡,體質量20～24 g。小鼠飼養于室溫22 ℃～24 ℃、相對濕度50 %～60 %、12 h/12 h 光暗交替的標準環境中,期間自由飲水、進食。適應飼養1 周后進行實驗,本動物實驗研究獲得我院動物倫理委員會批準審核。

1.2 主要試劑

HMGB1 中和抗體購于購于沈陽萬類生物科技有限公司,NLRP3 炎癥小體抑制劑MCC950 購于美國Selleck 公司,HE 染色液購于上海源葉生物科技有限公司,Masson 染色試劑盒購于上海翌圣生物科技股份有限公司,IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的ELISA 檢測試劑盒購于上海酶研生物科技有限公司,Triton X-100 購于北京伊塔生物科技有限公司,DAPI 核酸染料購于北京康瑞納生物科技有限公司,牛血清白蛋白購于北京百奧創新科技有限公司,蛋白裂解液和BCA 蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物研究所,PVDF 膜購于美國Millipore 公司,兔抗HMGB1、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、GAPDH 一抗、Alexa Fluor 488 偶聯的二抗以及辣根過氧化物酶偶聯的二抗均購于英國Abcam 公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組與處理 將30 只MRL/lpr 小鼠隨機分為MRL/lpr 組、MRL/lpr+anti-HMGB1 組、MRL/lpr+MCC950 組,每組10 只,另取10 只野生型C57BL/6 小鼠作為對照組。MRL/lpr+anti-HMGB1 組參考文獻[7] 給藥方式和劑量,通過小鼠尾靜脈注射HMGB1 中和抗體(1 mg/kg),每周注射2 次,2 次注射間隔3 d,持續4 周;MRL/lpr+MCC950 組參考文獻[8] 給藥方式和劑量,通過小鼠灌胃NLRP3 炎性小體抑制劑MCC950(10 mg/kg),每日1 次,持續4 周。對照組和MRL/lpr 組同時注射相應體積的生理鹽水。

1.3.2 HE 染色觀察肺組織病理學變化 給藥結束后,處死小鼠解剖取肺組織,用4 %多聚甲醛固定過夜,乙醇脫水,石蠟包埋并制備切片。切片通過常規二甲苯透明,乙醇脫蠟水化,進行HE 染色,結束后用中性樹膠封固切片,晾干,于光鏡下進行組織病理學變化觀察并收集圖像。

1.3.3 Masson 染色檢測肺組織膠原纖維沉積 小鼠肺組織切片進行常規脫蠟水化,Weigert 氏鐵蘇木素染色5 min,流水沖洗,通過麗春紅酸性品紅浸泡,磷鉬酸水處理5 min,苯胺藍染色3 min,1 %冰醋酸浸洗后,脫水、透明,中性樹膠封固切片,晾干,于光鏡下觀察組織染色情況并收集圖像,藍染代表膠原纖維沉積,用Image J 軟件分析膠原纖維沉積。

1.3.4 ELISA 法檢測肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、IL-18 及TNF-α 含量 小鼠開胸后充分暴露支氣管,注射器抽取0.5 mL 預冷的無菌生理鹽水灌洗小鼠左肺,輕柔按摩胸腔后,緩慢回吸灌洗液,再次注入左肺按摩、回吸,重復該操作3 次,收集灌洗液,于4 ℃、4 000 r/min 離心5 min,取上清液并保存于-20 ℃備用。參照試劑盒說明書,采用ELISA 法檢測小鼠肺泡灌洗液中炎性因子IL-1β、IL-6、IL-18 及TNF-α 含量。

1.3.5 免疫熒光染色檢測肺組織內NLRP3 熒光表達 將小鼠肺組織制備冰凍切片,復溫后浸入冰丙酮中固定,0.1 %Triton X-100 透化15 min,5 %牛血清白孵育30 min,滴加兔抗NLRP3 一抗(1∶200) 覆蓋切片,4 ℃孵育過夜。洗滌后滴加對應Alexa Fluor 488 二抗(1 ∶500),室溫孵育1 h,并采用DAPI 染核,抗熒光淬滅封片劑封固,洗滌、晾干后,在熒光顯微鏡激發光下觀察小鼠肺組織NLRP3 表達并收集圖像,用Image J 軟件分析平均熒光強度。

1.3.6 蛋白質印跡測定肺組織中HMGB1 及焦亡相關蛋白表達 將小鼠肺組織剪碎制備勻漿液,加入預冷的裂解液提取總蛋白,使用BCA 法測定組織蛋白濃度,蛋白經高溫煮沸變性后,取等量樣品行10 % SDS-PAGE 電泳分離并轉印至PVDF 膜。5 %脫脂奶粉室溫封閉膜2 h,分別與兔抗HMGB1、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD 一抗(1∶1 000)置于4 ℃孵育過夜。膜經TBST 漂洗后,再與對應辣根過氧化物酶偶聯的二抗(1∶5 000) 室溫孵育1 h,TBST 漂洗,增強化學發光法ECL 顯影后,放入成像系統中采集圖片信息,用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值,GAPDH 作為內參,以目的蛋白與GAPDH 的灰度值比值來表示目的蛋白相對表達量。

