科羅索酸抑制人卵巢癌細胞SKOV-3 過度增殖和誘導細胞凋亡

孫喆 ,王鈞峰 ,李會影 ,姚慧欣

牡丹江醫學院附屬紅旗醫院1婦產科,2骨科,3醫務科 黑龍江省牡丹江市,157011

卵巢癌是最為致命的婦科癌癥之一,確診后不到一半的患者可以在5 年內存活下來。由于早期癥狀難以覺察,大部分患者診斷出卵巢癌時已經進入晚期,癌細胞轉移到其他組織中,通常腹腔轉移最為多見[1-2]。當前卵巢癌的治療主要是通過手術切除腫瘤和鉑/紫杉醇聯合化療,雖然80 %的患者能取得良好效果,然而癌癥的復發率依然很高,70 %的患者在5 年內復發并產生了抗藥性[3]。因此,尋找新的治療手段和藥物,改善目前的治療效果是必要的。

在過去的數十年中,來源于藥用植物的天然提取物由于其安全性和良好的功效而受到臨床研究者的青睞,尤其在癌癥的治療當中,至少40 %的抗癌藥物來源于天然產物[4]?？屏_索酸 (corosolic acid,CRA) 是一種五環三萜類天然提取物,可從大花紫薇、枇杷、山楂等植物中提取獲得,研究表明CRA 具有抗癌的能力,然而其分子機制十分復雜,至今仍有很多尚待闡明的地方[5]。本研究通過培養人卵巢癌SKOV-3 細胞,用CRA 處理細胞,旨在探究了CRA 對卵巢癌細胞SKOV-3 的抑制增殖和誘導凋亡的作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

CRA 購自Sigma 公司,RPMI-1640 培養基、胎牛血清購自美國Invitrogen 公司,青霉素、鏈霉素、CCK-8 試劑盒、Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒、RIPA 裂解液、BCA 試劑盒、免疫組化試劑盒、Ecl顯色液購自北京索萊寶生物公司,GAPDH、抗原Ki67 (Ki67)、周期蛋白D1 (cyclin D1)、周期蛋白依賴性激酶 (cyclin-dependent kinases 6,CDK6)、B 細胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2 相關X 蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、活化型半胱天冬酶3 (cleaved caspase-3)、cleaved caspase-9、磷脂酰肌醇3-激酶 (phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B (protein kinase B,AKT)、p-AKT、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) 抗體購自英國Abcam 公司。

1.2 細胞培養及分組處理

人卵巢癌細胞SKOV-3 購自美國ATCC 公司,培養于含有10 % 胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS)、100 單位青-鏈霉素的RPMI-1640 培養基中,培養箱條件為5 % CO237 ℃。將細胞分為空白對照(Ctrl)、CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 組,除Ctrl 組外,每組分別定容至對應濃度的CRA 進行處理。

1.3 CCK-8 檢測細胞增殖

將處理后的細胞繼續在5 % CO2,37 ℃環境條件下培養,每隔1 天使用CCK-8 法測定細胞增殖倍數,持續4 d。測定時將細胞接種于96 孔板,5 % CO2,37 ℃環境下預培養24 h,在培養板里加入10 μL/孔的CCK-8 溶液繼續培養4 h,使用酶標儀檢測450 nm 吸光度。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

用不含EDTA 的胰蛋白酶將細胞消化成單細胞,并用冰的PBS 洗滌2 次。根據制造商的說明,使用細胞凋亡檢測試劑盒進行Annexin V 染色。在4 ℃暗室中孵育15 min 后,加入PI 染色液,輕輕混合,4 ℃孵育5 min,用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.5 蛋白質印跡檢測蛋白表達

