利用CRISPR/Cas9 技術構建Quaking 敲除的小鼠胚胎成纖維細胞株

高登科 馬白榮 郭怡瑩 劉薇 劉田 靳亞平 江舟陳華濤

（1.西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100；2.西北農林科技大學 農業農村部動物生物技術重點實驗室，楊凌 712100；3.四川大學國家衛生健康委員會時間生物學重點實驗室，成都 610000）

Quaking（QKI）蛋白屬于進化保守的含有核不均一核糖核酸蛋白K 同源結構域（K homology，KH）的RNA 結合蛋白STAR（single transduction and activation of RNA，STAR）家族成員，因Quaking 基因缺失導致中樞和外周神經系統出現神經髓鞘發育障礙的現象，小鼠機體表現為顫抖，故將引起此現象的基因命名為Quaking［1］。QKI 的3 種亞型QKI-5、QKI-6 和QKI-7 擁有相同的KH 結構域，主要區別在于C 端的30 個氨基酸不同［2］。QKI-5 中包含一個核定位信號，可以在細胞核和細胞質之間穿梭，主要在細胞核中表達；QKI-6 可以在細胞核和細胞質中表達，而QKI-7 主要分布在細胞質中［3］。

QKI 是影響RNA 調控的關鍵調節因子，其能與RNA 特異性結合，在pre-mRNA 的剪接、microRNA的調控與環狀RNA 的形成等方面發揮重要作用［4］。QKI 可作為一種腫瘤抑制因子抑制腫瘤的發生。有研究發現，QKI-5 在良性前列腺增生組織中高表達，而在癌組織中低表達，并且QKI-5 可有效抑制前列腺癌細胞的增殖［5］。同時，有研究發現在乳腺癌細胞中QKI-5 的高表達可抑制癌細胞增殖［6］。此外，特異性過表達QKI-5 能抑制卵巢癌細胞A2780的增殖，并促進癌細胞發生凋亡［7］。在免疫調控中，QKI 是參與單核細胞或巨噬細胞分化和功能調節的關鍵因子。QKI 通過調節Ahr/STAT1-NF-κB 途徑，在抑制先天免疫反應方面發揮重要作用［8］。在神經系統中，QKI-5、QKI-6 與QKI-7 蛋白在髓鞘形成細胞和星形膠質細胞中均有顯著表達；QKI 作為髓鞘形成的調節因子，是髓鞘形成的關鍵蛋白［9］。QKI 作為一種RNA 結合蛋白，是少突膠質細胞中核mRNA 輸出的調節因子，并參與了髓鞘形成［10］。QKI 在血管發育中起著至關重要的作用，Quaking 突變導致的血管缺陷會引起胚胎死亡［11］。QKI 也是血管生成的正調節因子，其細胞作用是調節內臟的內胚層功能，包括維甲酸的局部合成以及隨后控制內皮細胞增殖、基質產生和內臟內胚層存活，這對于血管重塑至關重要［12］。有研究證據表明，QKI 可能通過參與維持肌衛星細胞的儲備，促進肌肉細胞進入靜息期，抑制小鼠成肌細胞的分化［13］。綜上所述，Quaking 基因編碼的RNA 結合蛋白QKI 在癌癥發生、免疫調控、髓鞘形成、血管生成和肌肉發育等生理過程中發揮重要作用，然而QKI 在小鼠胚胎成纖維細胞（NIH3T3）中的生物學功能目前尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性核酸內切酶FastDigest Esp3I、TurboFect轉染試劑、Donkey anti-Rabbit IgG（H+L）Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody（Alexa Fluor 488）均購于美國Thermo Fisher 公司；T4 DNA Ligase 購于日本TaKaRa 公司；DH5α 感受態細胞購自北京天根生化科技有限公司；HEK293T 細胞和NIH3T3 細胞購買于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；胎牛血清購自美國Gibco 公司；DMEM 高糖培養基購自Hyclone 公司；胰蛋白酶消化液、嘌呤霉素、Polybrene、RIPA 裂解液、DAPI 染色液均購于碧云天公司；pcDNA3.1-Quaking 過表達質粒為實驗室保存［14］；LentiCRISPRv2 載體、輔助質 粒psPAX2 和pMD2.G 質粒由西北農林科技大學動物醫學院蕭颯教授饋贈；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；脫脂奶粉購于美國BD 公司；HRP 共軛山羊抗兔抗體購于中國中杉金橋公司；兔抗GAPDH 抗體購于武漢三鷹生物技術有限公司；兔抗QKI 抗體購于博士德生物工程有限公司；ECL化學發光液購自北京迪寧生物科技有限公司；Trition X-100、BSA 試劑均購于Sigma 公司；CCK8 試劑購于米鼠生物公司。