1.4 統計學分析

本研究應用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進行統計學分析,數據以均數±標準差() 表示。多組間數據分析采用單因素方差分析法,兩兩數據比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織病理學變化比較

HE 染色觀察各組小鼠肺組織病理學變化情況,結果如圖1 所示。對照組小鼠肺組織結構和形態正常;MRL/lpr 組小鼠肺組織呈現嚴重病理損傷癥狀,內有炎癥細胞浸潤,動脈管腔嚴重變形,肺間質水腫,肺泡出現塌陷、破裂;與MRL/lpr 組比較,MRL/lpr+anti-HMGB1 組和MRL/lpr +MCC950 組小鼠肺組織炎性細胞浸潤、動脈腔變形、肺間質水腫及肺泡變形塌陷等現象均得到明顯改善。

圖1 各組小鼠肺組織病理學變化比較(HE 染色,×100)

圖2 各組小鼠肺組織膠原纖維沉積情況比較(Masson 染色,×100)

2.2 各組小鼠肺泡灌洗液中炎性因子含量比較

ELISA 測定結果顯示,與對照組比較,MRL/lpr 組小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、IL-18 及TNF-α 含量顯著升高(P＜0.05);與MRL/lpr 組比較,MRL/lpr+anti-HMGB1 組和 MRL/lpr +MCC950 組小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、IL-18及TNF-α 含量顯著降低(P＜0.05) (圖3)。

圖3 各組小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、IL-18 及TNF-α 含量比較

Masson 染色觀察各組小鼠肺組織內膠原纖維沉積現象,結果如圖2 所示。對照組小鼠肺組織內未見明顯的藍染膠原纖維沉積;與對照組比較,MRL/lpr 組小鼠肺組織內有大量藍染區域,膠原纖維沉積面積顯著增加(P＜0.05);與MRL/lpr 組比較,MRL/lpr+anti-HMGB1 組和 MRL/lpr +MCC950 組小鼠肺組織內藍染的膠原纖維沉積面積顯著減少(P＜0.05)。

2.3 各組小鼠肺組織內NLRP3 熒光表達情況比較

通過免疫熒光染色觀察各組小鼠肺組織內NLRP3 熒光表達,與對照組相比較,MRL/lpr 組小鼠肺組織內NLRP3 平均熒光強度顯著性增加(P＜0.05)。

與MRL/lpr 組相比較,MRL/lpr +anti-HMGB1組和MRL/lpr+MCC950 組小鼠肺組織內NLRP3 平均熒光強度顯著性減小(P＜0.05) (圖4)。

圖4 各組小鼠肺組織NLRP3 表達比較(免疫熒光染色,×100)

2.4 各組小鼠肺組織中HMGB1 及焦亡相關蛋白表達比較

蛋白質印跡檢測結果顯示,MRL/lpr 組小鼠肺組織中HMGB1 蛋白相對表達量及NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD 蛋白相對表達量均顯著高于對照組(P＜0.05)。

與MRL/lpr 組相比較,MRL/lpr +anti-HMGB1組和MRL/lpr+MCC950 組小鼠肺組織中HMGB1蛋白的相對表達量及NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD 蛋白的相對表達量顯著性下調(P＜0.05)(圖5)。

圖5 各組小鼠肺組織HMGB1 及焦亡相關蛋白表達比較

3 結論

SLE 常引起腎臟、心臟、肺、關節等多個器官的慢性炎癥,肺部病變是SLE 嚴重的表現之一,屬于一種致命性并發癥,及時發現、及時治療肺損傷是拯救SLE 患者生命的重要措施。越來越多的證據表明,TNF-α 和IL-6 等促炎細胞因子的產生與失調可能在SLE 的免疫功能障礙中起關鍵作用,并介導肺組織炎癥及損傷。TNF-α 水平顯著升高與SLE 疾病活動度相關,降低TNF-α 水平可降低臨床患者的疾病活動度[9]。此外,IL-6 在SLE 患者血清中升高,且能促進SLE 患者和小鼠自身抗體的產生[10]。因此,了解涉及炎癥反應的詳細機制將有助于探究針對SLE 的有效療法。本研究檢測結果顯示,MRL/lpr 小鼠肺組織內有大量炎癥細胞浸潤,肺間質水腫以及肺泡塌陷、破裂,膠原纖維沉積面積增加,肺泡灌洗液中IL-6 和TNF-α 含量也升高,以上結果表明,MRL/lpr 小鼠表現為明顯的肺部炎癥反應及組織纖維化,說明SLE 引起了肺損傷。

