香菇培養料的雙螺桿擠壓滅菌工藝優化

魏書信，王安建，高帥平，田廣瑞，劉麗娜，許方方，李順峰，崔國梅

（河南省農業科學院農副產品加工研究中心，河南 鄭州 450002）

香菇是世界第二大食用菌，約占全球食用菌總產量的25%，是我國總產量最高的食用菌[1-2]。香菇生產目前大部分都采用熟料袋栽培即菌棒栽培模式[3-4]，加工工序基本都為先裝袋再常壓或高壓蒸汽殺菌，這2種滅菌方式都存在需要鍋爐供熱、滅菌料易發酵、環境污染大、耗時、耗工和經常滅菌不徹底的問題，且都面臨著環保禁煤炭后的能源變革引起的成本急升的問題[5-6]。培養料新型滅菌設備及技術研發升級已成為香菇乃至整個食用菌產業亟需解決的關鍵問題。

目前，科研工作者針對食用菌培養料的高效滅菌進行了許多探索研究，但大都集中在煤替代清潔能源、蒸汽間歇式滅菌新設備新技術等傳統鍋爐蒸汽滅菌改進研究上，包括采用微波滅菌等新技術研究在內，幾乎全都采用罐體內密閉間歇滅菌、分批次輸出的工藝[5-7]，連續式瞬時滅菌研究鮮有報道。

雙螺桿擠壓加工是一種集剪切、攪拌、混合、加熱、均質于一體的加工技術，廣泛應用于組織化蛋白加工、膳食纖維生產、休閑膨化食品生產、食品浸油等加工領域，具有生產連續、工藝簡單、能耗低、成本低、綠色加工等優點[8-10]。雙螺桿擠壓機可設置階段性高溫區，因而兼具滅菌功能。香菇培養料以木屑、谷物皮殼為主要原料，富含木質纖維素，而木質纖維素只有在被分解成小分子物質后才能被香菇吸收利用[11-13]，螺桿擠壓固有的剪切及膨化特性能將一部分木質纖維素降解為小分子物質從而更有利于香菇的吸收利用。雙螺桿擠壓加工與傳統蒸汽滅菌相比具有滅菌供能過程零排放、不使用鍋爐壓力容器、滅菌灌裝連續一體完成、節省工序和人工等優點。因此，將雙螺桿擠壓應用于香菇培養料滅菌具有理論可行性和經濟價值。為明確擠壓滅菌應采用何種加工工藝參數、擠壓滅菌后物料性狀的改變情況，在雙螺桿擠壓滅菌設備創制以適應擠壓滅菌香菇培養料的基礎上，針對香菇菌包發菌、轉色、出菇的影響等未知問題，以香菇培養料的滅菌率為指標，通過Plackett-Burman 試驗、最陡爬坡試驗和響應面優化試驗對香菇培養料的雙螺桿擠壓滅菌工藝進行優化，并以傳統蒸汽滅菌為對照進行栽培試驗，以期為雙螺桿擠壓在香菇培養料連續瞬時滅菌中的應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

木屑、石膏、生石灰由西峽縣孫氏菌業專業合作社提供；麩皮購自新鄉市明陽面粉廠；平板計數瓊脂購自北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化鈉由國藥集團化學試劑有限公司生產；香菇L808栽培種由河南駐馬店市農科院提供。

1.2 主要儀器

雙螺桿擠壓滅菌設備由河南省農業科學院農副產品加工研究中心設計定制；VS-1300L-U 潔凈工作臺由蘇州安泰空氣技術有限公司生產；THZ-98AB 恒溫振蕩器、BPMJ-250F 霉菌培養箱由上海一恒科學儀器有限公司生產；GSP-230 隔水式恒溫培養箱由天津市來玻特瑞儀器設備有限公司生產。

1.3 方法

1.3.1 香菇培養料配制 香菇培養料的配方為木屑78%、麩皮20%、石膏1%、生石灰1%、含水量55%。先木屑定量加水并攪拌潤濕一定時間，再加入其他輔料攪拌均勻，配成一定含水量的香菇培養料。