1.2 方法

1.2.1 設計并合成sgRNA 在NCBI 數據庫中獲取小鼠Quaking 基因的基因組序列信息；利用CRISPR在線設計網站（http://crispor.tefor.net/）提交Quaking基因的外顯子核苷酸序列，選取系統自動生成的評分最優的2 組sgRNA，分別命名為sgRNA1、sgRNA2；選擇Cas9 質粒中所需的慢病毒載體LentiCRISPRv2，生成含有Esp3I 酶切位點的sgRNA序列［15］，交由西安擎科澤西生物有限公司合成，設計的序列信息見表1。

表1 序列信息Table 1 Sequences information

1.2.2 構建sgRNA 敲除載體 將互補的sgRNA寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈。使用限制性核酸內切酶Esp3I 酶切慢病毒載體LentiCRISPRv2，以獲得線性化載體。sgRNA 退火產物與線性化載體LentiCRISPRv2 使用T4 DNA Ligase 連接過夜。隨后將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α 感受態細胞中，取適量培養后的轉化體系菌液涂布平板觀察菌落生長狀況，挑取單克隆菌落培養16 h。培養后的菌液提取質粒并送西安擎科澤西生物有限公司進行測序，將測序驗證正確的重組質粒命名為LentiCRISPRv2-sgRNA1、LentiCRISPRv2-sgRNA2。

1.2.3 篩選敲除效率高的重組慢病毒質粒 HEK-293T 細胞用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基培養，細胞密度達到70%-80%時，利用TurboFect轉染試劑進行轉染。轉染4 組，轉染質粒分別為：pcDNA3.1-Quaking；pcDNA3.1-Quaking+LentiCRISPRv2；pcDNA3.1-Quaking+LentiCRISPRv2-sgRNA1；pcDNA3.1-Quaking+LentiCRISPRv2-sgRNA2。在37℃培養箱培養48 h 后收集細胞樣品，Western blot 檢測QKI 蛋白的敲除效率，以篩選獲得敲除效率高的重組慢病毒質粒。

1.2.4 嘌呤霉素最低致死濃度篩選 NIH3T3 細胞用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基培養，選擇生長狀況良好的NIH3T3 細胞，經胰蛋白酶消化后加入等體積含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基終止消化，計數后調整細胞懸液濃度至5 × 104個/mL，96 孔板中每孔加100 μL 細胞懸液，待細胞貼壁后加入0-5 μg/mL 不同梯度濃度的嘌呤霉素，每0.5 μg/mL 設置一個濃度梯度，每個濃度設置6 個重復。觀察細胞狀態，將加藥后48 h 內細胞全部死亡的最小濃度作為NIH3T3 細胞的嘌呤霉素最低致死濃度，此濃度用于后續陽性克隆細胞株的篩選。

1.2.5 慢病毒包裝及轉導NIH3T3 細胞 將HEK293T 細胞鋪板于6 孔細胞培養板，待細胞生長至密度為70%-80%時，把篩選獲得的敲除效率高的重組慢病毒質粒和輔助質粒psPAX2、pMD2.G 按照一定比例（2∶1∶1）共轉染至HEK293T 細胞。轉染16 h 后，將培養液更換為新的含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基，繼續培養48 h 后收集細胞上清液，3 000 r/min 離心5 min 取上清即為病毒原液，0.45 μm 濾器過濾、分裝后置于-80℃保存備用。提前1 d 鋪好狀態良好的NIH3T3 細胞，將收集的慢病毒液與1 mL 無血清DMEM 高糖培養基混勻，并加入終濃度為10 μg/mL 的Polybrene 以提高感染效率。棄去舊培養基，用PBS 清洗一遍后加入毒液，感染48 h 后加入嘌呤霉素進行抗性單克隆細胞的篩選，將單克隆細胞擴大培養后，收取細胞樣品提取基因組DNA，使用表1 中的Target 引物進行PCR 擴增后測序鑒定并比對結果，隨后采用Western blot 對單克隆細胞株中QKI 蛋白的表達進行檢測。