收集細胞并裂解在RIPA 裂解液中,使用BCA蛋白測定試劑盒測量各組細胞蛋白濃度。根據測定濃度,每組40 μg 的蛋白質樣品在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進行,并轉移到硝化纖維膜上。將膜在4 ℃的5 %脫脂乳中孵育8 h,并與一抗反應過夜。隨后,將它們暴露于過氧化物酶偶聯的二抗1 h。最后,使用增強化學發光檢測試劑盒進行條帶檢測。

1.6 裸鼠皮下移植瘤模型建立

40 只鼠齡6～8 周,體重18～20 g 的SPF 雌性BALB/c 裸鼠購自牡丹江醫學院,許可證號:SYXK (黑) 2019-006,在指定的動物房中飼養48 h,所接觸的器具、水和食物均需無菌。本實驗獲牡丹江醫學院附屬紅旗醫院倫理審查委員會批準。將SKOV-3 細胞株以濃度1 ×106個/只經左腋皮下接種于裸鼠中。每隔1 天記錄一次腫瘤體積,當腫瘤體積約為100 mm3時,將裸鼠分為Ctrl 組、CRA(10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 組,每 組10 只,CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 組灌胃相應濃度的CRA,Ctrl 組灌胃生理鹽水。所有裸鼠每天給藥1 次,每隔7 天記錄一次腫瘤體積,連續給藥35 d 后處死裸鼠,取出腫瘤組織用于后續實驗。

1.7 免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC) 檢測組織Ki67、VEGF 陽性細胞率

移植瘤樣品在4 %甲醛中固定過夜,并用梯度濃度的乙醇脫水。將組織切成5 μm 厚的切片,然后將切片干燥、脫蠟,并用檸檬酸鹽修復抗原15 min。切片用1 % BSA 封閉30 min,然后分別與Ki67,VEGF 一抗和用HRP 標記的二抗孵育。切片與DAB 顯色液反應,并用蘇木精復染,在光學顯微鏡下拍照獲取圖片進行后續分析。

1.8 統計學分析

本研究數據表示為平均值±標準差。所有的統計分析使用GraphPad Prism 5.0。采用單因素方差分析和t檢驗進行分析數據,以確定所有實驗組之間的差異。

2 結果

2.1 CRA 抑制SKOV-3 細胞增殖

與Ctrl 組比較,CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 組SKOV-3 細胞增殖水平顯著降低(P＜0.01),呈時間和濃度依賴性變化(圖1)。與Ctrl 組比較,CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 組Ki67、Cyclin D1、CDK6 蛋白表達水平顯著降低 (P＜0.01),且呈濃度依賴性變化(圖2)。

圖1 CRA 對SKOV-3 細胞增殖的影響(n=6)

圖2 CRA 對細胞增殖標志蛋白表達的影響(n=6)

2.2 CRA 促進SKOV-3 細胞凋亡

與Ctrl 組比較,CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 組SKOV-3 細胞凋亡率顯著升高(P＜0.01),呈濃度依賴性變化(圖3)。

圖3 CRA 對SKOV-3 細胞凋亡的影響(n=6)

與Ctrl 組比較,CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 組Bcl-2/Bax 比率顯著降低,cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9 蛋白表達水平顯著升高(P＜0.01),且呈濃度依賴性變化(圖4)。

圖4 CRA 對凋亡相關蛋白表達的影響(n=6)

圖5 CRA 對PI3K/AKT 信號通路的調控作用(n=6)

2.3 CRA 對PI3K/AKT 信號通路的抑制作用

與Ctrl 組比較,CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 組PI3K/AKT 信號通路關鍵蛋白PI3K 表達水平和p-AKT/AKT 比率顯著降低(P＜0.01),且呈濃度依賴性變化(圖 5)。

2.4 CRA 抑制皮下移植瘤組織生長

與Ctrl 組比較,CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 組腫瘤體積顯著受到抑制 (P＜0.01),呈時間和劑量依賴性變化(圖6);同時,與Ctrl 組比較,CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 組Ki67、VEGF 陽性細胞率顯著降低(P＜0.01),且呈劑量依賴性變化(圖7)。

