木材分子考古研究進展*

焦立超 陸 楊 郭 雨 殷亞方

（中國林業科學研究院木材工業研究所 中國林業科學研究院木材標本館 國家林業和草原局木材標本資源庫CITES全球野生動植物鑒定實驗室 北京 100091）

木材作為人類最早使用的天然材料之一，因獲取方式簡單、資源豐富、用途多樣等優點，從史前時代至今一直被廣泛用于社會生活的諸多方面，幾乎貫穿整個人類社會發展歷史（Sandstr?met al.，2002；Walsh-Korbet al.，2019；王樹芝，2017；趙廣杰，2021；Luet al.，2023）。木質遺存是人類文化遺產的重要載體，蘊含著豐富的歷史文化和生態價值，隨著考古發現的日益豐富和現代科學技術的不斷發展，人們對木質遺存的保護、修復和研究更加迫切，通過包括木材學、測年技術、分子生物學等在內的木材考古學方法手段研究木質遺存蘊含的自然和社會屬性，可為木質文物的歷史信息挖掘、修復和保存提供科學依據。

分子考古學（molecular archaeology）是一門新興的交叉學科，主要針對古DNA分子開展研究，是目前考古學的熱門方向。分子考古學的理論基礎是分子系統學（molecular phylogenetics）和群體遺傳學（population genetics）。最早關于木材分子考古的研究可追溯至20世紀90年代（Dumolin-Lapègueet al.，1999），采用聚合酶鏈式反應（PCR）技術從14世紀的水壩櫟木（Quercus）木樁中成功獲取長度為290 bp的葉綠體非編碼區DNA片段。近年來，隨著古DNA捕獲和測序分析技術的快速發展，木材古DNA研究逐步取得長足進展，采用分子生物學手段已分別從木結構古建筑承重構件（Jiaoet al.，2022）、飽水考古櫟屬木材（Wagneret al.，2018）甚至亞化石木（Lendvayet al.，2018）中成功獲取微量且高度降解的古DNA信息。本文梳理國內外木材分子考古研究的主要進展，總結該領域的需求和難點，并提出優先發展方向，以進一步加強木材分子考古等多學科交叉研究，推動新理論、新方法、新技術在木材學和考古學領域的應用，為木質文物修復、保護與保存，深入理解先民認知與利用森林資源方式以及復原歷史時期地域性森林植被類型和物種多樣性提供科學依據。

1 木材分子考古研究發展概述

古DNA是木材分子考古研究的核心，其利用現代分子生物學手段提取和分析保存在木質遺存中的古DNA分子，以解決考古學問題。

古DNA指從生物遺骸或環境中獲取的古代生物遺傳物質（Higuchiet al.，1984；P??bo，1989；Kistleret al.，2020；Jiaoet al.，2022），作為重要的遺傳信息載體，其從分子水平記錄著生物的進化、遷移及其對環境和氣候變化的響應。隨著以第二代DNA測序技術為基礎（Rasmussenet al.，2010）并結合古DNA提取與富集方法的建立和發展，分子考古研究已由成功提取古DNA片段為起點進入古基因組分析時代（R?mpleret al.，2006；Kistleret al.，2020），通過分子考古研究有望突破時間和空間尺度局限，為解決生物進化歷史、滅絕物種和現存物種進化關系、古環境中生物主要組成等重建問題，以及深入探究物種遷徙、入侵和滅絕等內在原因提供科學途徑和技術手段（Hofreiteret al.，2015）。

