miR-384靶向HMGA2對肝癌細胞生物學行為的影響及其機制

馬 偉 張 空 李夢珂

肝癌是全球范圍內常見的一種惡性腫瘤,由于肝癌細胞增殖迅速,且易侵犯門靜脈,導致肝內擴散嚴重,且早期無明顯臨床特征,因此多數患者就診時已處于肝癌晚期,臨床預后效果不佳,患者5年生存率低下,因此尋找治療肝癌細胞增殖和擴散的有效靶點和藥物至關重要[1-2]。miRNAs是一類廣泛存在于真核生物中的非編碼RNA,通過與靶基因的3'末端非翻譯區結合發揮癌基因或抑癌基因的作用,研究發現,miR-384在肝癌細胞中顯著下調,上調miR-384可抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲,誘導癌細胞凋亡[3]。高遷移率族蛋白A2(high mobility group A2,HMGA2)在增殖基因的轉錄調控中具有重要作用,而這一作用可能在腫瘤發生發展中扮演重要角色[4]。研究表明,miR-26a靶向抑制HMGA2表達可降低肝癌細胞增殖、遷移和侵襲能力[5]。此外,HMGA2在肝癌組織中表達明顯上調,長鏈非編碼RNA(LncRNA)-ZFAS1通過結合HMGA2可促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[6]。miR-384是否能通過調節HMGA2表達發揮抗肝癌作用的相關報道甚少,因此本研究通過上調肝癌細胞中miR-384表達,探討miR-384對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響以及對HMGA2表達的調節作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系

肝臟正常上皮細胞THLE3以及肝癌細胞HEP3 B、BEL-7402和HUH7購自美國ATCC公司。

1.2 試劑和儀器

逆轉錄試劑盒以及PCR試劑盒購自美國Sigma公司;miR-384 NC和miR-384 mimic 由上海生工公司合成;miR-384引物序列由廣州銳博生物科技有限公司合成;多功能酶標儀購自美國Bio-Tek公司;倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯;熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 qRT-PCR檢測miR-384在肝癌細胞中的表達

細胞進行常規培養,取第3代對數生長期細胞進行實驗。離心收集細胞,Trizol試劑提取細胞中總RNA,逆轉錄成cDNA,按照反應體系進行熒光定量PCR反應,miR-384的引物序列見表1。

表1 miR-384引物序列

1.4 MTT法檢測細胞增殖情況

將細胞制成單細胞懸液接種于6孔板,置于培養箱中培養,細胞貼壁生長后,每孔20 μl MTT溶液(5 mg/ml)孵育4 h,棄掉上層培養液,二甲基亞砜(DMSO)150 μl孵育,將細胞置于酶標儀上設置波長為490 nm,測定吸光度(A)值。

1.5 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力

細胞遷移能力檢測:收集細胞,制成密度為5×105個/ml的細胞懸液,在每個小室中加入200 μl細胞懸液,下室中加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養基,將小室置于培養箱中培養12 h,用濕棉簽輕輕拭去上室中殘余的細胞,多聚甲醛固定30 min,結晶紫染色20 min,封片,顯微鏡下觀察細胞數量取平均值。

細胞侵襲能力檢測:上室中鋪滿基質膠,其余操作同上。

1.6 雙熒光素酶基因報告法檢測靶向關系

TargetScan軟件預測miR-384與HMGA2的3' UTR端存在互補的結合位點,將該結合位點序列進行擴增,構建野生型(wt)和突變型(mut)HMGA質粒,將兩種質粒分別與miR-384 mimic和mimic NC共同轉染入HUH7細胞后進行培養,測定熒光素酶活性。

1.7 蛋白印跡法檢測HMGA2、E-cad、N-cad和Vimentin蛋白相對表達量

收集細胞進行裂解,離心收集細胞上清液,測定蛋白濃度,調整蛋白濃度并煮沸變性。每個樣本取20 μg蛋白進行電泳,電泳結束后,將蛋白濕轉至PVDF膜上,5%胎牛血清封閉,GAPDH、HMGA2、E-cad、N-cad和Vimentin 抗體(1∶1000)4℃孵育過夜,二抗(1∶5000)室溫孵育1 h,洗膜,顯色,計算灰度值。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 miR-384在肝癌細胞中的表達情況

肝癌細胞HEP3 B、BEL-7402和HUH7中miR-384表達水平[(6.19±0.20),(6.44±0.62),(3.19±0.61)]均顯著低于肝臟正常上皮細胞THLE3(9.33±0.78)(P<0.05)。

