miR-339-5p通過靶向調節p53表達影響腦膠質瘤細胞的轉移活性分析

柳 毅 高絢照 常文廣

惡性膠質瘤是人類中樞神經系統中最常見的原發性腫瘤[1]。盡管在手術技術、化療和放療方面取得了許多進展,但惡性膠質瘤患者的預后仍然頑固地不佳。膠質瘤的進展取決于腫瘤血管的生長[2]。膠質瘤細胞分泌血管內皮生長因子和其他促血管生成因子,促進血管內皮細胞的生長。此外,膠質血管內皮細胞還分泌多種促進腫瘤生長的因子,這些分泌的因子的相互作用可以促進膠質瘤生長[3]。miRNA通過與目標基因的3'-非翻譯區(3'-UTR)結合,在轉錄后水平上調節目標基因的表達。miRNAs調節許多癌癥關鍵的信號通路,進而發揮致癌或腫瘤抑制功能[4]。例如,miR-339-5p的過度表達可以抑制結直腸癌和乳腺癌細胞增殖、侵襲并誘導其凋亡,并且這一過程與miR-339-5p調控p53相關[5]。最近研究發現,相比癌旁組織,miR-339-5p在腦膠質瘤組織中表達下降[6],然而,miR-339-5p對膠質瘤細胞的作用及相關機制尚未報道,因此本研究通過研究miR-339-5p與腦膠質瘤細胞之間的關系,以期為腦膠質瘤的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

人神經膠質瘤U87細胞(上海弘順生物科技公司);Lipofectamine 2000(美國賽默飛公司);AnnexinV-FITC試劑盒(上海碧云天生物科技公司);Transwell chamber(美國sigma公司);TRIzol Reagent(美國Invitrogen公司);TaqMan逆轉錄試劑盒(日本Takara公司);SYBR Premix ExTaqTMReal-Time PCR Kit(美國Thermo Fisher公司);p53, GAPDH單克隆抗體(英國abeam公司);miR-339-5p mimics, si-p53(武漢漢恒生物)。

倒置顯微鏡(美國Thermo公司);酶標儀(美國BIOTEK公司);Western bloting實驗設備(德國PROTEC公司);流式細胞儀(美國BD公司);實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 細胞培養和分組

膠質瘤U87細胞在RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清)中,在37 ℃和5% CO2的培養箱中培養。將細胞分為4組:空白組、miR-339-5p mimic組、si-p53組、miR-339-5p mimic+si-p53組。按照說明書的要求,用Lipofectamine 2000分配并轉染到相應的實驗組。轉染完成后48 h開展后續實驗。

1.3 MTT實驗檢測細胞增殖能力

轉染完成48 h后將細胞轉移至96孔板中,每孔大約5×103個細胞,加入20 μL MTT液(5.0 mg/ml),37 ℃培養4 h,用100 ml二甲基亞砜溶解紫色晶體,通過Mitras2LB943多功能酶標儀在0、12、24、36、48 h分別檢測各組細胞的吸光度(490 nm)。

1.4 蛋白免疫印跡法檢測蛋白質的表達變化

使用RIPA裂解緩沖液從細胞系中提取總蛋白樣品,使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。等量的蛋白樣品在10%的SDS-PAGE上分離并轉移到PVDF膜上。膜在室溫下用5%的脫脂牛奶浸泡2小時。然后將膜與相應的第一抗體在4 ℃下孵育過夜。用TBST洗滌后,將膜與山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶二抗在室溫下孵育2小時,用增強化學發光檢測系統捕捉印跡信號。

1.5 實時熒光定量PCR分析miR-339-5p和p53基因表達水平

使用TRIzol試劑從細胞系中提取總RNA,使用反轉錄試劑盒在37 ℃下60 min或98 ℃下10 min合成cDNA,使用SYBR Premix ExTaqTM實時PCR試劑盒在Applied Biosystems 7500序列檢測器上使用以下引物序列進行實時定量PCR。熱循環條件如下:95 ℃預變性3 min,95 ℃40個循環30 s,60 ℃退火延伸1 min。所有反應均為一式三份。以U6為內參并使用2-ΔΔCq方法計算。引物序列見表1。