HMGB1 作為促炎介質有助于多種慢性炎癥和自身免疫性疾病的發病機制,包括SLE。細胞凋亡清除缺陷是SLE 發病機制的一個重要方面,當凋亡細胞不能有效清除時,會引發繼發性壞死,釋放細胞內容物,在此過程中SLE 患者受累組織中單核巨噬細胞、中性粒細胞、漿細胞樣樹突狀細胞等細胞異?；罨⑨尫臜MGB1,釋放到胞外的HMGB1 以RAGE 依賴性方式介導炎癥反應,從而促進SLE 進展[11-12]。此外,HMGB1 與多種肺部疾病的發生也密切相關。例如,HMGB1 通過激活巨噬細胞中的黑色素瘤缺乏因子2 (absent in melanoma 2,AIM2) 炎癥小體以及通過Toll 樣受體1(toll-like receptor 1,TLR1)、TLR2 和RAGE/核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB) 信號通路誘導M1 型巨噬細胞極化來參與脂多糖誘導的急性肺損傷過程[13];HMGB1 介導的RAGE 激活不僅誘導肺組織損傷,而且還阻礙肺泡上皮細胞損傷后的修復反應,降低了肺組織再生能力[14];HMGB1 通過促進中性粒細胞浸潤、促炎細胞因子及趨化因子的表達來增加細胞凋亡,促進肺缺血再灌注損傷[15]。由此可見,HMGB1 可能是肺部相關疾病的獨立生物標志物和治療靶點,使用HMGB1 抗體、抑制劑、炎癥抑制劑以及對HMGB 進行靶向干預將成為肺部疾病的新型治療方法。本研究使用HMGB1中和抗體作用MRL/lpr 小鼠后,經檢測發現小鼠肺組織炎癥細胞浸潤、肺間質水腫、肺泡變形塌陷以及膠原纖維沉積均得到明顯改善,肺泡灌洗液中IL-6 和TNF-α 含量也降低,這說明HMGB1 中和抗體能夠減輕SLE 小鼠肺部炎癥反應及組織纖維化,改善SLE 肺損傷。

程序性細胞死亡在體內平衡中起重要作用,細胞凋亡與焦亡是程序性細胞死亡的兩種不同方式。細胞凋亡是非炎癥性程序性細胞死亡的一種形式,涉及細胞器、細胞膜和細胞核變化的過程,經常發生在單個細胞中,以避免炎癥的發生。而焦亡是由各種危險信號誘導的程序性細胞死亡的溶解性和炎癥性形式,其特征是細胞膜上的孔形成、細胞腫脹以及細胞裂解后細胞內容物和促炎細胞因子的釋放,這種過度活躍的炎癥程序性細胞死亡會破壞免疫系統穩態并促進自身免疫反應[16]。IL-1β 和IL-18 是焦亡細胞釋放的兩種重要炎癥細胞因子,可引發鄰近細胞的繼發性炎癥反應[17-18]。除了釋放炎癥細胞因子外,焦亡細胞還能釋放HMGB1 并作為一種損傷相關分子模式誘導促炎細胞因子的產生,促進樹突狀細胞的成熟和遷移以及B 細胞的活化,還可以觸發巨噬細胞的焦亡[19]。NLRP3 炎癥小體是介導焦亡的炎癥小體傳感器之一,現已發現其在SLE 患者中過度激活[20]。NLRP3 炎癥小體通過與ASC 結合后激活Caspase-1 并切割GSDMD產生GSDMD N 結構域,從而誘導細胞焦亡[21]。本研究檢測結果顯示,經過HMGB1 中和抗體作用的MRL/lpr 小鼠肺泡灌洗液中IL-1β 和IL-18 含量降低,肺組織NLRP3、ASC、Caspase-1 及GSDMD 蛋白表達水平也下調,由此推斷,HMGB1 中和抗體減輕SLE 肺損傷的作用可能與其抑制細胞焦亡有關?；诖?本研究應用NLRP3 炎癥小體抑制劑MCC950 作用MRL/lpr 小鼠后,其作用效果與HMGB1 中和抗體一致,且MCC950 明顯抑制了MRL/lpr 小鼠肺組織內HMGB1 表達的升高,該結果進一步表明,HMGB1 中和抗體通過抑制NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡途徑來減輕SLE 肺損傷。

綜上所述,HMGB1 參與SLE 中肺損傷發病機制,采用HMGB1 中和抗體能夠改善SLE 小鼠肺部炎癥細胞浸潤與組織纖維化,減少促炎因子的產生,對肺組織起到保護作用,并發現該作用與其抑制NLRP3 炎癥小體介導的細胞焦亡途徑有關。本研究為SLE 誘導肺損傷的治療提供了新靶點和新方向。然而,是否還有其他通路參與HMGB1 中和抗體改善SLE 肺損傷尚不明確,后續將針對此問題開展相關研究,以充分闡明HMGB1 調節SLE 肺損傷的具體機制。