蠟梅花發育相關基因CpUFO表達特性與功能分析*

車冰雁 余尚妍 李志能 李先源

（西南大學園藝園林學院 長江上游農業生物安全與綠色生產教育部重點實驗室重慶市花卉工程技術研究中心 重慶 400715）

UFO（unusual floral organs）是被子植物中首個被發現的F-box蛋白，主要參與調控花器官決定與發育（Levinet al.，1995; Samachet al.，1999）。F-box家族是植物中的超大家族之一，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中就有超700多個基因編碼F-box蛋白（Risseeuwet al.，2003）。F-box蛋白在N端具有40～50個氨基酸的保守基序，是SCF泛素復合體（skp1-cullin-F-box）的重要組分，在植物生長發育過程中起著多重作用，包括植物激素信號轉導、自交不親和、花器官發育以及對生物和非生物脅迫的反應等（Zhanget al.，2019）。在泛素系統中，UFO編碼的F-box蛋白負責底物特異性識別，與SKP1（S-phase kinase-associated protein 1）/ASK1（ArabidopsisSkp1-like 1）和Cdc53（cullin）蛋白相互作用，形成泛素連接酶SCF復合體，通過泛素化途徑，促進負調控B類MADS-box基因的蛋白的泛素化，激活B類基因的表達（Leeet al.，1997; Takahashiet al.，2004），形成花瓣和雄蕊。在擬南芥中，UFO亦可作為區域特異性共調因子與LFY（LEAFY）相互作用，共同調控B類MADS-box基因的表達（Zhaoet al.，2001;王利琳等，2004），但該調控路徑依賴于LFY的活性（Soueret al.，2008）。UFO蛋白能夠與LFY蛋白C端結合，直接作用于AP3（apetala 3）啟動子，且通過UFO調控蛋白酶體活性是激活AP3轉錄所必需的（Chaeet al.，2008）。UFO在植物體內外都與LFY相互作用，且這種固定的蛋白互作模式廣泛存在，在矮牽牛（Petunia hybrida）中的DOT（double top）和ALF（aberrant leaf and flower）、水稻（Oryza sativa）的APO1（aberrant panicle organization 1）和APO2/RFL（aberrant panicle organization 2/rice floricula）以及番茄（Solanum lycopersicum）的AN（anantha）和FA（falsiflora）中都得到驗證（Soueret al.，2008; Ikeda-Kawakatsuet al.，2012;Allenet al，1996）。除此之外，UFO還可參與抑制C類MADS-box基因AG（agamous）負調節擬南芥早期花瓣發育（Durfeeet al.，2003）。

在擬南芥中，UFO在整個發育過程中都在莖尖分生組織中表達（Longet al.，1998），主要參與調控花發育過程中一系列復雜的器官發育，其功能缺失會導致花瓣和雄蕊發育嚴重受阻，甚至被萼片、心皮和花絲等嵌合器官所代替，同時，AP3和PI（pistillata）的表達量降低（Nget al.，2001）。短日照條件下，ufo突變體表現營養生長向花序特征的紊亂轉變（Wilkinsonet al.，1995），而UFO的超量表達則會出現花瓣與雄蕊的綴疊。百脈根（Lotus corniculatus）pfo（proliferating floral organs）突變體及豌豆（Pisum sativum）stp（stamina pistilloida）突變體都存在著花瓣與雄蕊發育受損的現象（Ferrándizet al.，1999; Zhanget al.，2003）。研究發現，矮牽牛UFO的同源基因DOT和番茄中的AN失活后將引發花分生組織特性完全喪失，甚至是花序結構的改變，但DOT在擬南芥中的異位表達并未引發擬南芥花序結構的改變（Kusterset al.，2015; Soueret al.，2008）。除此之外，ufo突變還會引起擬南芥葉片畸形（Leeet al.，1997）；異源表達懸鈴木（Platanus acerifolia）PaUFO基因，導致擬南芥蓮座葉和莖生葉逐漸淺裂（張思思，2016）；UFO同源基因STP在豌豆中功能缺失，則會產生簡化的葉片（Tayloret al.，2001）。近期研究中還發現過表達蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）MtUFO會導致植株小葉片數量增多（石欣玥等，2020）。

