超聲對豌豆蛋白-高酯果膠復合顆粒理化和結構特性的影響

馬開元，孫曉洋，陳復生，張麗芬*

（1 河南工業大學糧油食品學院 鄭州450001 2 河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院 鄭州 450046）

豌豆蛋白（Pea protein，PP）作為重要的植物蛋白來源之一，因易獲得，營養價值高和低致敏性而被廣泛接受。然而，豌豆蛋白的電荷量較低且表面疏水性較強，降低了其溶解性和乳化性，尤其在豌豆蛋白等電點附近蛋白質容易發生聚集，阻礙了其在食品領域中的應用[1]。例如，豌豆蛋白在植物蛋白飲料中應用時乳化穩定性不佳，體系通常出現失穩現象[2]。研究表明，多糖可以誘導自身與蛋白分子間的相互作用，對加工食品的結構和穩定性中起增稠、穩定、膠凝和乳化的作用[3]。蛋白和多糖復合顆粒具有較好的生物可降解性和兼容性，在提高生物活性成分穩定性和利用度方面發揮著重要作用，是生物活性物質良好的輸送載體[4]。蛋白-多糖復合顆?；橐旱姆€定性較好，在食品乳液體系中具有廣泛的應用前景[5]。高甲氧基果膠（High methoxyl pectin,HMP）是從蘋果中提取的一種天然陰離子多糖，是食品體系中最常用的多糖穩定劑之一，HMP 可與蛋白質發生相互作用，增強蛋白的空間結構并減少其絮凝和沉淀[6]。Tian 等[7]研究發現β-伴大豆球蛋白與果膠通過靜電作用形成的可溶性復合物的粒徑較小，Zeta-電位絕對值較高，使得該復合物具有更高的吸附動力學，可顯著提高蛋白的乳化穩定性。Albano 等[8]研究發現，大豆分離蛋白和果膠起乳化劑和穩定劑的作用，果膠的加入不但可提高液滴表面電荷，而且增加了液滴間的靜電排斥和空間位阻效應，有效防止液滴絮凝和部分聚集，使蛋白乳液穩定性顯著改善。

超聲波因具有快速、有效的改性效果且不損失營養物質以及無毒、無害等優點，受到越來越多科研工作者的青睞[9-10]。研究表明，利用超聲制備蛋白-多糖復合顆粒，可改善復合物的功能性質，超聲波的空化效應可減小復合顆粒的尺寸，使粒徑分布更加均一，使粒子形態更規則[11-12]。本研究以PP 和HMP 分別作為蛋白、多糖基質，利用超聲制備復合顆粒，通過對PP-HMP 復合顆粒乳化特性、濁度、粒徑、多分散性指數（Polydispersity index，PDI）以及結構特征進行分析，揭示超聲作用下復合顆粒理化和結構特性的變化規律，為擴大豌豆蛋白在食品加工中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售豌豆蛋白（蛋白含量為81.2%），雙塔食品貿易有限公司；高酯果膠（酯化度55%～65%），上海Macklin 公司；金龍魚大豆油，益海（周口）糧油工業有限公司；無水乙醇、光譜純級溴化鉀（KBr）、氫氧化鈉（NaOH），天津市科密歐化學試劑有限公司；鹽酸（HCl），洛陽昊華化學試劑有限公司；除標注外，試驗所用試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-IID 型超聲波破碎儀、DC-2030 低溫恒溫槽，寧波新芝生物科技股份有限公司；BT-納米粒度儀（Zeta 電位分析儀），丹東百特儀器有限公司；722S 可見分光光度計，上海儀電公司；FM200 高速剪切分散乳化機，上海弗魯克科技發展有限公司；IRAffinity-1S 傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津株式會社；Cary Eclipse 熒光光譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司；HT7700 透射電子顯微鏡，日立（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 PP-HMP 復合體系的制備 稱取適量的PP 和HMP，分別使用蒸餾水配置成質量濃度為8 mg/mL 的蛋白和果膠溶液，室溫下置于磁力攪拌器勻速攪拌過夜，使顆粒充分溶脹。

將所制備的PP 和HMP 溶液以體積比1∶1 進行混合，攪拌均勻后用0.1 mol/L HCl 和NaOH 溶液調節溶液的pH 值為6.0，然后置于磁力攪拌器上攪拌4 h。

