復合溶劑低溫結晶法富集魚油中的棕櫚油酸

尹雪蓮，鄭飛洋，戴志遠，2*

（1 浙江工商大學海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室 杭州 310012）

棕櫚油酸（C16∶1，POA）屬于ω-7 系單不飽和脂肪酸，在?；湹募谆藬档? 個碳原子上有1 個雙鍵，屬于中長鏈脂肪酸，難溶于水，易溶于乙醚、正己烷、甲醇等有機溶劑[1-2]。ω-7 單不飽和脂肪酸作為近些年研究的熱點，已被發現在食品、工業、醫療等方面具有廣闊的前景[3]。POA 作為ω-7 單不飽和脂肪酸的代表之一，其在人體健康方面的有益作用也被逐漸發掘。有試驗表明，POA對2 型糖尿?。═2D）和動脈粥樣硬化性心血管疾病具有一定功效[4]，其次，POA 還可以改善肥胖，調節黑色素生成，減少炎癥因子，提高胰島素敏感性，改善血脂異常，調節脂肪生成和調節全身代謝[5-8]，甚至在代謝的研究前提下被認為是代謝及健康的生物標志[9-10]。POA 可以抑制金黃色葡萄球菌、核梭狀厭氧桿菌以及淋病奈瑟菌的活性，具有殺菌特性[11]。作為多不飽和脂肪酸的前體，研究還發現POA 具有作為生物燃料的潛在可能性[12]。

人在日常飲食中獲取的POA 容易在吸收后被氧化，因此人體需要從外界主動獲取POA 來進行補充[13]。然而，POA 的來源比較稀缺[14]，最常見的分布為深海魚油、澳洲堅果油、沙棘果油以及海洋植物，其中澳洲堅果油和沙棘果油中POA 的含量較高，約為19%～28%[15]。正因如此，我國研究人員大多選用沙棘果油作為富集提純POA 的原料。然而，沙棘的種植受地理位置、氣候和天氣等多種自然條件限制，這些不確定因素也會影響油的質量。作為一種非商業化植物，沙棘主要用來固土防沙，以此來作為富集POA 的原料經濟成本太高，不是最佳選擇[16]。我國是一個臨海大國，漁業資源豐富，漁業副產物常用于提取油脂。因此，以深海魚油為原料提純POA 或更具經濟效益[17]。

棕櫚油酸成本上漲，而市場需求在不斷擴大。在天然來源中POA 含量普遍較低，因此需要尋找更多的途徑，從低成本的原料中富集POA[18]。脂肪酸富集的常用方法有低溫結晶、尿素包合、分子蒸餾、CO2超臨界萃取、酶法以及色譜法[19-21]。結晶分離的依據是不同的脂肪酸熔點不同，而油脂的黏度較高，導致最終分離效果不好，因此可在結晶過程中加入一定的有機溶劑，不同脂肪酸在溶劑中的溶解度不同，最終能實現較好地分離效果[22]。一般來說，脂肪酸在有機溶劑中的溶解度與鏈長和雙鍵數目有關，鏈長越短，雙鍵數目越多，溶解度越大[22]。與其它富集方法相比，低溫結晶法所需溶劑量少，不論是時間成本還是經濟成本都較低，非常適合用來進行POA 的初步提純。在整個反應體系中，溶劑種類、脂肪酸與溶劑的比例、結晶溫度、結晶時間是影響富集效果最主要的因素。在以上基礎上，本研究選用深海魚油作原料，用低溫結晶法富集POA，并探究復合溶劑的作用以及最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳀魚油（乙酯型），浙江海力生集團有限公司；丙酮、甲醇、正己烷、無水乙醇均為分析純級，國藥試劑有限公司；無水硫酸鈉、乙腈均為分析純級，常青化工有限公司。

1.2 設備與儀器

7890B 氣相色譜儀，美國Agilent 公司；RE-3000 旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；HH-2 恒溫水浴鍋，上海奧旗儀器設備有限公司；AL204 電子天平，梅特勒－托利多有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；MSH380-Pro 磁力攪拌器，浙江簡然儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚油脂肪酸組分分析 每個樣品魚油定量為（50±1）mg，分別取至5 mL 具塞試管中，加2 mL 正己烷混勻，加適量無水硫酸鈉吸走殘留水分，取1 mL 用0.22 μL 的有機濾膜過濾到樣品瓶中，進行氣相色譜分析。