蠟梅(Chimonanthus praecox)是我國特有的冬季觀花樹種，被廣泛應用于園林綠化，盆景制作，切花生產等，同時蠟梅花具有較高的藥用價值，其花香馥郁，是制作精油、香料的材料（魏瑋等，2010），因此對其花發育的研究十分有意義。UFO是被子植物中首個被發現的F-box蛋白（Levinet al.，1995），也是泛素介導蛋白質水解過程中具有底物識別特性的蛋白質（Takahashiet al.，2004），在模式植物擬南芥中，UFO已被證實參與調控花器官決定與發育（Samachet al.，1999）。鑒于此，本試驗從蠟梅中克隆CpUFO，構建35S::CpUFO過表達載體并轉化擬南芥，進而探究轉基因植株的表型變化，以期為闡明蠟梅花發育分子調控機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料素心蠟梅（C. praecox ‘Concolor’）種植于校內，常規養護管理。擬南芥哥倫比亞野生型（Columbia，Col-0/wild type，WT）種植在（22±2）℃、光周期16 h光/8 h暗、濕度70%的人工氣候室。

pMD19-T克隆載體購自于日本TaKaRa公司（大連）。pCAMBIA1300植物表達載體由本實驗室保存。大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α感受態細胞由本實驗室自制，根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101由本實驗室自制。

1.2 CpUFO基因克隆及系統進化分析

以成年蠟梅不同花期的花朵為材料，利用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（艾德萊生物）提取蠟梅總RNA，以NanoDrop2000微量核酸測定儀（美國Thermo）和1%瓊脂糖凝膠電泳相結合的方法檢測RNA濃度及質量。使用PrimeScript?RT-PCR Kit反轉錄試劑盒（大連寶生物）獲得cDNA，根據華中農業大學饋贈的蠟梅基因組、注釋信息、CDS（coding sequence）等（Shanget al.，2020），擴增得到CpUFO編碼序列全長，連接pMD19-T載體轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經藍白斑篩選及PCR檢測后，將含陽性克隆子菌液送公司測序。所用引物見表1。

表1 本研究所使用引物①Tab. 1 Primers used in this study

利用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）和SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）在線工具分別對CpUFO基因編碼的蛋白進行分析與二級結構預測，運用Blastp搜索其同源氨基酸序列。多重序列比對及作圖分別使用ClustalW和GeneDoc軟件。系統發育樹構建及美化分別使用MEGA-X軟件和iTOL（https://itol.embl.de/）在線工具，采用鄰接法（neighbor joining，NJ），泊松模型（Poisson Model），Bootstrap method選擇1 000個重復，其他參數默認。

1.3 CpUFO在不同的組織、器官及花發育時期表達特性分析

以成年蠟梅的莖、葉、腋芽、果及初開期的花器官（外花被片、內花被片、雄蕊、雌蕊）為材料，進行CpUFO表達特性分析。從2018年3月8日—12月30日，對蠟梅花芽分化期、露瓣期、始花期至盛開期花芽進行取樣（液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存，用于總RNA的提?。?，分析CpUFO在花發育過程中的表達模式?？俁NA提取及反轉錄方法同上。選用蠟梅CpActin與CpTublin基因作為實時熒光定量的雙內參基因，反應體系根據SsoFastTMEvaGreen Supermix熒光定量試劑盒（美國Bio-Rad）內說明書配制，利用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進行表達分析，試驗數據通過Bio-Rad ManagerTMSoftware（Version 1.1）軟件進行分析，用2-△△CT法獲得目的基因的相對表達量。定量引物見表1。

1.4 轉基因擬南芥篩選、表型觀察及內源基因表達分析

采用雙酶切法構建CpUFO過表達載體，并命名為pCAMBIA1300-CpUFO。利用蘸花法（Cloughet al.，1998）轉化擬南芥Col-0，轉化后的T0代種子播種在含50 mg L-1潮霉素（hygromycin，Hyg）和125 mg L-1羧芐青霉素（carbenicillin，Cb）的MS固體培養基上進行陽性植株篩選，使用CTAB法提取35S::CpUFO/擬南芥和WT整株基因組DNA，進行PCR陽性檢測。采用Trizol法分別提取T2代35S::CpUFO/擬南芥和WT整株總RNA，利用qRT-PCR檢測過表達（over expression，OE）株系中CpUFO的表達量，篩選出表達量高、中、低的株系并進行表型觀察和內源基因表達量分析，所用引物見表1。