2.2 HUH7細胞轉染miR-384結果

與miR-384 NC組比較,miR-384 mimic組miR-384表達水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞miR-384水平比較

2.3 miR-384過表達對細胞增殖的影響

與miR-384 NC組比較,miR-384 mimic組肝癌細胞存活率降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組肝癌細胞存活率比較

2.4 miR-384過表達對細胞遷移和侵襲能力的影響

與miR-384 NC組比較,miR-384 mimic組肝癌細胞中遷移細胞數和侵襲細胞數均減少(P<0.05)。見表4,圖1。

圖1 結晶紫染色檢測細胞遷移和侵襲能力(×400)

表4 各組遷移細胞數和侵襲細胞數比較

2.5 雙熒光素酶基因報告法結果

與miR-384 NC+Wt HMGA2組比較,miR-384 mimic+Wt HMGA2組熒光素酶活性降低(P<0.05);miR-384 NC+Mut HMGA2組與miR-384 mimic+Mut HMGA2組熒光素酶活性比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2,表5。

表5 熒光素酶活性比較

2.6 miR-384過表達對細胞中蛋白表達的影響

與miR-384 NC組比較,miR-384 mimic組HMGA2、N-cad和Vimentin蛋白相對表達量降低,E-cad蛋白相對表達量升高(P<0.05)。見圖3,表6。

圖3 蛋白印跡法檢測細胞中HMGA2、N-cad、Vimentin和E-cad蛋白表達情況

表6 各組細胞中HMGA2、N-cad、E-cad和Vimentin蛋白相對表達量比較

3 討論

目前,臨床上對肝癌的治療具有多種手段,主要包括:手術切除、肝臟移植、局部射頻消融、經導管肝動脈化療栓塞術等,但治療效果并不理想[7]。該惡性腫瘤的病因、發病機制以及新的靶向治療方法一直是學術界研究的熱點和難點。miR-384已被證明在多種惡性腫瘤中具有抑癌作用,例如乳腺癌、鼻咽癌以及腎細胞癌等[8-9]。在肝癌細胞中,Circ-0008285通過靶向作用于miR-384可抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[10]。本研究通過上調肝癌細胞中miR-384表達,探討其對肝癌細胞的影響及其具體機制。

首先本研究通過檢測人正常肝上皮細胞THLE3以及肝癌細胞HEP3 B、BEL-7402和HUH7中miR-384表達水平發現:肝癌細胞中miR-384表達水平顯著低于正常肝上皮細胞,其中以HUH7細胞中miR-384降低最為顯著。因此本研究通過上調miR-384在HUH7細胞中表達水平,探討miR-384對肝癌細胞的影響。肝癌細胞向遠處器官或淋巴結轉移是決定患者預后的關鍵因素,因此降低肝癌細胞的遷移和侵襲能力對治療肝癌具有重要的意義[11]。本研究結果顯示:對照組和miR-384 NC組細胞存活率、遷移細胞數和侵襲細胞數比較,差異無統計學意義,說明miR-384 NC對細胞增殖、遷移和侵襲能力不產生影響;與miR-384 NC組比較,miR-384 mimic組細胞存活率降低,遷移細胞數和侵襲細胞數減少,說明miR-384可抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲。

Xu等[12]研究發現,HMGA2在乳腺癌細胞中過度激活,下調HMGA2表達可抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲,阻礙裸鼠乳腺癌移植瘤生長。此外,HMGA2過表達增強結直腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的耐藥性[13]。Wang等[14]研究表明miRNA-363-3p通過靶向抑制HMGA2從而發揮抗肝癌作用。由此可見,HMGA2表達水平與肝癌進展密切相關。本研究發現miR-384可直接靶向作用于HMGA2,而且miR-384 mimic組細胞中HMGA2蛋白相對表達量低于miR-384 NC組,說明miR-384靶向抑制HMGA2蛋白表達。上皮間質轉化(EMT)是腫瘤細胞發生侵襲和轉移的重要基礎,E-cad、N-cad和Vimentin是腫瘤細胞發生EMT的標志蛋白[15]。在本次實驗中與miR-384 NC組比較,miR-384 mimic組E-cad蛋白表達升高,N-cad和Vimentin蛋白表達降低,說明上調miR-384表達可逆轉EMT過程,抑制肝癌細胞侵襲和遷移。

綜上所述,miR-384可抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲,其可能是通過靶向抑制HMGA2從而逆轉上皮間質轉化過程來發揮作用。