色譜條件：HP-88 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.2 μm）；柱箱溫度70 ℃，前進樣口溫度250℃，前檢測器溫度220 ℃；進樣量1 μL；尾吹氣為高純氮氣，燃氣為高純氫氣，助燃氣為空氣。初始溫度為70 ℃，以4 ℃/min 升至220 ℃，穩定20～30 min。

1.3.2 低溫結晶富集 取一定量的魚油與溶劑，室溫下攪拌10 min 使其混合均勻，再將其置于特定溫度下進行結晶，一段時間后取出立即在低溫下完成抽濾使兩相分離，非結晶相50 ℃下真空旋蒸去除溶劑，將得到的脂肪酸用85 ℃以上的熱水多次沖洗至下層澄清。

1.3.3 計算POA 的得率

式中，YPOA——POA 得率，%；m——結晶完成后得到的脂肪酸質量，g；CPOA——結晶完成后所得到的脂肪酸中POA 的含量，%；m0——初始魚油質量，g；C0POA——原料魚油中POA 的含量，%。

2 結果與分析

2.1 原油中的主要脂肪酸及含量

由表1 可以看出，原油中飽和脂肪酸的含量偏高，其中肉豆蔻酸（C14∶0）和棕櫚酸（C16∶0）的含量超過了POA，分別為（20.02±0.04）%和（34.74±0.04）%。氣相色譜法分析脂肪酸含量，飽和脂肪酸總含量為61.80%，不飽和脂肪酸總含量為38.20%。一般來說，單不飽和脂肪酸（MUFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA）比飽和脂肪酸（SFA）的極性大，因此溶解度也更高[23]。在低溫條件下，飽和脂肪酸會因不能溶解在有機溶劑中而被結晶出來，所以用低溫結晶法來富集POA 是可行的。

表1 原油的主要脂肪酸組成Table 1 The main fatty acid composition of crude oil

2.2 低溫結晶法富集魚油中的POA

2.2.1 溶劑種類對富集效果的影響 鄭飛洋等[24]在不加任何有機溶劑的條件下對魚油進行低溫結晶，結果發現在低溫狀態下魚油幾乎全部凝結為固態，后續難以實現固相和液相的分離，這證明了低溫結晶過程中添加有機溶劑的必要性。溶劑的選擇需要考慮溶劑的極性和要富集的目標脂肪酸的極性。根據團隊前期研究及理論基礎[24]，最終選取了乙醇、乙腈、正己烷、甲醇、丙酮、正庚烷、三氯甲烷、石油醚這8 種最常用的和可能有用的有機溶劑，首先進行了單一溶劑種類對富集效果的影響（圖1）。加入溶劑與魚油的質量比為1∶4，結晶溫度為-20 ℃，結晶時間為3 h。

圖1 不同溶劑對POA 含量的影響Fig. 1 Effect of different solvents on POA content

由圖1 可以看出，添加乙腈、甲醇、乙醇、丙酮之后POA 的含量提升較明顯，含量分別為（21.78±1.20）%，（21.64±0.76）%，（17.83±0.44）%，（16.73±0.09）%，這與Zhang 等[25]和Japir 等[23]的研究結果類似。三氯甲烷、正庚烷以及石油醚的效果不明顯，不考慮將其作為復合溶劑種類篩選的對象。在許多富集不飽和脂肪酸的研究中，正己烷是一種良好的溶劑，而在本研究中并未達到理想的效果，在加入正己烷之后POA 的含量僅為（14.26±0.31）%，這可能是因為正己烷的極性過小，不能很好地將魚油中的飽和脂肪酸分離出來[26]。試驗中乙腈和甲醇的富集效果最好，這在一項以甲醇為溶劑分離飽和脂肪酸的研究中可以找到原因[27]，原料油中飽和脂肪酸棕櫚酸（C16∶0）的含量較高，而高飽和脂肪酸在甲醇這類溶劑中的可溶性比相應的不飽和脂肪酸低得多，因此在低溫條件下可形成結晶從而被分離出來，從而實現最終POA 含量的升高。