2 結果與分析

2.1 CpUFO目的基因獲得與結構域分析

從蠟梅cDNA中克隆得到CpUFO的基因序列，該基因位于第6條染色體上，有2個外顯子（圖1A、B）。其基因全長cDNA序列為1 665 bp，包含1 212 bp的完整開放閱讀框（ORF）和346 bp/107 bp的5'/3'-UTR區（untranslated region）。將CpUFO測序結果在NCBI上Blastx比對發現，該基因屬于F-box家族。

圖1 CpUFO序列基本特征（A-C）、CpUFO與其他同源蛋白多序列比對（D）及系統進化分析（E）Fig. 1 Basic characteristics of CpUFO sequence (A-C), multiple alignment (D) and phylogenetic evolution analysis (E) of CpUFO and the other homologous protein

2.2 CpUFO編碼蛋白特征及系統進化分析

2.2.1 CpUFO蛋白基本特征分析 利用ProtParam軟件在線分析結果表明：CpUFO基因編碼蛋白由403個氨基酸組成（圖1C），其中包含47個堿性氨基酸［strongly basic(+) amino acids］、43個酸性氨基酸［strongly acidic(-) amino acids］、174個疏水氨基酸（hydrophobic amino acids）和126個極性氨基酸（polar amino acids），所占百分比依次為11.6%、10.7%、43.2%和31.2%；預測分子式為C2071H3183N545O592S24；總原子數為6 415，等電點pI值為6.55；不穩定系數（instability index)為50.69，由此可以推測該蛋白是不穩定的蛋白。脂肪系數為84.81，是親水蛋白。

利用SOPMA對CpUFO蛋白前體二級結構進行預測結果顯示，其主要由12.41%α螺旋（α helix）、29.53%的延伸鏈（extended strands）、0.00%β轉角（β turn）和58.06%的隨機卷曲（random coil）組成。

2.2.2 CpUFO蛋白系統進化分析 將CpUFO的最大ORF翻譯的蛋白序列在NCBI上進行Blastp比對，從比對結果可以看出CpUFO蛋白與其他物種的UFO蛋白相似性并不高，其中僅與沉水樟（Cinnamomum micranthum）的同源性達80%以上，為82.13%。從CpUFO與擬南芥、葡萄（Vitis vinifera）、水稻等10個物種的UFO同源蛋白多序列比對結果也可以看出，CpUFO蛋白與其他UFO蛋白相似性不高，但其結構域比較保守（圖1D）。

從NCBI上下載CpUFO同源蛋白序列以及一些F-box蛋白，構建系統進化樹，結果如圖1E所示。系統進化分析顯示，CpUFO同柳葉蠟梅（Chimonanthus salicifolius）、睡蓮（Nymphaea colorata）、沉水樟聚為一支，且與柳葉蠟梅親緣關系最近。

2.3 CpUFO表達特性分析

2.3.1 不同組織、器官中CpUFO表達特性分析 通過qRT-PCR進行組織特異性分析表明，CpUFO的表達主要集中在花器官中，其中外花被片中表達量最高，內花被片中表達量次之，雌/雄蕊中表達量相當。在腋芽、葉、莖、果中，CpUFO表達量依次降低，在果中表達量僅0.02，不足外花被片中表達量的1/100，表達差異極顯著（圖2A）。同時，LFY、WOX13（WUSCHEL related homeobox 13）、AP3、SEP1（Sepallata 1）在蠟梅中的同源基因也均顯示在外花被片中表達量最高（圖2B-E），由此推測CpUFO可能與上述基因存在一定的調控關系，并共同調控外花被片的發育。

圖2 不同基因在蠟梅不同組織、器官中的相對表達量（A-E）及CpUFO在不同花發育時期的相對表達量（F）Fig. 2 Relative expression of different genes in different tissues or organs (A-E) and relative expression of CpUFO at different floral development periods of C. Praecox (F)

