蛋白質翻譯后修飾之間的互作關系及其協同調控機理

陳艷梅

（中國農業大學生物學院 植物抗逆高效全國重點實驗室，北京 100193）

蛋白質是由核糖體合成并發揮重要功能的生物大分子。蛋白質在整個生命周期中會經歷多種翻譯后修飾（post-translational modification,PTM），這些修飾影響蛋白質的構象、活性、穩定性、定位和相互作用等［1-2］。據統計，細胞中有約450 種不同的翻譯后修飾，而模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組編碼的蛋白質中，約1 000 個蛋白質會同時被至少兩類不同的翻譯后修飾調控［3-4］。植物細胞中常見的翻譯后修飾，例如，磷酸化（phosphorylation）、泛素化（ubiquitination）、類泛素化（sumoylation）、乙?；╝cetylation）、糖基化（glycosylation）、肉豆蔻?；╩yristoylation）等［1,5］。翻譯后修飾可發生在蛋白質氨基酸的側鏈、C 端或N 末端上，它們通過修飾現有的官能團或引入新的官能團來擴展其分子功能。翻譯后修飾和去修飾是個可逆的過程，通常由一系列特定的酶催化完成，統一命名為“書寫器”（writer）和“擦除器”（eraser）［6］。例如，蛋白激酶（kinase）、泛素連接酶（ubiquitin ligase）和類泛素連接酶（SUMO ligase）具有“書寫器”的功能;而磷酸酶（phosphatase）、泛素酶（ubiquitin protease）和類泛素酶（SUMO protease）具有“擦除器”功能。這類酶有底物特異性，可分別針對底物蛋白的特定氨基酸殘基添加和移除修飾。近年來，植物生物學研究領域探討得較多的翻譯后修飾有蛋白質磷酸化、泛素化和類泛素化。磷酸化是由蛋白激酶催化磷酸基團到底物的特定氨基酸位點,如蘇氨酸（Ser）、絲氨酸（Thr）或酪氨酸（Tyr）殘基上來實現。泛素化是泛素在三類酶（包括E1 泛素激活酶、E2 泛素偶聯酶和E3 泛素連接酶）的依次催化下形成復合體，最終把泛素共價結合到靶蛋白上的過程［7］。類泛素化與泛素化相似，是類似于泛素的蛋白（small ubiquitin-like modifier，SUMO）在一系列酶的催化下共價結合到底物蛋白上的過程。

在細胞中，任意兩個或多個不同翻譯后修飾會發生串擾作用（PTM crosstalk）。翻譯后修飾之間的串擾作用有兩類分子模式：（1）不同修飾通過調控同一個底物蛋白而發生互作關系，這種模式下，有些氨基酸被修飾后會影響同一個氨基酸位點或者相鄰氨基酸的其他修飾，并協同調控所修飾的蛋白質分子功能（圖1-A）；（2）多個具有“書寫器”或者“擦除器”功能的酶依次以對方作為底物，通過添加修飾或去除修飾而改變酶活性，并形成正調控或反饋調節環而發揮功能（圖1-B）［7-9］。

圖1 “磷酸化-泛素化-類泛素化”之間的串擾調控機制Fig.1 Crosstalk and interaction among “Phosphorylationubiquitination-sumoylation”

蛋白質翻譯后修飾之間的這種串擾作用在植物生長發育和應對外界環境脅迫時具有重要的調控功能［7,10-11］，但由于翻譯后修飾具有高度復雜性和動態性等特征，導致解析其分子機制難度較大［12］。目前，植物細胞中關于不同翻譯后修飾之間串擾調控模式的分子機理研究還處于起步階段，本文概述磷酸化、泛素化和類泛素化三類重要的翻譯后修飾之間的協同調控機制以及它們的特征和分子功能。

1 “磷酸化與泛素化修飾”調控模塊

植物細胞中有大量基因編碼蛋白激酶［13］，磷酸酶［14］和泛素連接酶［15］，說明磷酸化和泛素化修飾在植物生長發育中的重要生物學功能，本節分4 部分討論這兩種修飾在細胞中如何發揮協同調控作用。