1.3.2 Plackett-Burman 試驗 應用Minitab 17 軟件進行Plackett-Burman 試驗設計，以滅菌率為考核指標，對影響滅菌的木屑潤水時間、原料初始含水量、Ⅰ區溫度、Ⅱ區溫度、Ⅲ區溫度、Ⅳ區溫度、喂料電機頻率、螺桿電機頻率共8 個因素通過2 水平試驗進行顯著影響因素篩選[14-16]。試驗設計因素水平見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels used in Plackett-Burman design

1.3.3 最陡爬坡試驗 通過Plackett-Burman 試驗結果分析，篩選出對雙螺桿擠壓滅菌率有顯著影響的3個因素，設計最陡爬坡試驗，因素爬坡方向由效應值的正負確定，因素步長根據效應值大小結合實際情況設計。其他因素水平依據試驗結果各因素的效應正負進行確定，正效應取高值而負效應取低值[17]。以滅菌率為指標確定因素最佳組合。

1.3.4 響應面優化試驗 利用Design-Expert V8.0.6 軟件設計Box-Behnken 響應面試驗，以最陡爬坡試驗最佳組合水平為響應面因素0 水平，以滅菌率為響應值，進行響應面工藝優化試驗設計，建立響應面數學模型，分析、預測出香菇培養料擠壓滅菌最佳工藝條件，再結合儀器的精確度和操作便利性進一步優化工藝[18]，并對優化工藝進行試驗驗證。

1.3.5 滅菌效果評判 滅菌效果以滅菌后單位質量物料的菌落總數進行評判。在雙螺桿擠出機出料口無菌取樣進行菌落總數測定。從擠壓機出料口開始出料即開始取樣，每3 min 用無菌取樣杯接取1 個樣，每組試驗機器運行30 min 取10 個滅菌樣，試驗樣菌落數取10 個樣的平均數；同批次未滅菌的香菇培養料用無菌取樣杯取3個樣檢測菌落總數，3個樣的平均菌落總數即為原料樣初始菌落數。

菌落總數檢測標準參照GB 4789.2—2016 中的方法[19]。根據檢測結果計算滅菌率，滅菌率計算公式如下。

滅菌率=[（原料樣初始菌落數-試驗樣菌落數）÷原料樣初始菌落數）]×100%。

1.3.6 香菇栽培試驗 按照1.3.1 配方和1.3.4 優化確定的最佳擠壓滅菌工藝制備雙螺桿擠壓滅菌香菇栽培袋，灌裝袋規格為17 cm×55 cm×0.007 cm，常規方法接種香菇L808 進行栽培試驗。以相同配方按照傳統蒸汽滅菌方法（115 ℃滅菌3 h，滅菌全過程8 h）制備香菇栽培袋為對照，考察香菇栽培袋質量、菌棒出菇特性、壞袋率等指標。

1.4 數據處理

利用Design-Expert V8.0.6 和Minitab 17 進行試驗設計分析；除特別說明外，試驗均為3次重復取平均值；響應面試驗滅菌率保留2位小數，其他試驗滅菌率均保留1位小數。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman 試驗設計及結果

Plackett-Burman 試驗設計與結果見表2。從方差分析結果（表3）可知，模型P=0.048＜0.05，建模成功。由P值大小得到各因素對滅菌率的影響大小為原料初始含水量＞喂料電機頻率＞Ⅲ區溫度＞Ⅰ區溫度＞Ⅳ區溫度＞木屑潤水時間＞螺桿電機頻率＞Ⅱ區溫度。其中原料初始含水量、喂料電機頻率、Ⅲ區溫度3 個因素對滅菌率的影響顯著，需進一步做最陡爬坡試驗。由T值可知，喂料電機頻率對滅菌率呈負效應，其他7個因素均呈正效應。

表2 Plackett-Burman試驗設計與結果Tab.2 Experimental design and results of Plackett-Burman