1.3.2 超聲制備PP-US、PP-HMP-US 復合顆粒將PP-US、PP-HMP 混合溶液倒入超聲杯中水浴，超聲探頭浸入液面以下1.5 cm 處，工作時間2 s，間隔時間2 s，使用不同超聲時間、功率密度和溫度處理，超聲后的PP、PP-HMP 表示為PP-US、PP-HMP-US。

1.3.3 理化特性分析

1.3.3.1 乳化活性和乳化穩定性 將5 mL 大豆油和10 mL 樣品溶液在室溫下用高速剪切機以13 000 r/min 的轉速剪切2 min?？焖僭诘撞课?0 μL 樣品，用質量濃度為0.1 g/100 mL 的十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液稀釋200 倍，混勻后立即測定波長500 nm 處的吸光值（A0）。靜置40 min（t）后從底部同一部位吸取樣品，用同樣的方法測定吸光值（A40）[13]。乳化活性（EAI）和乳化穩定性（ESI）分別按式（1）和（2）計算。

式中，EAI——乳化活性指數，m2/g；ESI——乳化穩定性，min；A0——乳液放置0 min 的吸光度；A40——乳液放置40 min 后的吸光度；t——間隔時間，40 min；c——復合顆粒質量濃度，g/mL；φ——油相體積分數，%；T=2.303。

1.3.3.2 濁度的測定 參考Yi 等[14]的方法，采用分光光度法進行樣品的濁度測定。在常溫下用分光光度計于波長600 nm 處測定樣品的吸光度值，每個樣品重復測定3 次。

1.3.3.3 粒徑、PDI 以及Zeta 電位的測定 復合顆粒的粒徑及其分布、PDI 和Zeta 電位使用納米粒度儀進行測定。顆粒分散液用蒸餾水稀釋到適當的濃度后，取適量樣液進行測定。所有測定均在25 ℃下進行，平衡120 s，每個樣品重復測定3 次。

1.3.4 結構特性研究

1.3.4.1 二級結構 參考Feng 等[15]的方法，將PP、PP-US、PP-HMP、PP-HMP-US 溶液進行冷凍干燥，取凍干后的樣品2 mg 左右，與100 mg 烘干后的溴化鉀研磨混勻，然后使用壓片機壓制成薄片，再用傅里葉紅外光譜儀掃描分析，測定時波數范圍為4 000～400 cm-1，掃描次數為32 次，分辨率4 cm-1，得到的紅外吸收曲線采用Peakfit 軟件和Gaussian 擬合，分析蛋白二級結構含量的變化。

1.3.4.2 三級結構 將復合溶液稀釋至合適濃度，使用熒光分光光度計進行測定，固定激發波長λex為280 nm，激發和發射狹縫寬度都為5 nm，掃描范圍為300～500 nm。

1.3.4.3 微觀形態 采用透射電子顯微鏡（TEM）對新鮮制備復合顆粒的表面形貌進行測定。對復合顆粒進行適當稀釋，取一滴樣液加到覆有聚乙烯醇縮甲醛脂膜的銅網上，水平放置2～3 min，用濾紙吸去表面多余溶液，再滴加一滴2%磷鎢酸溶液對顆粒進行負染2 min，然后將銅網在濾紙上放置2 min 使充分染色并吸取多余的染液，置于紅外燈下干燥后用透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.3.5 數據統計分析 每個試驗重復3 次，試驗結果以3 個測量值的平均值 標準差（）表示。采用SPSS Statistics 26.0 軟件Duncan 檢驗法對數值進行差異顯著性分析（P<0.05），采用Origin 8.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 超聲對PP-HMP-US 復合顆粒乳化性的影響

超聲對PP-HMP-US 復合顆粒乳化性的影響如圖1 所示。PP 和超聲豌豆蛋白（PP-US）的乳化穩定性較差。當HMP 溶液加入PP 后，PP 與HMP結合形成可溶性復合物。HMP 的靜電斥力和空間位阻抑制蛋白的聚集，減少絮凝的產生并提高乳化穩定性[18]。與PP-HMP 相比，超聲作用于PPHMP 復合顆粒時，產生的空化效應和微射流使分子結構發生改變，促使吸附在油水界面的蛋白分子增多，并且增強了界面膜的剛性，提高PPHMP-US 的乳化活性[19]。