2.2.2 復合溶劑對富集效果的影響 在第一步溶劑的篩選之后，選出了效果比較明顯的乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、正己烷5 種溶劑來進一步研究復合溶劑對富集效果的影響，最終結果與單一溶劑進行比較。在這5 種溶劑中，丙酮雖常作為低溫結晶的溶劑，但其富集消耗的時間較長，導致富集效率低[28]，并且在上一步中丙酮的富集效果處于中級水平，因此選用丙酮來進行溶劑的混合，其它4種作為變量考察。在魚油與溶劑質量比為1∶4，結晶溫度為-20 ℃，結晶時間為3 h 條件下，丙酮與不同溶劑（乙醇、乙腈、正己烷、甲醇）按體積比1∶4混合，最終POA 的含量及得率如圖2 所示。

圖2 復合溶劑對POA 含量和得率的影響Fig. 2 Effects of compound solvents on POA content and yield

將溶劑換成復合溶劑之后，POA 的含量均發生了變化，總體表現為上升趨勢，其中丙酮-乙腈組、丙酮-乙醇組POA 含量分別達到了（23.84±2.22）%和（18.06±0.19）%，比2.2.1 節中作為單一溶劑加入時分別增長了2.06%和0.23%。丙酮-甲醇組雖然最終得到的POA 含量也較高 【（20.81±0.95）%】，但與作為單一溶劑時的效果差距不明顯，復合溶劑的作用沒有表現出來。雖然丙酮-正己烷組的得率最高，其含量明顯低于其它3 組，這可能與本研究中所要分離的脂肪酸種類有關。綜合兩組結果可知，復合溶劑的富集效果更好，并且復合溶劑還可降低經濟成本。如雍梁敏等[29]曾用丙酮-乙腈來富集橡膠籽油中的α-亞麻酸，使其含量提高了15.20%。試驗最終選擇丙酮與乙腈復配來進行后續操作，而從圖2 可以看出丙酮-乙腈組的得率較低，僅為（30.56±2.84）%，因此還需對復合溶劑的富集工藝進一步優化。

2.2.3 復合溶劑的體積比對富集效果的影響 溶劑的體積比是影響富集的重要因素。兩種溶劑比例的改變會改變復合溶劑的極性，當二者處在一個合適的體積比時，會形成一種亞穩溶液，有利于晶體的形成[30]。在魚油-溶劑質量比為1∶4，結晶溫度為-20 ℃，結晶時間為3 h 的條件下，選擇乙腈與丙酮混合，考察了丙酮與乙腈體積比為1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12 5 種比例對POA 富集含量及得率的影響（圖3）。由圖3 可以看出當丙酮與乙腈體積比為1∶12 時，POA 的含量及得率均最低，分別為（23.24±0.14）%，（23.84±0.14）%。當丙酮與乙腈體積比為1∶4，1∶6，1∶8 時，三者得到的POA 含量無顯著差異（P>0.05），分別為（24.61±1.07）%，（24.83±0.78）%，（24.97±1.59）%。然而，這3 組的得率卻隨乙腈體積占比的增大而下降，分別為（37.86±1.65）%，（31.83±0.99）%，（32.02±2.03）%。原因可能是丙酮在混合溶劑中的比重增加導致溶劑總體的極性下降，一些目標物之外的其它脂肪酸也溶解到混合體系中，最終非結晶相收集到的油重增加，再結合式（1）計算，導致添加丙酮的比例最大時其得率高于其它組。圖3 可以明顯看出，當丙酮與乙腈體積比為1∶10 時，不管是POA 的含量還是得率都顯著優于其它組，分別為（26.45±0.32）%，（33.91±0.41）%。相比原油，POA 的含量共增加了13.48%，并且得率也比使用單一溶劑丙酮時的20%的高得多[31]。因此選擇丙酮與乙腈體積比1∶10 來進行后續研究。

圖3 丙酮-乙腈體積比對POA 含量及得率的影響Fig. 3 Influence of volume ratio of acetone to acetonitrile on POA content and yield