迄今為止，全球分子考古研究多集中于人類和動物物種。1984年，《Science》期刊首次報道從滅絕的斑驢（Quagga）標本中成功提取長度為229 bp的線粒體DNA片段（Higuchiet al.，1984），標志著分子考古研究序幕的開啟。植物分子考古研究始于1985年，從保存500～44 600年前的葉片、種子和胚芽等材料中成功獲取了DNA（Rogerset al.，1985）。當前，植物分子考古研究主要涉及小麥（Triticum aestivum）（Wuet al.，2019）、玉米（Zea mays）（Liaet al.，2007）、稻（Oryza sativa）（Castilloet al.，2016）等古作物遺存，為植物起源與演化、農作物馴化等提供了重要科學參考。木材（樹木木質部）作為一種重要的植物組織類型，盡管與森林植被演變和人類文明發展密切相關，但與其他植物組織樣本相比，木材分子考古研究仍較缺乏。20世紀90年代，研究人員采用PCR技術從櫟木中獲取葉綠體DNA片段（Dumolin-Lapègueet al.，1999），開啟了木材古DNA研究（圖1）。在隨后迅速發展的高通量測序技術背景下，科研人員從保存時間跨度550年至13 000年的櫟屬飽水考古木材以及亞化石材料中成功獲得木材內源DNA信息，并評估了影響木材細胞古DNA保存的關鍵環境因素（Lendvayet al.，2018；Wagneret al.，2018）。Jiao等（2022）將古DNA液相雜交捕獲技術應用于故宮古建筑楠屬（Phoebe）木材，成功獲得了高質量質體DNA基因組。開展木材分子考古研究，為進一步揭示古代人類生活方式和社會文化發展提供了新的途徑。

圖1 木材相關分子考古研究的主要時間線（1999—2022年）Fig. 1 Main timeline for molecular archaeological research for ancient woods (1999—2022)

2 木材古DNA保存和降解

生物細胞死亡后，水解、氧化和微生物作用將直接造成DNA雙螺旋結構主鏈斷裂和分子降解（Camposet al.，2012；Kapustaet al.，2017）。古DNA保存時間的限制由其降解速率決定，降解速率主要取決于考古材料自身條件和保存環境（Parducciet al.，2005；2017）。

起源于樹木形成層的木質部主要由木纖維、管胞、導管分子和薄壁細胞等不同類型細胞構成。在樹木心材形成過程中，管胞、導管分子等軸向管狀細胞的細胞壁和原生質體發生明顯變化，細胞器也隨之消失（Nakabaet al.，2011）；而具有養分存儲和徑向輸導功能的射線薄壁細胞可能保持數十年甚至上百年的生命活力（Morris，2016）。盡管在木質部形成尤其是細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）階段，細胞核及其他各種細胞器開始降解，DNA也逐漸被釋放的核酸酶分解，但仍會有少量質體等細胞器甚至片段化的DNA最終附著在細胞壁上，同時木質化的細胞壁形成的封閉微空間也可能為DNA的長期保存提供良好環境（Gugerliet al.，2005），然而在時間和空間維度的共同作用下，考古木材內源古DNA普遍發生降解、損傷等顯著變化。

對古代樣本中殘存DNA分子的研究表明，DNA降解并非線性過程，且損傷速度不與時間呈正比關系，在生物死亡后的早期，因核酸內切酶的活性致使DNA發生迅速降解；核酸內切酶活性喪失后，DNA降解速率變慢并保持相對穩定狀態（Yang，1997）。古DNA的存在狀態與溫度、氧含量、濕度、pH和腐殖酸含量等保存條件有關（盛桂蓮等，2016；Kistleret al.，2017）。古DNA分子發生化學損傷時，主要表現為含氮堿基脫氨基、脫嘌呤以及脫嘧啶等（表1），尤其是DNA鏈5′端C→T錯配和3′端G→A的互補，這一變化特征已成為檢驗所獲取古DNA真實性的重要標準之一（Willerslevet al.，2005；楊周岐等，2006；Briggset al.，2007；Skoglundet al.，2014）。研究表明，從存儲時間超過600年的古建筑楠木構件樣本中獲取的古DNA片段 3′端G→A損傷率為1.5%～5.7%，5′端C→T損傷率為0.3%～2.4%（Jiaoet al., 2022）；而存儲時間8 000年的出土飽水櫟屬木材古DNA片段 3′端G→A和5′端C→T損傷率均超過30%（Wagneret al.，2018）。因此，古DNA末端存在的化學損傷行為成為限制序列信息準確提取的關鍵因素。

