水貂病毒性腸炎桿狀病毒載體滅活疫苗與水貂犬瘟熱活疫苗混合免疫效果評價

吳洪超，霍寧寧，丁航天，曹玉姣，陳亞磊，陳云豫，王璐璐，劉玉秀*，田克恭1，*

(1. 河南農業大學動物醫學院，河南 鄭州 450000；2. 國家獸用藥品工程技術研究中心，河南 洛陽 471003；3. 洛陽惠中生物技術有限公司，河南 洛陽 471003；4. 普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471003)

犬瘟熱是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)引起的急性、高度接觸性傳染病[1]。水貂、狐貍、貉等毛皮經濟動物和犬對該病毒易感，本病已廣泛存在于包括我國在內的所有毛皮動物養殖國家，對毛皮經濟動物養殖業威脅極大[2]?；疾∷醣憩F為呼吸道、消化道癥狀，還伴隨鼻鏡干燥、足墊增厚、皮屑等癥狀。水貂病毒性腸炎是由水貂腸炎病毒(mink enteritis virus，MEV)感染引起的高度接觸性傳染病，發病水貂主要表現為精神不振、食欲減退、腹瀉、嘔吐等[3-4]，該病具有較高的發病率和死亡率[5]。

水貂犬瘟熱和水貂病毒性腸炎是對水貂危害最大的兩種傳染病[6]，臨床上常以接種疫苗作為主要防控措施，對于水貂犬瘟熱活疫苗和水貂病毒性腸炎疫苗的免疫，已被列入養殖場的常規免疫計劃[7]。臨床上常采用不同時間接種以上兩種疫苗，或者在同一時間、不同部位接種疫苗，并且具有良好的免疫效果[8]，但是頻繁抓取或者多次注射，給水貂群造成多次應激，導致死淘率增加，同時也增加了人工成本。然而水貂病毒性腸炎滅活疫苗與水貂犬瘟熱活疫苗混合后同時免疫，是否出現相互干擾而影響免疫效果，還需比較研究。

為了減少水貂群的應激次數，節省人工，同時使疫苗更加符合臨床實際應用，本研究用水貂病毒性腸炎桿狀病毒載體滅活疫苗(簡稱MEV亞單位疫苗)稀釋水貂犬瘟熱活疫苗(簡稱CDV活疫苗)，稀釋后室溫靜置不同時間測定CDV含量，以及對水貂免疫，綜合評價混合免疫的效果，為這兩種病原的疫苗免疫程序優化提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

MEV JL株、CDV HL001株、CDV單克隆抗體、MEV單克隆抗體、Vero細胞，均由普萊柯生物工程股份有限公司保存；MEV亞單位疫苗和CDV活疫苗，均由洛陽惠中生物技術有限公司制備；CDV膠體金檢測試紙條購自洛陽普泰生物技術有限公司；DMEM培養基購自Gibco公司；新生牛血清購自PAN公司；RT-PCR和PCR相關試劑購自北京全式金生物技術有限公司；FITC標記羊抗鼠IgG購自Sigma公司。

4～5月齡健康水貂，均購自洛陽市周邊水貂養殖場。未接種水貂犬瘟熱疫苗和水貂病毒性腸炎疫苗，采集眼鼻拭子和肛拭子經RT-PCR/PCR檢測，CDV和MEV核酸均為陰性，免疫前采血分離血清，采用血清中和試驗測定CDV抗體為陰性，采用血凝抑制試驗測定MEV抗體為陰性。

1.2 方法

1.2.1 不同稀釋液稀釋CDV活疫苗后病毒含量測定

將MEV亞單位疫苗充分搖勻，用注射器抽取10 mL注入CDV活疫苗瓶中完全溶解，輕輕混勻。將充分混勻的混合疫苗在室溫(25 ℃)靜置0、2 h分別取樣測定CDV含量。同時取CDV活疫苗用稀釋液按同樣方法稀釋，稀釋后的CDV活疫苗在室溫(25 ℃)靜置0、2 h分別取樣，用DMEM培養液做10倍系列稀釋，取10-2、10-3、10-4、10-54個稀釋度，與Vero細胞同步接種96孔細胞培養板，每個稀釋度接種6孔，0.1 mL/孔，同時設正常細胞對照6孔，37 ℃、5% CO2培養箱培養4 d，用冷丙酮固定細胞，以CDV單克隆抗體為一抗，FITC標記羊抗鼠IgG為二抗，置熒光顯微鏡下觀察每個稀釋度出現特異性熒光染色的細胞孔數。按Reed-Muench法計算半數熒光抗體感染劑量(50% Fluorescent antibody infectious dose，FAID50)。