表1 所用引物序列

1.6 流式細胞術分析U87細胞凋亡率

轉染72 h后,收獲細胞,用冰冷的PBS清洗兩次,并在4 ℃下用70%的乙醇固定1 h。將細胞與50 μl RNase1在室溫下孵化10 min以降解RNA。在4 ℃下以3500 rpm離心5 min,然后加入5 μl Annexin V-FITC,5 μl碘化丙啶,在室溫下暗中雙染30 min。使用FACScan流式細胞儀評估細胞凋亡狀態。

1.7 Transwell實驗分析U87細胞侵襲能力

在無血清RPMI-1640培養基下,將有轉染完成后的U87細胞接種在Matrigel涂層的小室的上室。將含有15%血清的RPMI-1640培養基加入下室。24小時后,在顯微鏡下觀察到侵入下室的細胞,隨后用結晶紫染色,使用Image J軟件統計U87細胞侵襲情況。

1.8 熒光素酶報告基因實驗驗證miR-339-5p與p53的靶向關系

miR-339-5p與p53的結合位點是通過工具site targetscan獲得的。將p53的3'-UTR片段插入熒光素酶終止密碼子下游的pGL3載體中構建p53-WT。并使用快速定向誘變試劑產生突變體p53-MT。用螢火蟲熒光素酶的報告載體和海腎熒光素酶載體pRLTK共轉染細胞,并加入0.5 μg的miR-339-5p mimic或miR NC。使用雙熒光素酶檢測法連續測量螢火蟲和海腎熒光素酶的活性。

1.9 統計分析

應用IBM SPSS 26.0軟件進行統計分析。計量數據以均值±標準誤差表示。多組間的差異采用單因素方差分析進行比較,兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組膠質瘤U87細胞中miR-339-5p和p53表達情況

各組細胞轉染后,通過qPCR和蛋白免疫印跡檢測miR-339-5p和p53的表達情況。實驗結果發現,miR-339-5p和p53的表達組間比較,差異具有統計學意義(P<0.05)。miR-339-5p mimic組和miR-339-5p mimic+si-p53組miR-339-5p表達水平高于空白組和si-p53組(P<0.05)。si-p53組p53 mRNA和蛋白水平均低于其他3組(P<0.05),miR-339-5p mimic組p53 mRNA和蛋白水平均高于其他3組(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞miR-339-5p和p53表達情況

2.2 膠質瘤U87細胞中p53是miR-339-5p的直接靶點

通過TargetScan發現Has-miR-339-5p與p53基因的3'-UTR存在互補結合位點,見圖1。雙熒光素酶報告基因實驗發現,與陰性對照miR NC組相比,miR-339-5p mimic和p53-WT共轉染的細胞熒光素酶活性明顯增加。另外,蛋白印跡法進一步驗證了miR-339-5p mimic可以促進p53的表達,見表3。

圖1 p53潛在上游miR-339-5p結合位點預測結果

表3 雙熒光素酶報告基因實驗結果

2.3 各組膠質瘤U87細胞的增殖活性比較

MTT實驗結果顯示,各組膠質瘤細胞增殖率組間比較,差異具有統計學意義(P<0.05)。miR-339-5p mimic組細胞增殖率低于空白組、si-p53組和miR-339-5p mimic+si-p53組。與miR-339-5p mimic組相比,miR-339-5p mimic+si-p53組細胞增殖率升高(P<0.05),見圖2和表4。

圖2 各組細胞在不同時間增殖率比較

表4 各組細胞的增殖活性比較

2.4 各組膠質瘤U87細胞的侵襲能力比較

Transwell實驗顯示,各組膠質瘤細胞侵襲細胞數量組間比較,差異具有統計學意義(P<0.05)。miR-339-5p mimic組細胞侵襲細胞數量低于空白組、si-p53組和miR-339-5p mimic+si-p53組。與miR-339-5p mimic組相比,miR-339-5p mimic+si-p53組細胞侵襲數量升高(P<0.05),見表5。