表1 古DNA損傷主要類型（Hofreiter et al.，2012；Orlando et al., 2021）Tab. 1 Main types of ancient DNA damage

3 木材古DNA獲取

木材古DNA具有降解、損傷和易污染等特性，構建有針對性的古DNA提取方法尤為關鍵?？脊拍静腄NA提取方法主要包括樣品前處理（外源污染去除）、提取純化、文庫制備和基因捕獲（圖2）等步驟。

圖2 考古木材DNA獲取流程（修改自Jiao et al., 2022）Fig. 2 The process of archaeological wood DNA acquisition (modified from Jiao et al., 2022)

3.1 外源DNA污染去除

考古木材與古人類骨骼等遺存類似，在樣本現場發掘與采集、運輸、儲存、實驗室提取與分析階段極易受現代外源DNA的污染（Sampietroet al.，2006；Pilliet al.，2013）；而且，在長期存儲過程中樣本表層甚至內部多會發生微生物侵染。因此，在外源污染控制方面，最直接的途徑是在樣本預處理階段對考古木材中的微生物和現代DNA進行去除，樣本表面組織去除、次氯酸鈉處理、紫外照射等是去除外源污染的常用有效方法。根據樣本實際尺寸通常將表面組織切除1～3 mm，以消除表面殘存的微生物甚至現代DNA污染。研究表明，木材樣本經0.5%次氯酸鈉浸泡處理后外源污染可有效去除，但該方法也同時易造成內源DNA的損失（Malmstr?met al.，2007；Korlevi?et al.，2015）。相比單一處理方法，通過表面去除、次氯酸鈉處理和紫外照射3種方法的有效結合，更有助于提升外源污染的去除效果（Lendvayet al.，2018）?？傮w來說，在木材樣本采集和處理過程中應通過制定并執行嚴格的古DNA試驗操作規程，將外源DNA干擾因素降至最低（Hofreiteret al.，2012；Marx，2017），這對古DNA研究極為關鍵。

3.2 木材古DNA提取與純化

考古木材DNA提取方法的發展是建立在植物DNA常規提取方法基礎上，并通過技術參數改進優化逐步形成的。目前，常見的古DNA提取方法主要包括十二烷基硫酸鈉（SDS）法、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、硅離心柱法和磁珠法等。利用含十二烷基硫酸鈉（SDS）、蛋白酶K和二硫蘇糖醇（DTT）的DNA裂解方法，從取自湖泊或海洋的亞化石木中可成功獲取木材內源古DNA（Waleset al.，2014；Wagneret al.，2018）；向十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）裂解液中加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP），可顯著提升木材化石中古DNA提取效率（Gómez-Zeledónet al.，2017；Sobiehet al.，2020）；基于硅離心柱或磁珠的商用DNA試劑盒優化提取方法，也被證實可有效提取亞化石木、飽水木材和古建筑木構件等樣本的DNA（Lendvayet al.，2018；Akhmetzyanovet al.，2020）。

此外，與現代健康木材相比，因受環境和生物因子影響，考古木材細胞壁化學成分會發生改變，其熱水抽提物和1%NaOH抽提物相對含量均顯著提高，這些抽提物包含較多的多糖、多酚等成分（Gaoet al.，2014；袁誠等，2019），嚴重影響其DNA的有效提取。同時，在古DNA抽提過程中常有腐殖酸、無機沉積物或微生物代謝產物等成分也一并被提取出來，直接抑制下游反應。因此，考古木材樣本粗提液通常需要進一步純化，以獲得較高質量的內源古DNA。目前DNA純化方法主要包括溶劑萃取法和二氧化硅吸附法，溶劑萃取法即采用苯酚、氯仿、異戊醇等有機溶劑萃取抽提液中的多酚、蛋白質以及脂類等有機代謝產物后，通過超濾離心管對古DNA進行進一步濃縮純化（Calvignacet al.，2008；Fuet al.，2014；Wagneret al.，2018；Kistleret al.，2020）；二氧化硅吸附法則基于二氧化硅顆粒吸附核酸原理，將裂解液中古DNA與經修飾的二氧化硅磁珠表面高效結合，通過洗脫即可獲得高質量的DNA提取液（Vaneket al.，2009；Gómez-Zeledónet al.，2017）。與溶劑萃取法相比，二氧化硅吸附法以單一方式將DNA固定在二氧化硅表面，對考古木材樣品抽提液中抑制成分的去除更加徹底。