1.2.2 動物分組及免疫

將30只健康水貂，隨機分為6組，每組5只，分組及免疫試驗設計見表1。

表1 動物分組及試驗設計

1.2.3 CDV免疫效力評價

第1、3、5組水貂，分別在免疫前和免疫后21 d采血，分離血清，按《中國獸藥典》附注方法測定CDV中和抗體效價。免疫后21 d用CDV強毒攻毒，每只滴鼻2 mL、腹腔注射4 mL(105.5FAID50/mL)，攻毒后觀察21 d，每日觀察水貂的臨床表現，包括精神狀態、食欲、糞便、眼鼻分泌物、鼻鏡、足墊等，攻毒后7～14 d采集眼鼻拭子，用CDV膠體金試紙條檢測排毒情況。攻毒對照水貂眼鼻拭子檢測為CDV陽性，且出現精神不振、食欲減退、排稀便或粘便，眼鼻分泌物，鼻鏡干燥或足墊增厚時，判為發??；免疫水貂眼鼻拭子檢測為CDV陰性，且不出現以上任意臨床表現時，判為保護。

攻毒后21 d處死水貂，采集肺臟，經10%福爾馬林固定，制備切片，HE染色后顯微鏡下觀察肺臟病理變化，另取制備的切片進行免疫組化檢測，切片用馬血清封閉后，滴加CDV單克隆抗體，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌后滴加HRP標記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后滴加AEC顯色液顯色，用蘇木精復染后封片，普通光學顯微鏡下觀察。

1.2.4 MEV免疫效力評價

第2、4、6組水貂，分別在免疫前和免疫后14 d采血，分離血清，按參照文獻[9-10]，并適當改進來測定MEV血凝抑制(HI)效價。免疫后14 d用MEV強毒攻毒，每只灌胃感染水貂腸炎病毒JL株病毒液15 mL(106.5FAID50/mL)。攻毒后連續觀察14 d，并記錄水貂的臨床表現，包括精神狀態、食欲、糞便等。同時在攻毒前和攻毒后3～7 d采集糞便，測定糞便中MEV的血凝(HA)效價。攻毒對照水貂出現精神不振、食欲減退，排稀便、黏便、血便等腸炎癥狀，糞便中病毒HA效價不低于1∶128時，判為發??；免疫水貂不出現以上任意表現時，判為保護。

攻毒后14 d處死水貂，采集小腸，經10%福爾馬林固定，制備切片，HE染色后顯微鏡下觀察小腸病理變化，另取制備的切片進行免疫組化檢測，切片用馬血清封閉后，滴加MEV單克隆抗體，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌后滴加HRP標記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后滴加AEC顯色液顯色，用蘇木精復染后封片，普通光學顯微鏡下觀察。

取采集的糞便樣品作為待檢樣品進行血凝試驗。在微量血凝反應板的1～12孔各加入PBS(0.015 mol/L，pH值6.5)25 μL，取待檢樣品25 μL加入第1孔，混勻，從第1孔吸取混合液25 μL加入第2孔，混勻后吸取25 μL到第3孔，依次2倍系列稀釋至第11孔，棄去25 μL，第12孔為紅細胞對照；吸取1%豬紅細胞懸液加入各孔，每孔25 μL；輕輕振蕩混勻，2～8 ℃作用90 min后觀察結果；在紅細胞對照成立(紅細胞完全不凝集)的條件下，以使紅細胞100%凝集的樣品最高稀釋倍數作為待檢樣品的HA效價。

2 結果與分析

2.1 CDV含量測定

經不同稀釋液稀釋的混合疫苗和CDV活疫苗，在室溫(25 ℃)放置0、2 h取樣測定CDV含量。結果顯示，復溶后的混合疫苗和CDV活疫苗放置2 h內，CDV含量無明顯下降，結果見表2。

表2 CDV含量測定結果 FAID50/mL

2.2 CDV免疫效力評價

CDV中和抗體檢測結果見圖1。由圖1發現免疫后21 d，G1和G3組的CDV中和抗體效價達到1∶64.6～1∶128.8。表明MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗而成的混合疫苗和CDV活疫苗免疫后，均能刺激水貂產生良好的CDV中和抗體。