表5 各組膠質瘤U87細胞的侵襲數量比較

2.5 各組膠質瘤U87細胞凋亡率比較

流式細胞術檢測發現,各組膠質瘤細胞凋亡率組間比較,差異具有統計學意義(P<0.05)。miR-339-5p mimic組細胞凋亡率高于空白組、si-p53組和miR-339-5p mimic+si-p53組。與miR-339-5p mimic組相比,miR-339-5p mimic+si-p53組細胞凋亡率下降(P<0.05),見圖3和表6。

圖3 各組膠質瘤U87細胞的凋亡率比較

表6 各組膠質瘤U87細胞的凋亡率比較

3 討論

miRNA可以調節癌癥的發生、發展和轉移,成為相關腫瘤的標志物和治療靶點,從而為腫瘤的診斷和治療提供可能[7]。相關研究分析了癌癥和健康樣本在不同階段的miRNA表達譜,發現miRNA可以區分癌癥和健康樣本。miRNA廣泛存在于膠質瘤中,但每個miRNA的表達水平在膠質瘤中是不同的[8]。相關研究采用實時熒光定量PCR反應鑒定不同程度的惡性腫瘤中10種miRNA的表達水平,發現膠質瘤的惡性程度越高,miR-13和miR-7的表達水平越低,而miR-21、miR-17、miR-9、miR-26a、miR-23a和miR-20a則隨之升高[9]。研究證明,miRNA的差異表達可能是膠質瘤的重要分子生物標志物,在基因表達調控方面具有潛在的研究價值。

最近研究發現,相比癌旁組織,miR-339-5p在腦膠質瘤組織中表達下降,既往研究報道miR-339-5P的表達與淋巴轉移有關,并可能抑制乳腺癌細胞和非小細胞肺癌細胞的增殖和轉移潛力,這一結果提示miR-339-5p可能參與大腦和中樞神經系統的膠質細胞癌變[10]。本文證明了miR-339-5p在人膠質瘤U87細胞的增殖、凋亡和侵襲能力中的作用。本研究結果發現,接受miR-339-5p mimic轉染的人膠質瘤U87細胞的增殖率和侵襲數量都顯著降低,而凋亡率明顯升高。以上結果顯示,過度表達的miR-339-5p可以抑制人膠質瘤U87細胞的增殖和侵襲能力,并促進細胞的程序性死亡。相關研究發現,miR-339-5p抑制非小細胞腫瘤細胞的遷移和侵襲能力,與癌癥淋巴轉移期和淋巴轉移密切相關[11]。還有研究表明,抑制miR-339-5p的表達會提高兩種卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力,而上調的miR-339-5p會減弱這兩種卵巢癌細胞遷移和侵襲能力,這些報道均與本研究結論一致。除此之外,p53腫瘤抑制蛋白是一種轉錄因子,作為許多應激感應途徑的中心樞紐,對細胞對基因毒性應激的反應和抑制腫瘤的發生至關重要[12]。如果p53功能失調,一些DNA損傷得不到修復,這可能導致基因組不穩定,這是癌癥的一個標志。此外,有p53缺陷的細胞能夠逃避凋亡途徑,并在這些細胞壓力的選擇下無限期地增殖[13]。因此,p53在預防致癌方面起著關鍵作用。研究表明,在超過50%的人類癌癥中,p53發生了突變[14]。在本研究中,抑制p53表達后,人膠質瘤U87細胞的增殖和侵襲能力增高,并且凋亡率降低。這一結果說明p53能夠抑制膠質瘤U87細胞活性。一些調控p53或影響p53激活的miRNA已被認為是癌癥中重要的預后生物標志物和/或代表癌癥治療導向的研究對象[15]。因此,更透徹地了解調節這一關鍵途徑的miRNA是很重要的。本研究中,和空白組相比,轉染miR-339-5p mimic后,p53的蛋白和mRNA表達升高。另外,雙熒光素酶報告基因結果顯示,miR-339-5p能夠靶向調節p53的活性。此外,抑制p53后,miR-339-5p對U87細胞的抑制作用明顯減弱,這些結果表明,miR-339-5p能夠通過靶向提高p53表達抑制腦膠質瘤細胞的轉移活性。

綜上所述,研究發現,miR-339-5p能夠抑制腦膠質瘤U87細胞的增殖和侵襲,并促進膠質瘤U87細胞凋亡,同時這一過程與靶向激活p53相關。