圖6 CRA 對皮下移植瘤組織生長的影響(n=6)

圖7 CRA 對Ki67 和VEGF 表達的影響(n=6,×200)

3 討論

CRA 具有非常廣泛的藥用價值,在抗高血糖、抗高血脂、抗氧化和消炎上均發揮著作用[6]。在抗癌方面,CRA 在諸如胃癌、肝癌和前列腺癌等癌癥中均具有顯著的抗癌作用,并有著不一樣的作用機制[7-9]。在Fujiwara 等[10]的研究中,通過細胞增殖和毒理檢測,確立CRA 在30 μmol/L 左右時可顯著抑制卵巢癌細胞的增殖。本研究發現CRA可顯著抑制SKOV-3 細胞的增殖,并且呈濃度依賴性變化關系。與之前研究不同,本研究中10 μmol/L 的CRA 就表現出顯著的增殖抑制作用,這種差異可能與細胞生長環境以及檢測方法不同有關。同時,本研究對增殖相關蛋白Ki67、Cyclin D1、CDK6 表達水平進行了檢測,發現CRA 可抑制Ki67、Cyclin D1 和CDK6 的表達。Ki67 是一種與細胞增殖緊密相關的核蛋白,近年來被認為是一種與化療敏感性和腫瘤復發相關的重要診斷因子[11]。Cyclin D1 是一種調控細胞周期的原癌基因,其過度表達會縮短G1/S 轉換時間,在多種癌癥中均發現了Cyclin D1 的過度表達,致細胞增殖失控而惡性化[12]。CDK6 是一個關鍵細胞周期促進因子,參與到多種腫瘤細胞的增殖過程中[13]。本研究通過構建皮下移植瘤模型,發現CRA 可顯著抑制裸鼠體內的卵巢癌腫瘤組織生長,并降低腫瘤組織中Ki67 和VEGF 的表達,VEGF 在腫瘤中誘導血管增生[14]。這些結果表明CRA 可顯著抑制SKOV-3 細胞及組織的過度增殖。

為了進一步探究CRA 對SKOV-3 細胞的生長調控作用,本研究對其細胞凋亡水平進行了檢測,結果表明CRA 可顯著增加SKOV-3 細胞凋亡率。同時,CRA 可降低Bcl-2/Bax 比率,提高cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9 蛋白表達水平,抗凋亡基因Bcl-2 和促凋亡基因Bax是一對重要的正負調控因子,Bcl-2 可阻止Bax 形成同源二聚體促進凋亡發生[15]。cleaved caspase-9 參與了內源性凋亡途徑的起始,cleaved caspase-3 是細胞凋亡的主要效應因子[16]。結合實驗結果表明CRA 可誘導SKOV-3 細胞凋亡。

PI3K/AKT 信號通路在細胞生存、細胞周期、細胞增殖等方面均發揮著重要的作用,其異常激活常與包括卵巢癌在內的各種癌癥有關[17]。PI3K 可將PIP2 磷酸化為PIP3,并在膜上積累,從而激活下游的AKT 蛋白[18],激活的AKT 可磷酸化下游多種靶蛋白,從而促進腫瘤的發生、增殖與生存[19]。本研究發現CRA 可抑制PI3K 的蛋白表達,并降低p-AKT/AKT 的比率,表明CRP 可通過抑制PI3K/AKT 信號通路抑制SKOV-3 細胞的增殖并誘導其凋亡。

綜上所述,CRA 可抑制卵巢癌細胞增殖相,并降低Bcl-2/Bax 比率,促進cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9 表達,從而誘導細胞凋亡,其機制可能與PI3K/AKT 信號通路失活有關。同時,CRA 可在體內抑制裸鼠體內移植瘤的生長,這為卵巢癌的臨床治療提供了新的藥物候選。下一步計劃對CRA 在卵巢癌其他方面的作用作進一步探究。