圖1 超聲對PP-HMP-US 乳化活性和穩定性的影響Fig. 1 Effects of ultrasound on emulsifying activity and stability of PP-HMP-US

隨著超聲時間的延長，PP-HMP-US 復合顆粒的乳化活性先增大后減小，在10 min 時達到最大；隨著超聲溫度和功率密度的增強，PP-HMPUS 復合顆粒的乳化活性在15 ℃和5.43 W/cm3時達到最大后趨于平穩。復合顆粒的乳化穩定性隨著超聲時間、功率密度與溫度的增加出現降低的趨勢。隨著超聲作用的增強HMP 逐漸被降解，產生的靜電斥力和空間位阻效應減弱，影響顆粒運動速度和疏水基團的暴露，導致乳液穩定性降低[16]。

2.2 超聲對PP-HMP-US 復合顆粒理化特性的影響

2.2.1 濁度 圖2 表示超聲對PP-HMP-US 復合顆粒濁度的影響。圖2a 中，PP 和PP-US 均有明顯的相分離現象，濁度較高，放置一段時間后出現沉淀。當HMP 加入后，由于PP 和HMP 之間通過相互作用發生絡合，形成的PP-HMP 復合顆粒表現出較高的穩定性，濁度顯著降低，并且沒有出現相分離現象。超聲作用于PP-HMP 復合顆粒，顯著降低了復合顆粒的濁度。由于超聲處理后非聚集蛋白質的結構改變，獲得了較小復合物顆粒尺寸，有助于增加可用于光散射的表面積，從而降低濁度[20]。

圖2 超聲對PP-HMP-US 濁度的影響Fig. 2 Effects of ultrasound on turbidity of PP-HMP-US

如圖2b 和2c 所示，隨著超聲時間從5 min 延長至35 min，PP-HMP-US 復合顆粒的濁度從0.423 降至0.343，隨著超聲功率密度增大至5.43 W/cm3，復合顆粒的濁度逐漸降低達到最小值后趨于平穩。從圖2d 可知，與其它溫度相比，超聲溫度25 ℃時，復合顆粒濁度較高。

2.2.2 粒徑和PDI 表1 表示了超聲處理對PP和PP-HMP 復合顆粒的粒徑和PDI 的影響，PP 的平均粒徑為（15 702.12±1 465.45）nm，PP 經超聲后的粒徑顯著減小至（4 395.81±214.17）nm，超聲處理對PP 的PDI 無顯著影響。與PP 相比，PP-HMP復合顆粒具有較小的粒徑和較窄的分布，表明HMP 的加入抑制蛋白聚集，并與PP 顆粒形成可溶復合物[15]。超聲處理后，PP-HMP-US 復合顆粒粒徑和PDI 均降低。超聲的空化效應產生的湍流和剪切力破壞顆粒分子間的非共價鍵，打開了水溶液中顆粒內部緊密堆積的結構，導致蛋白質聚集體解離，復合物的粒徑顯著減小[21]。

表1 超聲對PP-HMP-US 粒徑、PDI、Zeta 電位的影響Table 1 Effects of ultrasound on particle size，PDI and Zeta potential of PP-HMP-US

隨著超聲時間的延長，PP-HMP-US 復合顆粒的粒徑和PDI 逐漸減??；在超聲溫度為5～45 ℃范圍內，復合顆粒的粒徑及PDI 沒有顯著變化；超聲功率密度從1.36 W/cm3增加至5.43 W/cm3時，復合顆粒的粒徑顯著減小，分布更加均勻，超聲功率進一步增大，復合顆粒的粒徑和PDI 均增大，說明過高的功率會導致小顆粒聚集，增加復合顆粒在分散體系中的粒徑。因此，超聲作用可以使復合顆粒獲得較小粒徑，且粒徑分布更集中，在水相體系中具有較高穩定性。

