生物炭對黑脛病抗性不同烤煙品種根際土壤真菌群落結構的影響

任志超，李 想，李先鋒，毋麗麗，王 景，彭志良，劉國順，殷全玉

（1.河南農業大學煙草學院，河南 鄭州 450002；2.陜西省煙草公司漢中市公司，陜西 漢中 723000；3.陜西省煙草公司商洛市公司，陜西 商洛 726000）

土壤是影響甚至決定植物生長發育狀況的重要因素之一[1]。大量微生物存在于土壤之中，其在土壤中的分布特征和組成多樣性反映土壤質量的好壞，對土壤肥力的演變、有效養分的持續供給以及各種土傳病害的防治起著舉足輕重的作用[2-6]。生物炭是指由各種固體農林廢棄物在厭氧條件下熱解產生的富碳有機產物[7-10]，已被證明是農業生產中一種很有前景的土壤改良劑，具有抑制病原菌繁殖、改善土壤理化性質、促進作物生長及調節土壤微生態環境等功能[11-13]。TIAN 等[14]進行西洋參盆栽試驗，發現土壤滅菌后施加生物炭可調節西洋參酚酸的化感作用，與蚯蚓糞聯合施用可有效防治鐮刀菌根腐病。DE MEDEIROS等[15]研究表明，施加生物炭可有效降低番茄青枯病的發病率。ROSE 等[16]在種植甘蔗的土壤中添加生物炭，發現土壤pH 值和水分含量隨生物炭含量的增加而增加，同時抑制了甘蔗紅腐病病原菌數目的增長。同種作物不同品種對施加生物炭的響應有所不同。丁瑋等[17]在田間水稻移栽前施加生物炭，發現水稻品種玉針香和黃華占的土壤微生物群落結構受生物炭影響較大，而五常香稻等其他水稻品種受生物炭影響較小。FORNES 等[18]發現，施用高劑量生物炭對番茄品種Cuarenteno 地上部分無影響，而對番茄品種Gransol RZ的地上部和根部有較大的負面影響。

由疫霉菌引起的煙草黑脛病是全球范圍內的一種破壞性土傳病害[19-20]。煙草黑脛病分布廣泛且可在任何階段侵染煙草，給煙草產業帶來了嚴重的經濟損失[21-22]。疫霉菌可與土壤中其他微生物互作從而影響煙草的根際微生態環境，這將嚴重制約煙草行業的可持續發展[23-24]。目前，生物炭的應用在玉米、黃瓜、辣椒及番茄等作物病害防治上已有報道[25-28]，但生物炭對黑脛病抗性不同烤煙品種根際土壤真菌群落結構的影響卻鮮有報道。鑒于植煙土壤的真菌數量及多樣性與烤煙黑脛病關系密切，通過高通量測序的方法對施加生物炭及未加生物炭條件下黑脛病抗性不同烤煙品種土壤真菌群落結構進行分析，探究生物炭對黑脛病抗性不同烤煙品種植煙土壤真菌多樣性的影響，以期為利用生物炭調控煙草微環境及烤煙黑脛病的綜合防治提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗于2020 年5—9 月在河南農業大學許昌校區現代煙草科教園區（34°18'N、113°48'E）玻璃溫室內進行。

供試土壤：取自科教園區休耕煙田0～30 cm 耕層土，褐土，基礎理化性質為pH值7.57，有機質含量11.5 g∕kg，速效氮含量81.59 mg∕kg，速效磷含量10.09 mg∕kg，速效鉀含量134.57 mg∕kg。土樣經風干后過1 mm孔徑篩備用。

供試生物炭：花生殼生物炭，在450 ℃密閉缺氧條件下連續炭化制成，基礎理化性狀為pH 值8.33，總C 414.72 g∕kg，總N 14.36 g∕kg，C∕N 28.88，比表面積22.97 m2∕g，由河南惠農土質保育研發有限公司提供。