表3 Plackett-Burman 試驗結果分析Tab.3 Statistical analysis of Plackett-Burman design

2.2 最陡爬坡試驗設計及結果

利用3 個顯著因素原料初始含水量、喂料電機頻率、Ⅲ區溫度做最陡爬坡試驗。其他5 因素水平按照效應正值取高數負值取低數的原則，固定為木屑潤水時間3 h、Ⅰ區溫度90 ℃、Ⅱ區溫度140 ℃、Ⅳ區溫度130 ℃、螺桿電機頻率21 Hz。由表4 可知，第4組滅菌率為92.8%最高，第4組為最佳組合，以該組因素水平為0值設計響應面優化試驗。

表4 最陡爬坡試驗設計及結果Tab.4 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 響應面優化試驗設計及結果

2.3.1 Box-Behnken 試驗設計結果與分析 以原料初始含水量、喂料電機頻率、Ⅲ區溫度為響應因子，滅菌率為響應值，試驗設計與結果見表5，二次模型方差分析見表6。經回歸分析，得到滅菌率（Y）對原料初始含水量（A）、喂料電機頻率（B）、Ⅲ區溫度（C）的二次回歸模型方程。

表5 Box-Behnken 試驗設計與結果Tab.5 Experimental design and results of Box-Behnken

表6 響應面二次模型方差分析Tab.6 ANOVA for response surface quadratic model

Y=97.45-6.85A-1.71B+3.21C+3.93AB-0.85AC+6.03BC-7.99A2-7.28B2-3.38C2。

模型P=0.000 4（P＜0.01），極顯著；一次項A、交互項BC、二次項A2和B2對滅菌率的影響極顯著（P＜0.01）；一次項C、交互項AB、二次項C2對滅菌率的影響顯著（P＜0.05）；失擬項P=0.086 2（P＞0.05），不顯著，說明該方程試驗誤差小，擬合度較好；R2=0.960 6＞0.9，說明模型的擬合度較好，=0.910 0，表明利用該模型能解釋91.00%響應值的變化，說明該模型能用于香菇培養料雙螺桿擠壓滅菌工藝的滅菌率理論預測。

2.3.2 響應面分析 Box-Behnken 試驗響應面和等高線圖見圖1。響應面和等高線圖可以較直觀地看出各因素水平與響應值間的關系趨勢以及兩因素間交互作用對響應值的影響[20-21]。從圖1可以看出，原料初始含水量和喂料電機頻率等高線圖橢圓程度較高，響應面圖坡度陡峭，說明原料初始含水量和喂料電機頻率對滅菌率的交互作用顯著，分析原因可能是原料含水量顯著影響原料的軟硬度，螺桿電機頻率影響物料在螺桿中的攪拌翻滾前進速度，兩者共同作用顯著影響原料輸送過程的摩擦擠壓自發熱和吸收外熱的程度，進而影響滅菌率；原料初始含水量與Ⅲ區溫度響應曲面圖坡度較平緩，等高線圖近圓形，表明原料初始含水量與Ⅲ區溫度對滅菌率的交互作用不顯著；喂料電機頻率與Ⅲ區溫度響應曲面圖坡度較陡且其等高線圖橢圓形程度很高，說明喂料電機頻率與Ⅲ區溫度對滅菌率的交互作用顯著，其原因可能是喂料電機頻率決定螺桿擠壓的喂料飽和度，進而影響原料堆積推進速度即影響物料通過Ⅲ區的時間長短，而Ⅲ區溫度監測的實際是料倉外壁溫度，物料通過Ⅲ區的時間長短能直接影響Ⅲ區倉壁溫度與原料的熱傳導時長，進而影響殺菌溫度和最終的滅菌率。

圖1 各因素交互作用對滅菌率影響的響應面圖與等高線圖Fig.1 Response surface plots and contour plots showing the interactive effect of various factors on sterilization rate