2.3.2 自然條件下不同花發育時期CpUFO表達特性分析 利用qRT-PCR對CpUFO在蠟梅不同花發育時期花芽中的表達模式進行分析，結果表明，從蠟梅花原基形成階段進入休眠階段，到子房發育成熟，再到開花前的需冷量累積階段，CpUFO基因表達量均較低，且整體呈先升高后降低的趨勢；其中4月28日和5月25日花原基形成期、6月5日—19日休眠起始階段的表達量相對較高，是其他時期表達量的1.75～9.00倍。CpUFO在花芽打破休眠/花蕾開放階段的露瓣DT（displayed tepal）、始花IB（initiate blooming）和盛開期OF（open flower stage）花芽中表達水平達到最高，均極顯著高于其他時期花芽，分別是子房發育階段及需冷量累積階段的38.7倍和38.9倍（圖2F）。

2.4 35S::CpUFO/擬南芥表型分析

對CpUFO過表達擬南芥T0代經PCR篩選后（圖3A, B），對純合35S::CpUFO/擬南芥T2代不同株系中CpUFO基因的表達量進行qRT-PCR檢測，挑選出CpUFO基因表達量高/中/低的OE6-1/OE16-3/OE1-1株系（圖3C），進行表型觀察。結果表明，35S::CpUFO株系OE6-1/16-3/1-1均具有明顯的早花現象，且與表達量成正相關。對花器官進行解剖觀察后發現，在同一個開花生長時期的轉基因株系中雌蕊柱要比WT株系的雌蕊柱長，但成熟后的果莢長度無明顯差異。過表達株系中蓮座葉數目顯著減少，抽薹時間、第1個果莢形成時間縮短，且與表達量成負相關。綜上所述，推測CpUFO過表達能夠縮短擬南芥營養生長時間、促進早花，并對其花器官產生一定影響（表2，圖3D-I）。

圖3 35S::CpUFO/擬南芥株系篩選及T2代株系表型分析Fig. 3 Screening of overexpression and phenotypic analysis of T2 generation of 35S::CpUFO/Col-0 lines and WT in A. thaliana

表2 35S::CpUFO/擬南芥T2代株系表型分析①Tab. 2 Phenotypic analysis of T2 generation of 35S::CpUFO/Col-0 lines and WT

2.5 35S::CpUFO/擬南芥內源基因的表達分析

為探究35S::CpUFO/擬南芥表型變化的原因，選取擬南芥中5個花發育相關基因進行qRT-PCR分析。結果表明，擬南芥中的AP1、AP3、FUL（fruitfull）基因均有不同程度的上調，同時OE1-1株系中3個基因的表達量均顯著高于WT株系。與野生型相比，35S::CpUFO/擬南芥中作為調控開花的抑制因子TFL1（terminal flower 1）基因顯著下調（圖4）?？梢?，蠟梅CpUFO基因過表達具有促進擬南芥早花的功能。

圖4 35S::CpUFO/擬南芥T2代株系內源基因的相對表達量Fig. 4 Relative expression of endogenous genes from T2 generation of 35S::CpUFO/Col-0 lines and WT

3 討論

目前，已經在擬南芥（Levinet al.，1995）、金魚草（Antirrhinum majus）（Ingramet al.，1997）、玉米（Zea mays）（Chucket al.，2002）、水稻（Ikedaet al.，2007）、波斯菊（Cosmos bipinnatus）（Liet al.，2019）、蒺藜苜蓿（馬翠娜等，2020）等多個物種中分離并克隆得到UFO及其同源基因，并在不同物種中對其參與花發育調控機制進行研究。研究表明，UFO基因參與調控花分生組織形成及花器官識別，但其調控網絡在不同物種間可能具有一定差異，如擬南芥UFO基因缺失將導致花瓣和雄蕊發育嚴重受阻（Ingramet al.，1995）；UFO同源基因FIM（Fimbriata）在金魚草中異常表達會導致其無法形成正常的心皮（Ingramet al.，1997）。而在頭狀花序植物波斯菊中，CbUFO基因的缺陷表達，則會導致難以區分的花序外圍和中心（Liet al.，2019）。UFO與LFY同源基因相互作用在多個物種中得到驗證，但在懸鈴木及樟樹（Cinnamomum camphora）開花機制研究中這一互作關系卻不明顯（張思思，2016; 周琴，2016），初步推測可能是由于UFO與LFY同源基因在木本植物花發育調控過程中產生了功能冗余或是分化，亦或是兩者的表達域在空間與時間上無法重疊導致。而在木本植物水杉（Metasequoia glyptostroboides）中，UFO與LFY同源基因仍存在互作關系（王菁菁，2019）。因此，對于CpUFO基因的研究，不僅能夠豐富UFO基因參與調控植物開花機制的多樣性，也能為蠟梅觀賞性狀改良提供更多線索。