盡管古DNA提取與純化已取得明顯進展，但由于考古木材保存狀態的不均勻性以及儲存環境的復雜性和特殊性，仍需進一步探究并不斷完善考古木材DNA提取方法。

3.3 木材古DNA雜交捕獲

從木質遺存中獲取的內源古DNA含量通常較低，難以采用聚合酶鏈式反應（PCR）技術進行有效擴增。隨著高通量測序等分子生物學技術的不斷發展，包括誘餌設計、總DNA獲取、文庫制備、雜交捕獲、雜質DNA片段清除、高通量測序等流程在內的古DNA液相雜交捕獲方法在古人類和古動物考古領域已取得突破（Fuet al.，2014；Orlandoet al.，2015；Wanget al.，2021）。其基本原理是通過生物素探針特異性“釣取”目標古DNA片段，再利用共價結合鏈霉親和素的磁珠以生物素識別方式將古DNA片段吸附到磁珠上，然后完成目標古DNA洗脫以進行高通量測序（Orlandoet al.，2021）。

為降低古DNA末端損傷行為對序列信息誤讀的影響，在構建DNA文庫前，一般采用USER酶處理方法，即尿嘧啶-DNA糖基化酶（uracil-DNA-glycosylase，UDG）與核酸內切酶VIII（endonuclease VIII）結合處理古DNA粗提取物，以通過去除尿嘧啶并切割產生的堿基位點的原理達到修復DNA損傷的目的（Burbanoet al.，2010）。然而該方法也存在負面效果，不僅縮短古DNA分子長度，同時其降解的典型特征也會被消除，給后續古DNA真實性驗證帶來難題。通過反應時間和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）參數優化進一步形成的UDG-half方法，不但可去除絕大部分損傷，而且在DNA片段末端保留一個損傷性堿基（尿嘧啶），既有效修復了古DNA末端損傷，同時也為古DNA真實性驗證提供了憑證（Orlandoet al.， 2021）。此外常用于福爾馬林固定石蠟包埋樣本（FFPE）DNA修復的NEBNext FFPE DNA修復酶可有效去除長期存儲樣本線粒體DNA存在的化學損傷，修復后錯誤率從平均1.1%降至0.25%（Gordenet al.，2018）。因此，篩選適用于考古木材細胞中古DNA的修復酶種類以及優化反應時間、化學成分比例等方法參數，將有助于突破考古木材的古DNA末端損傷修復難題。

整體而言，目前針對植物古DNA的相關研究仍較少，2011年雜交捕獲技術首次在玉米內源古DNA富集研究中得到應用（ávila-Arcoset al.，2011），隨后陸續在古代葫蘆皮（Kistleret al.，2014）、亞化石針葉（Schmidet al.，2017）以及沉積物（Schulteet al.，2021）等研究中報道。在木材考古研究領域，古DNA雜交捕獲技術成功實現了古建筑楠屬木材DNA的有效提取，測序深度達27×～1 410×，突破了PCR技術難以實現低含量古DNA擴增和測序的瓶頸（Jiaoet al.，2022）。

4 木材古DNA數據處理和序列分析

以高通量測序為基礎的古DNA分析會產生海量數據，需利用計算機科學和生物學等多學科交叉手段揭示高通量測序數據蘊含的生物學意義。然而，由于古DNA具有含量低、高度片段化、廣泛損傷等典型特征，導致現代DNA數據分析手段和技術參數普遍難以參考和應用（Schuenemannet al.，2013）。