1.2.6 Western blot 檢測 將收集到的細胞樣品按照RIPA 裂解液操作說明處理得到蛋白樣品，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。上樣等質量的變性后的蛋白樣本進行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結束后將蛋白轉印至PVDF 膜上，使用10%的脫脂奶粉封閉2 h。封閉完成后，TBST 洗膜3 次/5 min，分別用兔抗QKI 抗體（1∶1 000 稀釋）和兔抗GAPDH 抗體（1∶5 000 稀釋）4℃搖床孵育過夜，TBST 洗膜3 次/5 min，再加入HRP 標記的山羊抗兔二抗（1∶5 000 稀釋）中，室溫搖床孵育2 h，TBST 洗膜3 次/5 min，之后將膜放入ECL 化學發光液中作用2 min，凝膠成像系統曝光并分析結果。

1.2.7 免疫熒光染色觀察QKI 蛋白的表達分布 使用4%多聚甲醛固定Quaking 基因敲除NIH3T3 細胞樣品及對照組細胞樣品，PBS 清洗后再用0.1%Trition X-100 對細胞進行通透處理；處理后的細胞加入1% BSA 進行封閉，隨后使用QKI 抗體（1∶100稀釋）進行過夜孵育，次日PBS 清洗后再加入綠色熒光標記的Donkey anti-Rabbit IgG（H+L）Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody（Alexa Fluor 488，1∶1 000 稀釋）孵育。孵育結束后，使用DAPI 對細胞進行染核，PBS 清洗后封片并在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

做好雨污分流，有利于減少污水產生量，降低運營成本，有利于降低垃圾堆體含水率，減少臭氣產生量，提高堆體穩定性，是實現生活垃圾衛生填埋的關鍵所在。

1.2.8 細胞增殖試驗 將生長狀態良好的Quaking基因敲除NIH3T3 細胞及對照組細胞分別以2 × 103個/孔的密度接種于96 孔板，分別于第1、2、3、4、5、6、7 天加入10 μL CCK8 試劑，繼續在37℃培養箱培養2 h 后使用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度值，每組6 個復孔，統計結果并繪制細胞生長曲線。使用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計學分析，數據以平均值±標準誤表示，兩組間樣本采用雙因素方差分析，*P ＜ 0.05 表示差異有統計學意義，**P ＜ 0.01表示差異顯著，***P ＜ 0.001 表示差異極顯著。

2 結果

2.1 Quaking基因sgRNA靶點序列的設計

將NCBI 數據庫中獲取的小鼠Quaking 基因的基因組序列導入SnapGene 軟件繪制基因序列圖譜，利用CRISPR 在線設計網站分別在Quaking 基因的第1、2 外顯子區域設計sgRNA。選擇第1、2 外顯子分別作為兩個敲除位點，對應sgRNA2 和sgRNA1（圖1）。

圖1 小鼠Quaking 基因的sgRNA 設計圖Fig.1 sgRNA design of Quaking gene in mice

2.2 重組質粒LentiCRISPRv2-sgRNA的構建與鑒定

使用限制性核酸內切酶Esp3I 酶切線性化LentiCRISPRv2 空載體，由于LentiCRISPRv2 載體上存在2 個Esp3I 酶切位點，故Esp3I 酶切后可獲得兩個條帶。如圖2-A 所示，Esp3I 酶切后成功獲得與預期大小相符的兩個條帶（12 984 bp 和1 899 bp）。隨后，利用T4 DNA Ligase 將兩對sgRNA 退火產物分別與酶切線性化的LentiCRISPRv2 空載體連接構成LentiCRISPRv2-sgRNA1 和LentiCRISPRv2-sgRNA2重組質粒。將兩個重組質粒進行測序，測序結果顯示靶向Quaking 基因的sgRNA1 和sgRNA2 已經成功插入到LentiCRISPRv2 載體（圖2-B），上述結果表明成功構建重組質粒LentiCRISPRv2-sgRNA1 和LentiCRISPRv2-sgRNA2。

圖2 重組質粒的構建與鑒定結果Fig.2 Construction and identification of recombinant plasmids

2.3 篩選QKI蛋白敲除效率高的重組質粒

復蘇并傳代培養HEK293T 細胞，將重組質粒LentiCRISPRv2-sgRNA1 和LentiCRISPRv2-sgRNA2分別與pcDNA3.1-Quaking 質粒共轉染至HEK293T細胞中，并以未轉染的空白細胞作為對照組。轉染后48 h 收取細胞蛋白樣品，用于Western blot檢測，以篩選敲除效率高的重組質粒。如圖3 所示，第4 泳道的LentiCRISPRv2-sgRNA1 的敲除效率高于第5 泳道的LentiCRISPRv2-sgRNA2，故選擇LentiCRISPRv2-sgRNA1 重組質粒用于后續試驗。