供試烤煙品種：中抗黑脛病品種K326（K），高抗黑脛病品種NC82（N）和高感黑脛病品種凈葉黃（J），由河南農業大學煙草育種實驗室提供。

1.2 試驗設計

采用盆栽試驗，每個品種分別設施炭和不施炭2個處理，同時均設置不種植煙株的空白對照，共計8 個處理（表1），每個處理重復5 次，每4 盆為1 次重復，一共160盆。盆規格為外徑33 cm、高31.5 cm、底徑22.5 cm，每盆裝土15 kg，每盆施氮（N）2.5 g，氮（N）∶磷（P2O5）∶鉀（K2O）為1∶1.5∶3。供試氮肥NH4NO3，磷肥和鉀肥為KH2PO3和K2SO4，均為分析純試劑。生物炭用量為100 g∕盆，移栽前將生物炭、肥料與土壤均勻混合裝入盆中，置于玻璃溫室內，室內溫度25 ℃。于2020 年5 月5 日移栽，移栽后澆足定根水，使煙苗及時復蘇。之后每周定時澆水，以防止土壤板結。移栽后35 d 接種煙草黑脛病病原菌，用注射器針頭在煙株莖基部劃2個傷口，然后采用灌根法接種10 mL 1×106cfu∕mL 煙草疫霉孢子液。移栽后40 d 調查煙株發病情況，并取煙株根際土，提取土壤總DNA，檢測真菌群落結構。

表1 試驗處理設置Tab.1 Test treatment settings

1.3 樣品采集和測定方法

1.3.1 煙草黑脛病發生調查方法 根據GB∕T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調查方法》標準（表2），在移栽后40 d 分別調查各處理全部煙株黑脛病的發病情況，并計算發病率和病情指數。

表2 煙草黑脛病分級標準Tab.2 Classification standard of tobacco black shank disease

發病率=[病葉（株）數∕調查總數（株數）]×100%；

病情指數=∑（病級數×該級病株數）∕（最高病級數×調查總株數）×100；

防治效果=（對照組病情指數-處理組病情指數）∕對照組病情指數×100%。

1.3.2 煙株根際土取樣方法 煙苗移栽后40 d，拔出整株煙根，抖去根圍土，用無菌刷子小心地把緊貼煙根的土壤刷下來，搜集到無菌的塑料離心管內，于-80 ℃保存，一周內完成土壤總DNA抽提。

1.3.3 土壤DNA 提取和PCR 擴增方法 根據E.Z.N.A.? soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進行微生物群落總DNA抽提，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取質量，使用NanoDrop 2000 測定DNA 濃度和純度；采用ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對ITS基因ITS1 可變區進行PCR 擴增，擴增程序如下：95 ℃預變性3 min，27 個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃穩定延伸10 min。PCR 反應體系：5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol∕L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol∕L）0.8μL，下游引物（5 μmol∕L）0.8 μL，DNA 聚合酶0.4μL，模板DNA 10 ng，補足至20 μL。每個樣本3個重復。

1.3.4 Illumina Miseq 測序 將同一樣本的PCR 產物混合后，使用2%瓊脂糖凝膠檢測，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進行PCR 產物回收純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Quantus ? Fluorometer（Promega，USA）對回收產物進行檢測定量。使用NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit 進行建庫：（1）接頭連接；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用PCR 擴增進行文庫模板的富集；（4）磁珠回收PCR 產物得到最終的文庫。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進行測序（上海美吉生物醫藥科技有限公司）。將原始數據上傳至NCBI SRA（Sequence read archive，http:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕Traces∕sra）數據庫。

1.4 數據處理

使用Trimmomatic 軟件對原始測序序列進行質控，使用FLASH軟件進行拼接：

（1）過濾reads 尾部質量值20 以下的堿基，設置50 bp 的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp 以下的reads，去除含N堿基的reads。

（2）根據PE reads 之間的overlap 關系，將成對reads 拼接（merge）成一條序列，最小overlap 長度為10 bp。

（3）拼接序列的overlap 區允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列。

（4）根據序列首尾兩端的barcode和引物區分樣品，并調整序列方向，barcode 允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2。

使用的UPARSE 軟件（version 7.1，http:∕∕drive5.com∕uparse∕），根據97%的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier（2.13）（http:∕∕rdp.cme.msu.edu∕）對每條序列進行物種分類注釋，比對UNITE 8 數據庫（SSU128），設置比對閾值為70%。

2 結果與分析

2.1 施用生物炭對抗性不同烤煙品種黑脛病發生的影響

由表3可見，未施生物炭條件下，煙草黑脛病發病率和病情指數在烤煙品種間差異達到顯著水平，表現為凈葉黃＞K326＞NC82；施用生物炭明顯降低了高感品種凈葉黃、中抗品種K326 和高抗品種NC82的黑脛病發病率和病情指數，對3個品種黑脛病的防治效果分別為56.52%、31.00%和27.00%。