依據響應面法建立的數學方程模型，預測分析出香菇培養料雙螺桿擠壓滅菌工藝的最佳工藝條件：原料初始含水量48.61%，喂料電機頻率26.96 Hz，Ⅲ區溫度162.51 ℃，滅菌率預測值為99.878 9%。

結合儀器的精確度和方便操作性，將最佳工藝條件修改：原料初始含水量48.6%，喂料電機頻率27 Hz，Ⅲ區溫度162 ℃。在此工藝條件下做3 批次滅菌驗證試驗，香菇培養料平均滅菌率為99.92%，與預測值比較接近，說明新建模型能較好地預測香菇培養料雙螺桿擠壓滅菌工藝的滅菌率，表明響應面法優化香菇培養料雙螺桿擠壓滅菌工藝是可行的。

2.4 香菇栽培試驗結果

由表7 可知，雙螺桿擠壓滅菌生產的香菇栽培袋質量、菌絲體滿袋天數、轉色天數與對照傳統蒸汽滅菌相比均無顯著變化，菌棒可以正常出菇、菇型良好，香菇單菇質量顯著增加，香菇菌蓋直徑顯著增加、厚度增加但不顯著，香菇菇柄直徑無顯著降低、菇柄長度顯著增加，菌袋的壞袋率顯著降低。

表7 香菇栽培試驗差異性分析Tab.7 Analysis of differences in mushroom cultivation experiments

3 結論與討論

雙螺桿擠壓技術是現代食品工程領域的新技術之一，物料的擠壓處理過程是一個高溫高壓的過程，具有高溫短時、膨化改性的特點，且原料營養成分損失少[22]。但目前市售的擠壓機只能滿足谷物、薯類、淀粉等勻質物料的加工，對于木屑、麩皮等纖維含量高、流動性差、顆粒大小差異較大的食用菌栽培基質原料并不適用。在前期自行研發適用于香菇培養料擠壓滅菌加工的雙螺桿擠壓滅菌設備的基礎上，開發香菇培養料雙螺桿擠壓滅菌新技術，具體通過Plackett-Burman 試驗、最陡爬坡試驗、Box-Behnken 響應面試驗，確定香菇培養料雙螺桿擠壓滅菌的最佳工藝為原料初始含水量48.6%、喂料電機頻率27 Hz、Ⅲ區溫度162 ℃、木屑潤水時間3 h、Ⅰ區溫度90 ℃、Ⅱ區溫度140 ℃、Ⅳ區溫度130 ℃、螺桿電機頻率21 Hz。該工藝加工的菌包壞袋率為2.75%，顯著低于對照傳統蒸汽滅菌的壞袋率4.00%，且能正常進行菌絲體培養、正常變色、正常出菇、菇型良好，表明雙螺桿擠壓滅菌可以應用在香菇培養料的滅菌加工上。

香菇等大多數食用菌都采用熟料袋栽模式，培養料滅菌是菌包加工的共性關鍵技術[23-25]。目前，國內外通用的滅菌方法為傳統蒸汽滅菌方式，即將培養料裝袋后放入滅菌柜內，通過蒸汽加熱升溫、達到設定溫度后保溫一定時間，移出冷卻完成滅菌，都是依賴鍋爐的間歇批次滅菌，存在著升溫慢、時間長、能耗大、人工成本高等問題。而雙螺桿擠壓滅菌與傳統蒸汽滅菌相比具有連續滅菌、物料滅菌受熱時間短營養損失小、能耗低、省工省時、綠色環保等優勢，作為傳統滅菌的替代技術具有較大的優勢。

雙螺桿擠壓滅菌中木質纖維素部分降解成小分子物質更有利于香菇的吸收利用，理論上具有增產和提高生物學效率的功能，但大規模種植應用時增產效果如何還有待明確。本研究僅針對香菇L808栽培適應性進行了初步研究，未來可通過香菇品種適用性研究、配套栽培技術改進研究進一步完善香菇培養料雙螺桿擠壓滅菌新技術體系。