研究顯示，UFO在不同物種組織間廣泛表達。在擬南芥、油松（Pinus tabuliformis）以及樟樹中，UFO基因在營養組織和生殖組織中均有表達，但其表達量在時空上呈現顯著差異，與花發育的表達模式密切相關。如擬南芥UFO表達主要集中在中心區域，且隨花發育的進行，在空間上表現出精確的界限，最后僅局限于花瓣原基區域（Ingramet al.，1995）；油松UFO同源基因PtUFO2主要在雌雄球花中表達，且表達量均在雌雄球花的花發育初始階段達到最高（袁露，2015）；樟樹CcUFO在花苞中表達量最高，作用于花發育早期階段，促進早花（周琴，2016）。在本研究中，CpUFO同樣廣泛表達于蠟梅不同組織，在花器官中，尤其是外花被片中表達量達到最高；同時CpLFY表達量也顯示在外花被片中達到最高，這可能與花器官形成與正常發育相關，符合UFO基因功能在不同物種間具有保守性這一結論，即UFO激活LFY，UFO與被激活的LFY相互作用進一步激活B類MADS-box基因（Ikedaet al.，2007; Soueret al.，2008）。在全年不同發育階段花芽中，CpUFO在露瓣、始花和盛開期表達量相對最高，這與樟樹花發育表達模式相似（周琴，2016）。由此推測，CpUFO可能參與蠟梅開花調控及花器官發育。

在蠟梅CpUFO過表達擬南芥的表型觀察中發現，35S::CpUFO/擬南芥出現蓮座葉減少、開花提前的現象，與擬南芥中異位表達樟樹CcUFO表型觀察結果一致（周琴，2016）；在35S::CpUFO/擬南芥株系與WT株系內源基因相對表達量分析中發現，CpUFO的超量表達，引起了擬南芥B類功能基因AP3的表達，同時，擬南芥中成花抑制因子TFL1下調，從而上調其下游基因AP1的表達，進而促進花分生組織的形成、提早開花，同已報道的擬南芥中的研究結果一致（Takahashiet al.，2004; Blumelet al.，2015）；UFO蛋白可通過參與修飾LFY蛋白，來增強LFY的轉錄活性（Chaeet al.，2008）；同時，TFL1在擬南芥營養生長向生殖生長轉變過程中對LFY具有負調控作用（王利琳等，2004; Zhuet al.，2020），但在本研究中，LFY的表達量并無顯著變化。前人的研究發現，UFO同源基因在參與花發育過程中具有保守性（Levinet al.，1995;Ingramet al.，1997; Ikeda et al.，2007），但在本試驗中，CpUFO的超量表達除促進轉基因株系中雌蕊柱的伸長外，并未見明顯的花器官身份改變，推測是CpUFO活性在擬南芥中受限所致（Kusterset al.，2015）。綜上所述，35S::CpUFO/擬南芥表型及其內源基因相對表達量分析結果與擬南芥UFO激活花器官決定基因、觸發花發育及TFL1參與成花抑制功能研究結果相似（Shannonet al，1991; Ohshimaetal.，1997;Zhaoet al.，2001; Hananoet al，2011; Risseeuwet al.，2013），推測CpUFO基因能夠促進蠟梅開花，但其分子作用機制還需深入研究。

4 結論

本研究克隆得到蠟梅CpUFO基因全長cDNA序列為1 665 bp，編碼403個氨基酸。系統進化分析發現，CpUFO與無油樟聚為一支，進化地位較低，但結構域比較保守，具有F-box家族典型的F-box基序。35S::CpUFO過表達擬南芥研究結果顯示，CpUFO可能促進植物營養生長向生殖生長的轉變，形成早花，同時參與調控花器官的發育，這為闡明蠟梅花發育分子調控機制提供一定參考。