2.2.3 Zeta 電位 Zeta 電位的大小表明膠體系統中相鄰粒子之間的靜電吸引或排斥程度，是分散體穩定性的關鍵指標。表1 顯示了超聲對PPHMP-US 復合顆粒Zeta 電位的影響。PP 在超聲處理前、后的Zeta 電位沒有顯著差異；當HMP 加入后，帶負電的HMP 與PP 發生結合形成的靜電復合物帶有更多負電荷，從而使PP-HMP 復合顆粒的電位絕對值增大。PP 與HMP 之間的相互作用提高了分散體的穩定性，改善復合顆粒乳化性能[16]。PP-HMP 復合顆粒經超聲后電位絕對值升高。超聲影響HMP 表面電荷的數量和分布，同時超聲的空化效應可以使PP 分子展開并破壞蛋白質聚集體，從而改變PP 表面的凈電荷[22]，影響PP-HMP-US 的電位絕對值。

超聲處理10 min 時PP-HMP-US 復合顆粒電位絕對值較大為（39.54±2.02）mV，表明短時間超聲可獲得更穩定的分散體系。然而，隨著超聲時間的繼續延長，復合顆粒電位的絕對值逐漸降低。超聲溫度和功率密度分別為15 ℃和4.07 W/cm3時，PP-HMP 電位絕對值較大分別為（33.13±2.37）mV和（35.32±1.10）mV。

2.3 超聲對PP-HMP-US 復合顆粒結構特性的影響

2.3.1 二級結構 圖3 為PP-HMP-US 的FTIR圖譜。與PP 相比，PP-HMP 復合顆粒的光譜中酰胺Ⅱ帶吸收峰出現紅移，并在1 020～1 103 cm-1和1 745 cm-1處出現新的吸收峰，這兩處新的吸收峰是由半乳糖醛酸（GalA）羧基形成的酯鍵（-COOR）在此波段的特異吸收[23]，1 020～1 103 cm-1處吸收峰是由羧基形成的-COOR（C-O）和-COO-伸縮振動引起，是HMP 中的GalA 在指紋區（1 473～1 000 cm-1）的特征吸收峰[24]，與單獨PP 相比，PPHMP 復合顆粒在-OH 伸縮振動區（3 200～3 420 cm-1）的吸收帶藍移（3 294 cm-1到3 279 cm-1），在CH 伸縮振動區（2 700～3 000 cm-1）的吸收帶出現紅移（2 928 cm-1到2 930 cm-1），表明復合顆粒中PP和HMP 之間的相互作用可能與氫鍵的形成和CH 的拉伸有關。從圖譜可以看出，超聲后PPHMP-US 復合顆粒的紅外光譜強度減弱，酰胺Ⅱ帶、酰胺Ⅲ帶吸收峰以及-OH 伸縮振動區域發生輕微紅移，說明氨基酸環境向更加親水的環境轉移[25]。

圖3 超聲前、后PP 和PP-HMP 復合顆粒的傅里葉紅外光譜圖Fig. 3 FTIR spectra of PP and PP-HMP composite particles before and after ultrasound