4.1 木材古DNA數據處理與真實性驗證

分析木材古DNA測序數據前，應進行質量檢測、數據處理和真實性評估等。以接頭污染序列、堿基質量分數和未知堿基比例為指標的原始測序序列質控和數據過濾是古DNA質量檢測的關鍵。關于數據處理，通常涉及去除測序接頭和低質量序列、參考基因組比對、重復序列過濾和序列拼接等流程。AdapterRemoval和Samtools等生物分析方法是去除測序接頭、低質量序列和DNA重復拷貝序列的重要手段（Renaudet al.，2014；Schubertet al.，2016）。由于古DNA片段長度短且外源DNA比例高，導致常用于現代DNA拼接的從頭測序拼接（de novoSequence Assembly）方法在古DNA序列拼接中幾乎無法實現（Schuenemannet al.，2013），普遍采用BWA（Burrows-Wheeler Aligner）方法將古DNA短片段序列與參考基因組進行比對和匹配，所有能匹配到參考基因組的內源DNA片段被保留，而外源DNA序列因無法匹配而被舍棄（Liet al.，2010；Langmeadet al.，2012）。同時，DNA損傷模式是古DNA真實性評估的關鍵指標。Jiao等（2022）通過BWA-bactrack算法實現了古建筑楠木樣品DNA短片段（平均長度68～99 bp）的有效拼接，質體基因組測序覆蓋度達90.09%～100%（137 663～152 805 bp）。近年來，隨著BWA、mapDamage及PMDtools等生物信息學方法的不斷完善，對古DNA數據的分析與挖掘研究已邁入新的發展階段，為揭示考古木材DNA數據蘊含的生物學意義提供了新的機遇。

4.2 木材古DNA序列分析

獲得科學可靠的木材古DNA序列后，一般基于系統發育樹、主成分分析、群體遺傳學等手段精準解析序列信息特征，進而通過分子標記方法實現木質文物用材樹種的識別。加拿大動物學家Hebert等（2003）首次提出的DNA條形碼分子標記方法目前已成功應用于生態學調查、瀕危物種監管和保護、中草藥資源與木材識別、法醫鑒定、藥物和食品市場監督等領域（高連明等，2012；周世良等，2015），然而通用DNA條形碼普遍存在因信息位點缺乏導致對親緣關系相近樹種木材識別成功率低的問題（Jiaoet al.，2019）?；蚪M測序技術的發展讓探索具有更高分辨率的分子標記甚至“基因組超級DNA條形碼”成為可能（Liet al.，2015），借助BWA、遺傳距離和單核苷酸多態性等方法可有效解析發生嚴重降解的考古木材DNA序列信息并闡明其種間變異規律，將為木質文物用材“種”的準確識別提供理論依據。

5 木材分子考古主要應用

木材考古研究與應用對象是考古發現的與古代人類生活直接或間接相關的木質遺存。通過考古發掘發現和分析木質遺存，深入挖掘木質文物蘊含的歷史和自然信息，有助于進一步解讀歷史時期森林植被、環境氣候與人類活動間的相互關系。

針對木質遺存的古DNA開展木材分子考古研究，是解讀先民認知與利用森林資源方式的重要途徑。明清時期被冠以“皇木”稱謂的“楠木”，主要用于包括故宮等在內的皇家木結構宮殿營造，成為皇權與地位的象征。然而對《詩經》、《山海經》和《本草綱目》等歷代典籍以及相關木質文物的研究表明，“楠木”的樹種歸屬問題一直存在爭議。通過探究代表性古楠木建筑用材，可為解讀“楠木”樹種歸屬提供新的認知。綜合考古學、形態學、遺傳學和生物信息學分析結果，確定21份故宮古建筑木構件“楠木”樣本均為楠屬木材，其中以楠木（Phoebe zhennan）和細葉楠（Phoebe hui）為主（90.48%），其余為閩楠（Phoebe bournei）和浙江楠（Phoebe chekiangensis）（Jiaoet al.，2022），研究結果為解讀長期存在爭議的“楠木”樹種歸屬范圍提供了新的見解，并為木質遺存的修復和保護提供了關鍵植物學信息。更重要的是，這充分表明在尚未形成系統的植物分類學框架條件下，我國先民亦能通過生產生活的經驗智慧準確認知和掌握木材的類別及主要特性，并對其進行充分利用，體現了當時社會在林業、交通運輸和建筑等方面的高度文明。