1.1 磷酸化介導的降解途徑

有些蛋白質被磷酸化修飾后會進一步誘導泛素化作用，并通過順式調控的方式引起底物蛋白降解，這個過程稱之為“磷酸化降解”（phosphodegron）［16］。這個過程通常是由底物蛋白上一個特定磷酸化基序（phospho-motif）作為泛素連接酶的錨定位點，當基序被磷酸化后會誘導泛素連接酶與之結合，并啟動泛素化過程介導的降解作用。例如，擬南芥鐵離子轉運蛋白IRT1（iron-regulated transporter 1）會被磷酸化降解機制調控［17］。研究發現，IRT1 除了轉運鐵離子外，當細胞內其他金屬離子濃度過高時也會轉運外排以避免細胞損害。這種外排機制通常是由IRT1 轉運體蛋白的胞質區一段富含組氨酸的結構結合重金屬離子，從而招募CBL（calcineurin B-like protein）互作激酶CIPK23（CBL-interacting protein kinase 23）來磷酸化附近的幾個絲氨酸和蘇氨酸殘基［17］。IRT1 磷酸化后提供一個E3 泛素連接酶IDF1（IRT1-degradation factor 1）的結合區域，IDF1 泛素化IRT1 的兩個賴氨酸位點，從而誘導IRT1 的胞吞作用并使其降解。后續研究表明，cipk23 突變后植株會大量表達IRT1 并呈現重金屬離子敏感表型，說明CIPK23 介導的磷酸化途徑在“磷酸化-泛素化”信號通路中具有核心調控作用［17］。

E3 連接酶對底物的招募依賴于“磷酸化-去磷酸化”過程。例如，黑暗中生長的植物見光過程中會誘導轉錄因子PIF3（phytochrome-interacting factor3）的多個位點磷酸化，并促進PIF3-EBF1/2與SCF 核心組分結合以形成SCFEBF1/2復合體，再進一步誘導PIF3 的泛素化和降解，從而調控光形態建成［18］。

磷酸化也會抑制E3 泛素連接酶和底物蛋白之間的相互作用，這個過程可稱為“磷酸化抑制的降解途徑”。該過程可被磷酸酶反轉，在磷酸酶的作用下，底物蛋白被去除磷酸化修飾后即會發生泛素化過程。ABA 和赤霉素信號通路中便涉及到這種調控機理。

1.2 磷酸化修飾在E3泛素連接酶及其與底物蛋白互作中的調控作用

E3 泛素連接酶磷酸化后可激活其與底物之間的相互作用。例如，擬南芥14-3-3 蛋白結合E3 連接酶ATL31 后會誘導ATL31 的C 端4 個氨基酸位點依次磷酸化［19］。而且，這兩個蛋白之間的互作對于ATL31 的泛素化及其誘導的14-3-3 蛋白質降解具有決定作用［20］。在高碳低氮條件下，擬南芥ATL31至少有一個氨基酸殘基（如Thr209）會被CIPK 激酶磷酸化［21］。研究還發現，CIPK 介導的這種磷酸化機制會被鈣離子進一步增強，表明鈣信號和碳/氮營養之間存在一定的調控機制［21］。

E3 泛素連接酶的磷酸化也可以弱化其與底物之間的互作。赤霉素信號通路中3 個關鍵調控蛋白涉及到這種調控機制，包括TAGK2 激酶、E3 泛素連接酶GARU（GA receptor ring E3 ubiquitin ligase）和赤霉素受體GID1（GA insensitive dwarf1）［22］。研究發現，酪氨酸激酶抑制劑genistein 能影響TAGK2 激酶介導的GARU 蛋白的酪氨酸磷酸化，并抑制其與底物GID1 的互作［22］。此外，genistein 抑制TAGK2的活性后能顯著提高GID1 的泛素化水平，降低蛋白穩定性，進而降低GID1 誘導的DELLA 蛋白降解機制［22-23］。

1.3 E3泛素連接酶磷酸化后影響其自身的蛋白穩定性

E3 泛素連接酶被磷酸化修飾后會影響自身的穩定性和活性［23-24］。除了泛素化底物蛋白外，E3 泛素連接酶還有自泛素化調控機制。在擬南芥中，植物U-box（PUB）E3 泛素連接酶的磷酸化可阻止其自泛素化過程［23］。MPK3 激酶可被植物病原相關分子模式PAMPs 激活，并磷酸化負調控因子PUB22 的 U-box結構域并降低PUB22 的二聚化過程（dimerization）。由于PUB22 可以通過形成二聚體的形式而降解，磷酸化修飾能提高PUB22 的穩定性。在此基礎上，可通過構建模擬PUB22 磷酸化突變體以提高PUB22 的表達水平和植物的抗病毒性能［23］。因此，E3 泛素連接酶的這種負調控機制在MPK3 介導的免疫應答中具有重要作用。并且，這種串擾調控機制不受底物蛋白的影響，因為U-box 泛素連接酶的底物結合位點不包括U-box 結構域［25］。