圖1 水貂血清CDV中和抗體檢測結果

免疫后21 d進行CDV攻毒，結果顯示，混合疫苗和CDV活疫苗單獨免疫組的保護率均為100%，結果見表3和圖2。HE染色顯示，G1和G3組水貂的肺臟均未見明顯病理變化，見圖3A、B，對照組水貂肺臟可見肺泡隔增厚，上皮細胞增生，大量巨噬細胞小灶性浸潤，見圖3C箭頭所示。免疫組化檢測發現，G1和G3組水貂的肺臟均為CDV陰性，見圖3D、E，對照水貂的肺臟為CDV陽性，見圖3F。表明MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗后，不影響CDV疫苗的免疫效力。

A. G1組水貂未見異常；B. G3組水貂未見異常；C. G5組水貂眼睛黏性分泌物、鼻鏡干燥。

A～C. G1、G3、G5組肺臟HE染色；D～F. G1、G3、G5組肺臟免疫組化檢測。箭頭表示肺臟病理變化及免疫組化陽性處。

表3 CDV免疫效力評價結果

2.3 MEV免疫效力評價

MEV HI抗體檢測結果見圖4，發現免疫后14 d，G2和G4組的MEV HI抗體效價達到1∶128～1∶1 024。表明MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗而成的混合疫苗和MEV亞單位疫苗免疫后，均能刺激水貂產生良好的MEV HI抗體。

圖4 水貂血清MEV HI抗體檢測結果

免疫后14 d進行MEV攻毒，結果顯示，混合疫苗和MEV亞單位疫苗免疫水貂的保護率均為100%，結果見表4、表5和圖5。HE染色顯示，G2和G4組水貂的空腸均未見明顯病理變化，見圖6A、B，對照組水貂的空腸可見黏膜上皮細胞腫脹變性、脫落，見圖6C。免疫組化檢測發現，G2和G4組水貂的空腸均為MEV陰性，見圖6D、E，對照水貂的空腸為MEV陽性，見圖6F。表明MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗后，不影響MEV疫苗的免疫效力。

A、B. G2、G4組水貂糞便未見異常；C、D. G6組水貂排稀便、黏便。

A～C. G2、G4、G6組空腸HE染色；D～F. G2、G4、G6組空腸免疫組化檢測。箭頭表示空腸病理變化及免疫組化陽性處。

表4 MEV免疫效力評價結果

表5 攻毒前后水貂糞便中水貂腸炎病毒HA效價測定結果

3 討論

CDV和MEV是危害水貂養殖業的兩大病原，給水貂養殖業帶來巨大損失[11-15]，主要采用接種疫苗進行預防，目前臨床上已經將CDV疫苗、MEV疫苗納入養殖場的常規免疫程序中。早期免疫程序中，將兩種疫苗在不同時間接種，或者在同一時間、不同部位注射，從而達到防疾病的目的，但是該免疫程序仍有優化的空間。

為了減少水貂群的免疫應激次數，降低防疫成本，優化水貂群免疫程序，本研究使用MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗，混合后在室溫靜置2 h檢測CDV含量無明顯下降，為臨床上混合疫苗的使用提供時間保證。羅國良等[16]研究顯示水貂細小病毒性腸炎滅活疫苗稀釋犬瘟熱活疫苗，在25 ℃條件下存放5 h內對CDV含量無明顯影響，與本文的研究結果相近。臨床實際情況下，犬瘟熱活疫苗復溶后2 h內即可用完，本文未檢測兩種疫苗混合后室溫保存2 h或更長時間的CDV含量，但是兩種疫苗混合后2 h內CDV含量無明顯下降，可以滿足臨床使用。

為了評價MEV亞單位疫苗和CDV活疫苗混合免疫的效果，本研究篩選CDV抗原、MEV抗原、CDV抗體、MEV抗體均為陰性的健康水貂，進行混合疫苗的免疫效果評價。CDV和MEV的免疫效力，均采用血清學方法和免疫攻毒方法進行評價，結果混合使用的效果與MEV亞單位疫苗單獨使用、CDV活疫苗單獨使用的效果相當，均能誘導產生高滴度的抗體效價。CDV攻毒后免疫水貂未出現犬瘟熱的臨床表現，眼鼻拭子中未檢測到CDV抗原，剖檢后肺臟未見明顯病理變化，免疫組化檢測為CDV抗原陰性；MEV攻毒后免疫水貂未出現病毒性腸炎的臨床表現，糞便樣品對豬紅細胞的凝集效價遠低于對照組，剖檢后空腸未見明顯病理變化，免疫組化檢測為MEV陰性，表明混合免疫后可產生對CDV、MEV良好的保護效果。

綜上，MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗，混合免疫后各組的免疫效力均不受影響，從而為此兩種疫苗的聯合使用提供試驗依據，為其推廣應用奠定基礎。