圖3 Western blot 篩選QKI 蛋白敲除效率高的重組質粒Fig.3 Screening of recombinant plasmids with high QKI protein knockout efficiency via Western blot

2.4 NIH3T3細胞嘌呤霉素最低致死濃度篩選

為了獲得慢病毒轉導后經藥物篩選的陽性細胞，設置不同梯度濃度的嘌呤霉素，將它們分別加入狀態良好的NIH3T3 細胞中，觀察細胞的存活狀態并進行記錄，最終獲得48 h 內使NIH3T3 細胞全部死亡的最低嘌呤濃度為1.5 μg/mL，后續使用該濃度進行單細胞克隆的篩選。

2.5 Quaking基因敲除的NIH3T3細胞株的建立

將敲除效率高的LentiCRISPRv2-sgRNA1 重組質粒與輔助包裝質粒psPAX2、pMD2.G 共轉染至HEK293T 細胞中進行慢病毒包裝。使用包裝好的慢病毒毒液感染NIH3T3 細胞，感染48 h 后加入濃度為1.5 μg/mL 的嘌呤霉素以篩選陽性細胞。將篩選后的陽性單克隆細胞擴大培養后，提取單克隆細胞的基因組DNA 并PCR 擴增靶位點附近序列。測序結果如圖4 所示，與野生型細胞株相比，單克隆細胞株在sgRNA 序列中缺失了7 個堿基造成移碼突變，表明成功建立Quaking 基因敲除的NIH3T3 細胞株。在普通光學顯微鏡下觀察細胞形態發現，Quaking 基因敲除的NIH3T3 細胞與正常對照組細胞形態無差異（圖5）。

圖4 Quaking 敲除細胞株與野生型細胞株測序結果比對示意圖Fig.4 Schematic diagram of comparison between sequencing results of Quaking knockout cell lines and wildtype cell lines

圖5 NIH3T3 細胞形態圖Fig.5 Morphology of NIH3T3 cells

2.6 Western blot檢測Quaking基因敲除細胞株中QKI蛋白的表達情況

使用Western blot 檢測小鼠Quaking 基因敲除細胞株中QKI 蛋白的表達，結果如圖6 所示，與對照組相比，Quaking 基因敲除細胞株中未檢測到QKI蛋白的表達，進一步從蛋白水平證明Quaking 基因敲除的NIH3T3 細胞株構建成功。

圖6 Western blot 檢測QKI 蛋白表達Fig.6 Detection of QKI protein expression via Western blot

2.7 免疫熒光染色觀察Quaking基因敲除細胞株中QKI蛋白的表達分布

利用免疫熒光染色技術觀察Quaking 基因敲除NIH3T3 細胞株中QKI 蛋白的表達分布，結果如圖7所示，對照組NIH3T3 細胞中QKI 蛋白主要表達在細胞核中，而Quaking 敲除的NIH3T3 細胞中未見綠色熒光，即無QKI 蛋白的表達，這些結果進一步證明Quaking 基因敲除的NIH3T3 細胞株構建成功。

圖7 免疫熒光染色檢測QKI 蛋白表達Fig.7 QKI protein expression detected by immunofluorescence staining

2.8 Quaking敲除抑制NIH3T3細胞的增殖能力

為了探討QKI 蛋白的敲除對NIH3T3 細胞增殖的影響，采用CCK8 對生長狀態良好的Quaking 基因敲除的NIH3T3 細胞及對照組細胞的增殖活力進行測定。結果如圖8 所示，Quaking 基因敲除細胞株的增殖活力較對照組細胞極顯著降低（P ＜ 0.001），但在第7 天時兩組細胞的增殖活力趨于一致。

圖8 Quaking 基因敲除對NIH3T3 細胞增殖能力的影響Fig.8 Effects of Quaking gene knockout on the proliferation ability of NIH3T3 cells