ABA 信號通路的調控因子KEG（keep on going）蛋白質既有E3 連接酶結構域又有激酶結構域［26］。有趣的是，磷酸化的KEG 被ABA 刺激后會啟動自泛素化過程并降解［27-28］。把KEG 的激酶結構域突變后不會改變KEG 對底物蛋白的泛素化調控功能，但是ABA 處理后KEG 的降解程度會大幅度下降，暗示激酶結構域的自磷酸化影響了KEG 的自泛素化活性。但需要強調的是，不排除其他激酶在這個過程中也發揮作用［28］。

1.4 蛋白激酶通過泛素化作用途徑調控植物對環境脅迫的應答機理

多數胞外信號是通過膜定位的受體激酶向胞內傳遞，通常情況下，受體激酶一旦被配體激活后會引起其磷酸化和泛素化修飾，進而誘導受體激酶向胞內轉移、翻轉（turn over）或降解并傳遞信號（圖1-C）。研究發現，鞭毛菌受體FLS2（flagellinsensitive2）［29］和油菜素內酯受體BRI1（brassinosteroid insensitive 1）［30］兩個信號通路均被“磷酸化-泛素化修飾”的串擾模式調控。這兩個受體激酶一旦感應到其相應的配體時（flagellin 和BR），FLS2和BRI1 會分別與BAK1 激酶形成復合物并向胞內內吞共同激活下游通路［29-30］。重要的是，FLAGELLIN和油菜素內酯（brassinosteroid，BR）信號都會磷酸化E3 泛素連接酶PUB12/13 的保守氨基酸殘基，進而分別激活PUB12/13 與其相關的受體FLS2 和 BRI1互作，最終導致FLS2 和BRI1 降解。雖然FLS2 和BRI1 對泛素連接酶的招募機理不相同，但是，FLS2和BRI1 的磷酸化調控對于PUB12/13 介導的降解途徑起決定作用［29-30］。

因此，受體激酶磷酸化后會進一步誘導泛素化并通過胞吞途徑向胞內內吞，再進一步激活下游通路，這種調控模式下，受體激酶的磷酸化成為啟動后續降解的標志。除了膜定位受體激酶之外，類似的調控機制也存在于胞質定位的受體激酶和非受體樣激酶中。例如，ABA 信號通路中，當蛋白激酶SnRK2.3 被激活并磷酸化底物蛋白PP2-B11 后，會誘導PP2-B11 通過依賴于泛素化途徑的蛋白質酶體降解，進而調控ABA 信號通路和非生物脅迫應答［31］。

2 “磷酸化和類泛素化修飾”調控模塊

與磷酸化相比，植物細胞中類泛素化修飾沒有那么廣泛和普遍。目前為止，細胞核蛋白的類泛素化分子機理研究得相對透徹［32］。最先報道具有“磷酸化-類泛素化”串擾調控模式的蛋白是油菜素內酯信號通路中的核心轉錄因子CESTA［33］。研究發現，BR 處理植株后會導致CESTA 的第72 位賴氨酸（K72）被SUMO1 和SUMO1 類泛素化修飾，進而誘導CESTA 核移位并激活其轉錄活性。但是，CPK 激酶能通過磷酸化CESTA 來減弱這種類泛素化過程和核移位效應［33］。

“磷酸化-類泛素化”模塊也調控植物免疫應答過程中水楊酸受體蛋白NPR1（nonex-presser of pr genes 1）的活性。研究證明，沒有病原菌入侵時，NPR1 第55 和59 位絲氨酸殘基的磷酸化會抑制NPR1 的類泛素化作用，并使其保持穩態［34］。當植物感染病原菌后，水楊酸會激活蛋白激酶SnRK2.8并磷酸化NPR1 的兩個氨基酸殘基（Ser589 和Thr373），導致NPR1 從細胞質轉移到細胞核［35］。在細胞核里，NPR1 被SUMO3 類泛素化修飾后抑制NPR1 與轉錄抑制因子的結合，游離的NPR1 能結合轉錄啟動因子并激活脅迫相關基因的表達，一旦激活免疫反應后，依賴于磷酸化修飾的類泛素化會誘導NPR1 蛋白降解［34］。此外，NPR1 另外兩個絲氨酸殘基（Ser15 和 Ser11）的磷酸化過程依賴于NPR1的類泛素化修飾；反之，它們磷酸化后會進一步增強NPR1 的類泛素化程度［34］。近期的研究報道表明，蕪菁花葉病毒（TuMV）能阻止NPR1 與SUMO3 的相互作用及類泛素化修飾，并導致后續在Ser11/15 位點的磷酸化過程不能進行，從而抑制水楊酸介導的植物抗病毒信號通路［11］。