表3 不同烤煙品種黑脛病發生情況Tab.3 Occurrence of black shank disease in different flue-cured tobacco varieties

2.2 施用生物炭對黑脛病抗性不同烤煙品種土壤真菌Alpha多樣性的影響

研究環境中微生物的多樣性，可以通過單樣本的多樣性（Alpha 多樣性）分析反映微生物群落的豐富度和多樣性，包括一系列統計學分析指數估計環境群落的物種豐度和多樣性。各處理土壤真菌多樣性指數差異結果如圖1 所示。Coverage 指數用來描述樣本菌落的覆蓋率，即本次測序是否代表真實狀況；Chao1 指數反映真菌群落結構的豐度，Chao1指數值越大，說明物種總數越多；Shannon 指數和Simpson 指數反映真菌群落結構的均勻性，Shannon指數和Simpson 指數值越大，說明群落多樣性越高。由圖1 知，各個樣本的Coverage 指數都接近100%，表明此次測序反映了真菌群落結構的真實性。不施生物炭條件下，各烤煙品種根際土壤真菌Chao1 指數之間無顯著差異，施用生物炭影響了Chao1 指數的大小，使K326 的Chao1 指數顯著高于CK；不施生物炭條件下，各品種的Shannon指數整體低于CK，K326與CK存在顯著差異，施用生物炭后各處理的Shannon 指數無顯著差異；不施生物炭條件下，K326的Simpson指數顯著低于其他品種，施用生物炭后各烤煙品種的Simpson指數無顯著差異。

圖1 基于ITS基因的土壤樣本真菌多樣性指數Fig.1 Fungal diversity index of soil samples based on ITS gene

2.3 施用生物炭對黑脛病抗性不同烤煙品種土壤真菌群落組成的影響

2.3.1 門水平上優勢物種相對豐度 由圖2 可見，CK 及各品種根際土壤中的優勢菌門有子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），平均豐度之和在90%以上。與未施用生物炭相比，施用生物炭后，除NC82 的子囊菌門相對豐度增加7.18%外，CK、K326、凈葉黃的相對豐度分別減少了5.39%、12.46%、4.12%；NC82的被孢霉門相對豐度減少了1.75%，而CK、K326、凈葉黃分別增加了5.01%、9.50%、3.05%；CK、NC82、凈葉黃的擔子菌門相對豐度分別降低2.14%、3.77%和1.46%，而K326 升高2.18%（圖2）。無論是未植煙土壤還是不同烤煙品種的植煙土壤，施用生物炭沒有改變優勢菌群的種類，但優勢菌群的豐度占比受到一定影響。

圖2 不同烤煙品種根際土壤真菌相對豐度（門水平）Fig.2 Relative abundance of fungi（phylum level）in rhizosphere soil of different tobacco varieties

2.3.2 屬水平上優勢物種相對豐度 各處理真菌屬水平上的相對豐度如圖3 所示，總共檢測到14 個屬，其相對豐度在黑脛病不同抗性烤煙品種間存在明顯差異。與不施生物炭相比，施用生物炭后14個屬的總豐度在不植煙土壤和3種烤煙品種土壤中均表現為升高。與不施生物炭相比，高抗品種NC82中，毛殼屬（Chaetomium）、Gibellulopsis、鐮刀菌屬（Fusarium）、腐質霉屬（Humicola）、unclassified_o__Glomerellales 和小不整球殼屬（Plectosphaerella）6 個屬相對豐度增加，被孢霉屬（Mortierella）、短柄菌屬（Solicoccozyma）、白 子 菌 屬（Leucothecium）、unclassified_k__Fungi、新赤殼屬（Neocosmospora）、赤 霉 屬（Gibberella）、新 型 隱 球 酵 母 屬（Cystofilobasidium）和青霉菌屬（Penicillium）8 個屬相對豐度降低；中抗品種K326 中，被孢霉屬、毛殼屬、短柄菌屬、白子菌屬、unclassified_k__Fungi、新赤殼屬、新型隱球酵母屬和小不整球殼屬8 個屬相對豐度增加，Gibellulopsis、鐮刀菌屬、赤霉屬、腐質霉屬、unclassified_o__Glomerellales 和青霉菌屬6個屬相對豐度降低；高感品種凈葉黃中，被孢霉屬、毛殼屬、短柄菌屬、unclassified_k__Fungi、鐮刀菌屬、赤霉屬和unclassified_o__Glomerellales 7 個屬相對豐度增加，Gibellulopsis、白子菌屬、新赤殼屬、腐質霉屬、新型隱球酵母屬、小不整球殼屬和青霉菌屬7個屬相對豐度降低。