2.2.4 魚油-溶劑質量比對富集效果的影響 魚油與溶劑的質量比是影響體系平衡的重要因素。魚油質量占比增加會導致混合液的黏度增大，導致部分不飽和脂肪酸留在晶體空穴內，無法實現更好的分離[32]；若溶劑質量占比過大，不僅會溶解部分飽和脂肪酸，還導致溶劑的浪費，后續回收也會更加困難[33]。因此需要確定合適的魚油-溶劑質量比進行富集。首先將魚油與溶劑質量比設為1∶2，1 ∶4，1 ∶6，1 ∶8，1 ∶10，丙酮與乙腈體積比為1 ∶10，結晶溫度為-20 ℃，結晶時間為3 h，最終得到的POA 含量及得率如圖4 所示。在魚油-溶劑質量比從1∶2 降至1∶10 的過程中，POA 含量呈先上升后下降的趨勢，而得率則是不斷升高。當魚油-溶劑質量比為1∶2 時，不管是含量還是得率均為最低，分別為（23.47±0.36）%，（12.04±0.19）%。原因為此時油溶比過高，溶液處于過飽和狀態，雖然這有利于晶體的形成，但也導致非結晶相丟失了大量的不飽和脂肪酸[30]。當魚油-溶劑質量比小于1∶6 時，POA 含量下降速率變緩，魚油-溶劑質量比為1 ∶8 和1 ∶10 時POA 的含量分別為（26.00±0.42）%，（25.46±0.70）%。然而，當魚油-溶劑質量比為1∶6 時，POA 的含量最高，為（26.45±0.18）%，此時的得率為（54.26±0.37）%。盡管魚油-溶劑質量比降低對POA 得率提高的效果明顯，但溶劑比例太大會造成溶劑的大量消耗，不適用于大量富集。因此綜合考慮，以含量指標為第一要素選擇魚油-溶劑質量比為1∶6 進行后續研究。

圖4 魚油-溶劑質量比對POA 含量及得率的影響Fig. 4 Influence of mass ratio of fish oil to solvent on POA content and yield

2.2.5 結晶溫度對富集效果的影響 溫度關系著晶體的生長，是低溫結晶過程中的重要參數之一。一般來說，在其它條件不變的情況下，溫度越低，飽和脂肪酸形成結晶的趨勢越強[34]。當溶液處于較低溫度時，體系黏度較小，有利于分子擴散，同時也增加了分子附著到生長晶體表面的可能性[35]。本研究在丙酮-乙腈體積比為1∶10、魚油-溶劑質量比為1 ∶6 的條件下，依次將樣品放在-5，-20，-30，-40，-60 ℃以及-80 ℃溫度下冷凍結晶3 h，考察結晶溫度對POA 含量和得率的影響。如圖5 所示，除-5 ℃外，其它5 組的POA 含量沒有過于明顯的變化。當結晶溫度為-5 ℃時，POA 的含量最低，此時得率最高，含量與得率分別為（21.52±1.39）%，（60.68±3.91）%。這是由于結晶溫度過高，不能使飽和脂肪酸完全結晶，部分飽和脂肪酸在抽濾分離時被帶入非結晶相，導致最終檢測的POA 含量降低。隨著結晶溫度的降低，其它5組的POA 含量分別為（26.46±0.93）%，（26.97±0.42）%，（27.92±0.20）%，（28.67±0.37）%以 及（27.66±0.54）%，得率分別為（41.49±1.67）%，（48.41±0.75）%，（42.95±0.31）%，（22.05±0.28）%以及（21.28±0.42）%。其中當結晶溫度為-60 ℃時，POA 的含量雖最高，但其得率卻很低，并且當溫度再次降低時，得率也再次下降。原因可能是過低的溫度使結晶產生量增大，而結晶為固態，本身具有很高的黏度，導致抽濾分離時一部分濾液被與結晶無法分離，最終導致收集到的濾液過少，從而得率降低。雖然-20，-30 ℃以及-40 ℃時POA 的得率較高，但非結晶相飽和脂肪酸的去除并不徹底?？紤]到-60 ℃條件下得率的降低可能跟魚油的添加量有關，后續做了放大試驗來改善這一點，因此，選擇結晶溫度為-60 ℃繼續研究。

圖5 結晶溫度對POA 含量及得率的影響Fig. 5 Influence of crystallization temperature on POA content and yield