除了NPR1 以外，“磷酸化-類泛素化”模塊也調控植物免疫反應中的其他信號分子。研究報道，在免疫應答過程中，有多個MAPK 激酶的底物蛋白會被類泛素化修飾，包括轉錄因子WRKY、EIN3、EIL1 和組蛋白去甲基化酶HDA19 等［36］。雖然目前不明確這些蛋白是否受“磷酸化-類泛素化修飾”串擾模式所直接調控，但這些發現說明植物免疫應答通路中存在這兩種修飾的復雜調控機制。

這些研究說明，同一類翻譯后修飾在不同氨基酸位點具有不同的分子調控功能（site-specific regulation）。而且，蛋白質的多種翻譯后修飾之間的串擾調控模式會激發胞內信號的級聯反應，包括蛋白質的激活、翻轉等一系列過程，雖然動態但能保持嚴謹又精確的調控。

3 “泛素化-類泛素化修飾”調控模塊

“泛素化和類泛素化修飾”之間可以相互拮抗或協同調控［37］。雖然這兩種修飾都涉及到E1-E2-E3信號傳遞途徑，但其分子調控模式卻不一樣，而且，泛素化和類泛素化修飾會競爭同一個賴氨酸位點。早期的研究發現，在鹽脅迫時，DELLA 蛋白RGA（repressor of GA）的第65 位賴氨酸殘基（K65）類泛素化后會促進該蛋白質的表達［38］。該位點突變成精氨酸后RGA 的表達水平保持不變，進一步的研究表明，RGA 的賴氨酸位點K65 由“類泛素化和泛素化”兩種修飾共同調控，并且，類泛素化修飾后能保護RGA 免受赤霉素介導的泛素化途徑降解。Guo等［39］發現類泛素化和泛素化修飾會競爭蛋白激酶RACK1B 的4 個賴氨酸（Lys50,Lys276,Lys281 和Lys291），而且這4 個賴氨酸的類泛素化作用會增強RACK1B 對ABA 介導的泛素化降解作用。

盡管泛素化和類泛素化作用機制不一樣，在有些情況下，類泛素化修飾會誘導蛋白質通過泛素化途徑降解。E3 類泛素連接酶STUbL 含有類泛素化結合基序（SUMO-interacting motif），能識別并與被類泛素化修飾的蛋白結合，從而誘導未發生修飾的賴氨酸殘基通過泛素化途徑降解［40］。蛋白質組實驗也證實類泛素化狀態可被泛素化改變［41］。而且，被多個類泛素化修飾的蛋白質氨基酸側鏈也會同時被泛素化修飾［42］，這種修飾的蛋白能直接介導底物通過蛋白質酶體降解［40］。使用SUMO1、SUMO2和SUMO3 作為誘餌通過酵母雙雜交實驗研究互作也發現，有6 個STUbL 的同源蛋白與誘餌互作；其中，STUbL4 通過與CONSTANS 基因的轉錄抑制因子CDF2 互作來調控開花過程［43］。進一步的研究證明，CDF2 被SUMO1 類泛素化修飾，并且，過表達STUbL4 會降低CDF2 的表達量［43-44］。這些研究表明，植物細胞中也存在SUMO 介導的降解途徑。

“泛素化和類泛素化修飾”之間會相互影響對方的生物學活性。研究發現，植物在黑暗環境生長時，E3 類泛素連接酶SIZ1 能通過類泛素化過程修飾植物光形態建成抑制因子COP1（constitutive photomorphogenic1，COP1）并增強COP1 的活性，使其進一步泛素化靶基因（如HY5）從而負調控光形態建成［45］。COP1 也會反向誘導SIZ1 的泛素化并使其通過蛋白質酶體途徑降解。然后，COP1-SIZ1通過“泛素化和類泛素化”的正調控與負反饋調控模式相結合發揮功能，以保障植物的光形態建成。