圖3 不同烤煙品種根際土壤真菌相對豐度（屬水平）Fig.3 Relative abundance of fungi in rhizosphere soil of different tobacco varieties（genus level）

2.3.3 黑脛病抗性不同烤煙品種根際土壤關鍵真菌對生物炭輸入的響應 鑒于土壤中微生物的數量之多，豐度差別之大，因此有必要明確生物炭輸入對黑脛病抗性不同烤煙品種根際土壤微生物的影響。以LDA值4.0以上作為LDA判別分析的閾值進行LefSe 分析，以明確不同處理的差異微生物以及它們在不同分組中的富集情況，結果具體見圖4和圖5。由圖4 和圖5 可見，不施生物炭條件下，CK根際土壤中高度富集的微生物有散囊菌綱（Eurotiomycetes）、曲霉屬（Aspergillus）和肉座菌綱（Hypocreales）等，施入生物炭后髕壺菌門（Chytridiomycota）顯著富集；不施生物炭條件下，K326 根際土壤中高度富集的微生物有子囊菌門（Ascomycota）、散子囊菌目（Eurotiales）和曲霉科（Aspergillaceae）等，施入生物炭后銀耳綱（Tremellomycetes）、擬球菌科（Plectosphaerellaceae）和黑輪枝菌屬（Gibellulopsis）等顯著富集；不施生物炭條件下，NC82 根際土壤中高度富集的微生物有被孢霉科（Mortierellaceae）等，施入生物炭后糞殼菌綱（Sordariomycetes）和鐮刀菌屬（Fusarium）等顯著富集；不施生物炭條件下，凈葉黃根際土壤中高度富集的微生物有擬球菌屬（Plectosphaerella）、囊絲菌目 （Cystofilobasidiales） 和 座 囊 菌 綱（Dothideomycetes）等，施入生物炭后擔子菌門（Basidiomycota）和球腔菌屬（Plectosphaerella）等顯著富集。

圖4 不施用生物炭條件下烤煙品種對根際土壤關鍵微生物的影響Fig.4 Effects of flue-cured tobacco varieties on key microorganisms in rhizosphere soil without biochar application

圖5 施用生物炭條件下烤煙品種對根際土壤關鍵微生物的影響Fig.5 Effects of flue-cured tobacco varieties on key microorganisms in rhizosphere soil under the condition of applying biochar

2.4 施用生物炭對黑脛病抗性不同烤煙品種土壤真菌群落相似性特征的影響

由圖6 可見，無論是未植煙土壤還是種植不同品種烤煙土壤，施用生物炭均改變了其土壤真菌群落結構特征，總體上呈現出“處理組內相對聚集，處理組間相對分離”的特點。土壤處理組內分離性在PC1 及PC2 軸上均有體現，施用生物炭后未植煙土壤和凈葉黃組內聚集性減弱，NC82 和K326 組內聚集性增強。對于未植煙土壤，施用生物炭極顯著地改變了土壤樣本的分布態勢，沿著PC1 軸向右方向分布；中抗品種K326 沿著PC1 軸左方向分布；高抗品種NC82 樣本點沿著PC1 軸向左上分布；高感品種凈葉黃沿著PC2 軸向上方分布?？梢?，黑脛病抗性不同烤煙品種根際土壤真菌群落結構對生物炭輸入的響應模式不同。

圖6 生物炭對不同烤煙品種根際土壤真菌群落相似性的影響Fig.6 Effects of biochar on similarity of rhizosphere soil fungal communities of different flue-cured tobacco varieties

基于門水平對黑脛病抗性不同烤煙品種根際土壤真菌群落進行主坐標分析（PCoA），結果（圖7）顯示，不施生物炭條件下，組間差異達到顯著水平（P=0.02＜0.05），PC1 和PC2 是降維提取的對真菌群落結構作用最大的2 個主成分，分別達到57.34%和16.11%；與不種植煙草土壤相比，黑脛病抗性不同烤煙品種根際土壤的樣本點與其呈現明顯的分離，高感品種凈葉黃和高抗品種NC82 根際土壤真菌群落結構具有一定的相似性，中抗品種K326 根際土壤真菌群落結構與高抗品種NC82 發生明顯的分離效應。而施用生物炭后，黑脛病抗性不同烤煙品種根際土壤真菌群落結構相似性增加，分布向未植煙土壤聚集且顯著差異性消失變為無顯著差異性（P=0.055＞0.05）。