2.2.6 結晶時間對富集效果的影響 考察了3，6，9，12，15 h 這5 個不同時間對富集效果的影響，其中魚油-溶劑質量比為1∶6，丙酮-乙腈體積比為1∶10，結晶溫度為-60 ℃。由圖6 可以看出，結晶時間的變化對POA 含量的影響沒有其它因素明顯。當結晶時間為3 h 時，POA 得率顯著高于其它組，而此時POA 含量最低，含量與得率分別為（28.67±0.42）%及（22.05±0.32）%。當結晶時間過短，溶液難以達到平衡狀態，會導致結晶不能完全析出，也因此最終得到的濾液量較多，這也是3 h條件下POA 得率最高的原因，而這會影響POA的含量，因此后續不將3 h 作為最優條件考慮。結晶過程分為晶核的形成和晶體的生長2 個階段，晶核形成之后，晶體則開始生長，而晶體的生長需要一定的時間，若結晶時間過短則系統很難達到平衡，若結晶時間過長則會導致不飽和脂肪酸也形成結晶[36]。當結晶時間≥6 h 時，POA 得率雖稍有下降，但含量無明顯變化，原因可能是隨著結晶時間的增加，溶劑也發生了部分凍結，由于其包裹了部分不飽和脂肪酸，造成了濾液的損耗，導致得率下降。當結晶時間為6 h 時，POA 的含量最高，為（29.75±0.53）%，此時得率為（15.26±0.27）%。當結晶時間為9 h，12 h 和15 h 時，得率略有下降，分別為（14.95±0.14）%，（14.77±0.09）%，（14.71±0.17）%。綜合考慮，最終選擇結晶時間為6 h。

圖6 結晶時間對POA 含量及得率的影響Fig. 6 Influence of crystallization time on POA content and yield

2.3 放大試驗

為提高低溫結晶的整體得率，在得出最優條件參數后進行了放大試驗，即丙酮-乙腈體積比為1∶10，魚油-溶劑質量比為1∶6，結晶溫度為-60℃，結晶時間為6 h。分別將魚油添加量調整至原來的7 倍和17 倍，最終得到的主要脂肪酸含量如表2 所示?？梢钥闯?，原油中含量較高的C14∶0 和C16∶0 在低溫結晶和放大試驗后含量下降到了很低的水平，這2 種飽和脂肪酸已形成結晶與不飽和脂肪酸分離。同樣含有一個雙鍵的C18∶1 含量也有所上升，其存在限制了POA 含量的進一步增長，這是因為當2 種脂肪酸雙鍵數目接近時，低溫結晶很難將二者分離[37]，可結合其它分離方法提高POA 的含量。由表可以看出，放大試驗并沒有對POA 的含量造成太大影響，并且POA 的得率大大提升。當魚油添加量分別增加7 倍和17 倍時，POA 得率分別為（49.73±3.91）%和（53.66±5.99）%。這是因為試驗過程中大量脂肪酸附著在容器內壁上，造成了不可避免的損耗，而添加量的增大使損耗率大大降低。因此，此工藝對于富集POA 是可行的。

表2 低溫結晶、放大試驗與原油的主要脂肪酸含量對比（%）Table 2 The content of main fatty acids in crude oil and the oil after low-temperature crystallization and scale up experiments（%）

3 結論

本研究用低溫結晶法富集鳀魚油中的POA，在單一溶劑的基礎上增加了復合溶劑的篩選，證明了復合溶劑的效果高于單一溶劑。最終確定了丙酮與乙腈以體積比1∶10 混合，魚油-溶劑質量比為1 ∶6，結晶溫度為-60 ℃，結晶時間為6 h 的最優工藝條件。最終得到了POA 含量為（29.75±0.53）%的混合脂肪酸，得率為（15.26±0.27）%。在此基礎上進行了放大試驗，在不影響POA 含量的前提下將其得率提升至50%左右，魚油的總不飽和脂肪酸含量達79%以上，提示低溫結晶法可有效富集POA，而其對于同樣含有一個雙鍵的其它不飽和脂肪酸不能實現有效地分離，在后續的研究中可結合其它分離方法進一步提高POA 的含量。