通過對酰胺I 帶進行傅里葉去卷積結合Gaussian 擬合，得到蛋白質二級結構的定量信息（如表2 所示）。與PP 相比，PP-HMP 復合顆粒的β-轉角和α-螺旋相對含量增大，β-折疊和無規卷曲相對含量減少，表明HMP 能夠抑制PP 的聚集，使PP 的有序結構增加[26]。從表中可以看出，超聲處理使PP-HMP-US 復合顆粒中的β-折疊展開形成α-螺旋，說明超聲的空化作用會導致二級結構相對含量發生變化，而蛋白質的二級結構折疊形成線狀或螺旋螺旋會影響蛋白質的空間構象[27]。超聲時間對復合顆粒的α-螺旋和無規卷曲含量影響不顯著，隨著超聲時間的延長，PP-HMP-US復合顆粒的β-折疊含量減小，β-轉角含量增大，說明長時間的超聲處理會破壞β-折疊片中的氫鍵，使多肽鏈反轉形成β-轉角，進而導致復合顆粒的結構松散，乳化活性和穩定性降低。當超聲功率密度增大至5.43 W/cm3時，PP-HMP-US 復合顆粒β-轉角逐漸向α-螺旋和β-折疊轉變，表明適當的超聲功率密度可促進PP 和HMP 分子間的分子間相互作用，進而增強蛋白質的柔性結構，更易于形成界面吸附，提高復合顆粒的乳化活性。隨著超聲溫度的增大，復合顆粒無規則卷曲的相對含量增多，過高的超聲溫度使復合顆粒形成更多無序的分子結構。2.3.2 三級結構 蛋白質的內源性熒光主要由色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）殘基提供，是蛋白質三級結構變化的重要指標。圖4 顯示了超聲對PP 及PP-HMP 復合顆粒內源熒光光譜的影響。與PP 的內源熒光最大發射波長λmax（335 nm）相比，PP-US的λmax（333 nm）發生藍移，而且熒光強度顯著降低，這可能是由于超聲產生的空化效應導致蛋白質分子暴露的Try 等發色團被猝滅[28]。添加HMP后，PP-HMP 復合顆粒的熒光強度降低且λmax（333 nm）發生藍移，復合物的形成改變了Trp 殘基的微環境，表明PP 和HMP 之間的疏水相互作用參與了復合物的形成，降低了蛋白分子中Try 殘基的暴露程度，使其形成了更緊密的三級構象[29]。超聲處理后，PP-HMP-US 復合顆粒的熒光強度進一步降低，λmax發生紅移，表明超聲影響Try 等發色團的極性微環境，超聲處理時空化泡的瞬間坍塌會造成局部升溫和空化作用，促進PP 和HMP 分子的結合，進一步降低Try 發色基團的暴露程度，導致蛋白的三級結構發生變化[30]。

表2 超聲對PP-HMP-US 二級結構相對含量的影響Table 2 Effects of ultrasound on the relative content of secondary structure of PP-HMP-US

圖4 超聲前、后PP 與PP-HMP 的熒光光譜Fig. 4 Fluorescence spectra of PP and PP-HMP before and after ultrasound

2.3.3 微觀結構 利用TEM 觀察復合顆粒時，PP顯色較深，而親水性多糖HMP 會顯色較淺。從圖5a 和5b 可知，單獨PP（黑色部分）呈現出球狀結構。PP-HMP 復合顆粒如圖5c 所示，黑色部分為PP 內核，淺灰色部分為HMP 外層，而兩者之間交聯的灰色部分可能是由于糖鏈段因其較柔軟和靈活在樣品制備時發生脫水聚集作用[31]。將PP-HMP復合顆粒進一步超聲（圖5d），超聲的空化作用產生了巨大的剪切力和壓強，使得粒子間發生猛烈地撞擊，不斷地撞擊使原先伸展在粒子表面的不規則的蛋白結構發生斷裂[32]，促進HMP 和PP 的結合，HMP 嵌入PP 的球狀結構中，形成了規則有序的類似毛線團的結構。

圖5 PP、P-US、PP-HMP、PP-HMP-US 的透射電鏡圖Fig. 5 Transmission electron micrographs of PP，PP-US，PP-HMP，PP-HMP-US

3 結論

本文以豌豆蛋白和高酯果膠作為蛋白和多糖基質，研究超聲對PP-HMP-US 復合顆粒理化和結構特性的影響。結果表明：PP 顆粒不穩定，HMP可以抑制蛋白聚集，降低PP 的濁度、粒徑和PDI，增大其Zeta-電位絕對值，使PP-HMP 復合顆粒的乳化活性和穩定性顯著增強；超聲作用于復合顆粒，可以增強分子之間的相互作用，使PP-HMPUS 復合顆粒的濁度、粒徑和PDI 顯著降低，Zeta-電位絕對值增大，并在超聲10 min、5.43 W/cm3、15℃時得到較高乳化活性和穩定性。通過對PPHMP 復合顆粒的結構分析，結果發現HMP 的添加使PP 的有序結構增加，超聲使PP-HMP-US 復合顆粒的β-折疊展開形成α-螺旋，同時促進PP和HMP 的結合，使Try 基團的暴露程度降低；而超聲時間過長或溫度過高均會使分子結構變得松散無序，導致復合顆粒乳化活性和穩定性下降。TEM 結果表明，超聲促使HMP 嵌入PP 球狀結構中，形成更加規則有序的結構，研究結果為豌豆蛋白在食品加工中的應用提供理論基礎。