圖7 不同烤煙品種根際土壤真菌群落（門水平）主坐標分析Fig.7 Principal coordinate analysis of fungal community（phylum level）in rhizosphere soil of different flue-cured tobacco varieties

3 結論與討論

本研究發現，施加生物炭可不同程度降低煙草黑脛病的發生，施用生物炭后，黑脛病抗性不同烤煙品種發病率與病情指數均明顯降低，發病率表現為NC82＞K326＞凈葉黃，病情指數表現為K326＞NC82＞凈葉黃，這與王光飛等[29]在辣椒上的研究相似，可能是生物炭的多孔性為土壤中抑制病原菌的真菌提供了繁殖發育所需的附著位點[30-31]，同時生物炭的降解為土壤提供真菌生存所需的物質和能量，促進有益菌的增殖并抑制疫霉菌的生長發育，從而降低煙草黑脛病的發生[32]。

黑脛病抗性不同烤煙品種根際土壤真菌群落結構Alpha 多樣性對生物炭輸入的響應不同，不施生物炭條件下，高感品種凈葉黃的根際土壤真菌多樣性高于高抗品種NC82 和中抗品種K326，說明根際土壤真菌多樣性受品種抗性的影響，這是因為不同品種植物的根系分泌物具有特異性，而根系分泌物的不同會影響微生物生長發育進而導致土壤真菌群落結構Alpha 多樣性不同[33-34]；施用生物炭對黑脛病抗性不同烤煙品種真菌群落結構的多樣性影響不同，中抗品種K326 的真菌多樣性顯著升高，高感品種凈葉黃和高抗品種NC82 的真菌多樣性均有不同程度的降低，這與丁瑋等[17]在水稻上的研究結果相似?？赡苁且驗樯锾靠商峁┱婢璧奈镔|和能量，能促進真菌的繁殖生長從而使中抗品種K326根際土壤真菌多樣性增加，同時也會改善土壤微環境，促進某些真菌的生長發育，導致真菌群落個體大小或數量差異增大，群落均勻度降低，進而導致多樣性指數減小[35-36]。

未植煙土壤及各品種烤煙根際土壤真菌的優勢菌門有子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），平均豐度之和在90%以上，這與前人研究結果[37-38]一致。施用生物炭后，不同品種烤煙根際土壤真菌在門水平上相對豐度發生顯著改變的表現不同。通過LefSe 分析可知，黑脛病抗性不同烤煙品種根際土壤關鍵微生物的種群類別不同，且其對生物炭的響應也存在差異。生物炭影響真菌菌群相對豐度變化的原因復雜，還需更進一步研究。

由PCoA 分析可知，不施用生物炭條件下，3 個烤煙品種根際土壤樣本點與不種植煙草土壤呈現明顯的分離，高感品種凈葉黃和高抗品種NC82 根際土壤真菌群落結構具有一定的相似性，中抗品種K326根際土壤真菌群落結構與高抗品種NC82發生明顯的分離效應。施用生物炭后，不同烤煙品種真菌群落結構分布向未植煙土壤聚集且顯著差異性消失變為無顯著差異性，說明施用生物炭改變了黑脛病抗性不同烤煙品種的群落結構，這與王光華等[39]在大豆上的研究相似。

此外，該試驗也具有一些局限性。首先，試驗是在同一生物炭類型及同一用量的情況下進行的，不同類型生物炭及用量可能會造成不同影響，張繼旭等[40]在煙田土壤中添加不同類型生物炭后發現，不同類型生物炭具有不同的增碳固氮效果。石呂等[41]發現，水稻產量和施用生物炭量之間呈正相關關系。其次，試驗采用溫室盆栽的種植方法，具有固定的環境和土壤條件，避免了大田試驗中氣候因素不可控及試驗土壤差異性，因此，要在考慮上述局限性的情況下進一步研究并評估生物炭對黑脛病抗性不同烤煙品種根際土壤真菌群落結構的影響。

綜上，生物碳可有效降低烤煙黑脛病發生。黑脛病抗性不同烤煙品種真菌群落結構在不施生物炭情況下顯著不同，對生物炭的響應趨勢也不同，施用生物炭可改變黑脛病抗性不同烤煙品種的群落結構。