木材分子考古是復原歷史時期地域性森林植被類型和物種多樣性的重要方法。隨著考古手段的不斷發展，木質遺存考古發現數量顯著增加。趙燁（2012）采用木材解剖方法解析良渚遺址群中出土木器最豐富的卞家山遺址所在地理區域的木本植被類型，確定當時該區域的森林植被類型以櫟屬、錐屬（Castanopsis）、青岡屬（Cyclobalanopsis）、樟屬（Cinnamomum）等常綠闊葉樹為主，以松屬（Pinus）等針葉樹為輔。木材分子考古學方法則突破了傳統木材解剖學無法實現的“種”水平識別瓶頸，為木質遺存用材的精準識別提供了技術支撐（Wagneret al.，2018；Jiaoet al.，2022）。通過綜合分子考古學、木材解剖學等方法手段，對木質遺存開展大尺度范圍的種屬鑒定，能夠為重構歷史時期地域性木本植物種類提供直接證據。

木材分子考古也是重建古代樹木應對氣候和生境變化微進化反應的重要手段。當前隨時空演變的經典方法普遍依賴于花粉分布模式，但因受花粉百分比參數與周圍植被蓋度非線性關系等局限，區域性森林植被演化情況難以準確反映（李潔等，2013；戴璐等，2017）。而基于遺址考古木材和亞化石遺存的古DNA信息可從新的維度提供科學佐證。通過比較廣泛分布于歐洲地域且大時間跨度（550～9 800年）的167份櫟屬飽水考古木材與現代居群之間葉綠體DNA單倍型的差異，可推測古代樹木應對生境變化的微進化情況（Wagneret al.，2018）。高通量測序表明，來自瑞士和斯洛文尼亞的新石器時代遺址、德國和法國青銅時代遺址以及德國北部和法國北部的中世紀遺址且測序深度＞5×的21個櫟屬考古木材樣本，其葉綠體DNA單倍型與生長在同一地理區域的現代居群常見單倍型相匹配?？紤]到葉綠體DNA基因組有限的進化速率，同時因缺乏細胞核DNA數據信息，單倍型分布范圍內的跨區域流動等情況并不能被完全排除。因此，僅通過葉綠體DNA單倍型信息，仍不足以反映物種居群遺傳結構的形成和演化時間。未來進一步加強對細胞核和葉綠體古DNA數據的篩選和綜合分析，將有助于揭示時空維度下古DNA單倍型的變化規律，闡明古代樹木物種遺傳變異的空間分布模式，并應用于物種居群微進化歷程的追溯和認知。

6 問題與建議

綜上所述，古DNA因高度降解、含量極低和化學損傷特征導致其難于提取和信息解譯仍是當前木材分子考古研究領域亟待突破的關鍵技術瓶頸。建議木材分子考古領域應圍繞古DNA重點開展以下3方面研究：1） 建立考古木材標本庫及其DNA信息數據庫；2） 研究不同時空維度下木材古DNA損傷及變化規律；3） 構建穩定高效的木材古DNA提取及序列信息解譯技術體系。在木材古DNA信息精準解譯的基礎上，通過加強木材分子考古等多學科交叉研究，進一步推動新理論、新方法、新技術在木材學和考古學領域的應用，為木質文物的用材樹種識別、保護利用以及重建歷史時期森林植被、環境氣候與人類活動耦合關系提供重要科學依據。