3 討論

CRISPR/Cas9 基因編輯技術作為一種可在全基因組范圍進行高通量篩選的新型基因編輯技術，具有操作簡單、成本低、高效性和低脫靶率的優點，可實現對基因組的精準修飾［16］。自2013 年CRISPR/Cas9 基因編輯技術在人類細胞中得到驗證以來［17-19］，sgRNA 引導的CRISPR/Cas9 系統已應用于多種細胞系和生物體的DNA 和RNA 操作中，并在疾病免疫機理、藥物靶點篩選和動物遺傳育種等領域獲得廣泛應用［17,20-21］。在可用于精確基因治療的工具中，CRISPR/Cas9 系統與鋅指核酸酶（zincfinger nucleases，ZFNs）或轉錄激活因子樣效應物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）等傳統的基因編輯工具相比更簡單、更省時，因為該系統只需要一個Cas9 核酸內切酶和一個短的sgRNA［22］。慢病毒是一種逆轉錄病毒，它可將大量的病毒互補DNA 整合到宿主細胞的基因組中，并且可以有效地感染分裂期及非分裂期細胞，是最有效的基因傳遞方法之一［23-24］。因此，本研究選擇同時包含有CRISPR/Cas9 系統和慢病毒載體篩選系統的LentiCRISPRv2 質粒進行敲除細胞株的構建。

盡管CRISPR/Cas9 技術日益成熟，但其安全性和效率仍然是需要重點考慮的問題［25］。sgRNA 往往具有相對較高的錯配耐受性，Cas9 通常會切割與靶基因序列相似的脫靶位點，這就造成了CRISPR/Cas9 系統的實際應用一直受到脫靶效應的影響［26-27］。為了最大程度降低脫靶效應的影響，同時提高靶基因sgRNA 的特異性，本研究利用CRISPR在線設計網站（http://crispor.tefor.net/）設計獲得了兩個評分最優的分別靶向Quaking 基因第1、2外顯子區域的sgRNA。為進一步篩選得到敲除效率更高的sgRNA，本研究首先在更容易轉染的HEK293T 細胞系中進行了預實驗。在HEK293T 細胞中外源性過表達小鼠QKI 蛋白的同時分別共轉染LentiCRISPRv2-sgRNA1 和LentiCRISPRv2-sgRNA2重組質粒，Western blot 檢測發現LentiCRISPRv2-sgRNA1 組較LentiCRISPRv2-sgRNA2 組QKI 蛋白的敲除效率更高。隨后使用LentiCRISPRv2-sgRNA1 重組質粒進行慢病毒包裝，感染NIH3T3 細胞后，經嘌呤霉素篩選獲得陽性單克隆細胞，對擴大培養的細胞進行Western blot、免疫熒光染色和測序鑒定，結果均證明成功構建了小鼠Quaking 基因敲除NIH3T3 細胞模型。

RNA 結合蛋白QKI 在心臟、肺臟、腦、視網膜、前列腺、睪丸等多種器官中廣泛表達，在調控RNA形成與信號轉導等過程中發揮重要功能［4］。QKI 與細胞增殖密切相關，其能有效抑制前列腺癌和肺癌細胞的增殖［5,28］，過表達QKI 還可以抑制乳腺癌和卵巢癌細胞的增殖［6-7］。另有研究報道QKI 可以促進血管內皮細胞、睪丸支持細胞的增殖［12,29］，過表達QKI 也能促進成肌細胞的增殖［30］。本研究對Quaking 敲除的NIH3T3 細胞株及對照組細胞進行了CCK8 實驗，結果顯示Quaking 基因的敲除抑制了NIH3T3 細胞的增殖能力，即QKI 的存在可以促進NIH3T3 細胞的增殖，這與前人研究的正常細胞中所觀察到現象相吻合，但QKI 調控NIH3T3 細胞增殖的具體機制仍有待于進一步深入研究。除此之外，本研究中所獲得的敲除細胞株還可用于研究Quaking 基因的調控網絡。另外，可通過比較正常細胞和Quaking 基因敲除細胞的差異，來識別潛在的疾病相關基因，從而有助于研究疾病的發病機制和治療方法。Quaking 基因敲除細胞株還可用于腫瘤研究，了解Quaking 基因敲除對腫瘤發生和發展的影響，從而為癌癥治療提供線索?？傊?，Quaking 基因敲除NIH3T3 細胞株的構建，為進一步闡明Quaking對NIH3T3 細胞增殖的調控機制及其他功能研究提供了體外細胞模型。

4 結論

本研究利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術成功構建了Quaking 基因敲除的小鼠胚胎成纖維細胞株，并通過細胞增殖試驗表明，Quaking 基因敲除顯著抑制了NIH3T3 細胞的增殖能力。