4 “磷酸化-泛素化-類泛素化”調控模塊

磷酸化、泛素化和類泛素化這3 種修飾可協同調控信號通路。這種調控模式最早報道于動物細胞中，三類修飾協同調控基因毒性脅迫應答機理并誘導NEMO 蛋白的激酶亞基的核定位等過程［46］。植物中也有類似的調控機理，正如我們前面描述過，磷酸化、類泛素化和泛素化修飾影響NPR1 的功能和穩定性［34］。此外，這3 種修飾也調控光信號中PHYB-PIF 通路，研究發現，PHYB 蛋白的C-末端類泛素化修飾后能抑制其后續的磷酸化信號通路以及對PIF5 的泛素化修飾，從而減弱PHYB 和PIF 之間的互作［47］。然而，紅光和白光會增加PHYB 的類泛素化程度，點突變研究揭示 PHYB 的SUMO 化靶點K996 突變后會導致植物呈現紅光敏感表型，說明該位點的類泛素化修飾在光信號通路中具有調控作用［47］。

這3 種修飾的共調控模式也存在于能量代謝的感受器——SnRK1 激酶的信號通路中。SnRK1 的激活依賴于T-loop 區的蘇氨酸磷酸化，該位點的磷酸化會誘導E3 類泛素連接酶SIZ1 通過類泛素化過程作用于SnRK1 的多個亞基，導致SnRK1 降解并抑制其下游信號的傳遞［48］。該研究說明SnRK1 通過磷酸化過程誘導的類泛素化修飾和后續的降解途徑而發揮功能，并以負反饋調控的模式來減弱不良信號向下游的繼續傳遞；同時也揭示了“磷酸化、類泛素化和泛素化”這3 種修飾環環相扣的調控模式在植物應對環境脅迫過程中的關鍵調控作用。

此外，SnRK1 通過磷酸化途徑調控硝酸還原酶的活性［49］，被磷酸化修飾后的硝酸還原酶會進一步與14-3-3 蛋白結合而失去酶活性［50］。研究報道，SIZ1 可通過類泛素化過程增強硝酸還原酶的活性。也有證據表明硝酸還原酶是通過依賴于泛素化的蛋白質酶體途徑降解［49］。這些研究進一步說明了“磷酸化-泛素化-類泛素化”在細胞內瞬時而又動態的分子作用模式。

5 結論與展望

蛋白質信息由遺傳密碼編碼，而翻譯后修飾能使蛋白質的分子功能更加多樣化。近年來，植物中關于翻譯后修飾的調控機理研究越來越深入，但目前的報道很少關注到不同修飾之間的聯系和相互作用。事實上，很多植物生理或代謝過程都涉及到多類修飾的共調控，不同翻譯后修飾能快速而精確地把胞外信號激活、感知、整合并傳遞到下游通路上。本文綜述了磷酸化、泛素化和類泛素化三類重要修飾的特征、協同調控機理和互作關系。這三類修飾可發生在同一個蛋白上，并且它們之間會相互影響和調控對方的功能與活性。然而，目前關于這個領域的研究還不夠深入，還有很多未知的分子機制有待探討，包括：（1）很多激酶或者類/泛素連接酶的底物還不明確；（2）類泛素連接酶（如E3 SUMO ligase）也有磷酸化修飾［51-52］，但關于這些磷酸化的分子功能和調控機制尚不清楚；（3）在“泛素化-類泛素化修飾”模塊中，蛋白質酶體如何在復雜而又相似的信號模式中識別并降解底物？（4）現有的報道大多數集中于“書寫器”的分子功能研究領域，而關于“擦除器”的基因調控功能探討較少。

質譜技術能對多種翻譯后修飾進行精確的定量和定性分析，并且已取得了很大成就［53-54］。但翻譯后修飾在細胞內的化學計量較低（也即被修飾的蛋白質所占比例相對較低）；其次，翻譯后修飾在不同環境下均處于快速動態變化的狀態（如磷酸化狀態數秒之內就能發生改變），導致大規模研究分析不同修飾之間的串擾調控機理依然有很大的技術難度。未來的研究應結合生化、遺傳、結構生物學和單細胞生物學等多種技術手段進行更系統的探索。