三株無量山森林土壤芽孢桿菌鑒定及其生物活性挖掘

王楠 廖永琴 施竹鳳 申云鑫 楊童雨 馮路遙 矣小鵬唐加菜 陳齊斌 楊佩文

（1.云南農業大學植物保護學院，昆明 650000；2.云南省農業科學院農業環境資源研究所，昆明 650205）

農業綠色發展是可持續發展和生態文明建設的必由之路，在《“十四五”全國農業綠色發展規劃》《全國農業可持續發展規劃（2015-2030 年）》等政策的指導下，綠色農業的發展得到了大力助推。多樣化農業生產資源的形成得益于土壤中有效微生物資源的充分利用［1］，但在植物病害防治上仍面臨優良菌株資源匱乏、菌株功能單一、難以在田間自然條件下定植、抗藥能力差等條件限制［2］，挖掘高效及功能多樣的菌株資源對充實生物防治資源，轉變傳統生產模式，構建植物病害綠色防治技術具有重要的現實意義［3-7］。

拮抗微生物對作物根莖類病害具有良好的防控作用，且對構建健康土壤微生態，提高土壤有益微生物多樣性和豐富度具有顯著促進作用［8］。目前應用于植物病害生物防控的微生物包括細菌、真菌、放線菌，其中細菌主要是芽孢桿菌（Baccillus sp.）和假單胞菌（Pesudomonas sp.）等［9］。前人研究表明，獨特的自然生境內蘊含豐富的具有生物防控潛力的菌株資源，Morais 等［10］從塞拉多-卡廷加交錯帶森林分離的內生木霉（Trichoderma）菌株對多種病原菌菌絲生長表現出抑制活性。宋嘉寶等［11］從霉變雪茄（Cigarro）煙葉表面分離、純化的枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和耐鹽芽孢桿菌（B.halotolerans），對籃狀菌屬（Talaromyces）、帚霉屬（Scopulariopsis）和曲霉屬（Aspergillus）的病原微生物具有良好的拮抗活性。Wen 等［12］從庫姆塔格沙漠中分離出具有較強的紫外輻照抗性和抗菌能力的鏈霉菌（Streptomycetaceae）。分離自小麥（Triticum aestivum L.）根際土壤的解淀粉芽孢桿菌，對禾谷鐮刀菌（F.graminearum）平均抑菌率達70%以上［13］。除了對植物病原菌高效地抑菌活性外，芽孢桿菌還可通過分泌次生代謝產物或揮發性物質，在植株的生長發育和抗性誘導上發揮作用［14］。Zhang 等［15］從鹽堿地分離出的解淀粉芽孢桿菌具有耐鹽堿、解磷和修復鉛污染的能力，這些功能與微生物在生存環境中的定殖及植物的生長發育息息相關。

菌株功能的多樣性為植物病害的高效防治提供了保證，而在生防菌株挖掘過程中往往容易忽略對抑菌活性以外的功能活性進行研究。本研究從菌株的特殊生境入手，考慮到目前生物資源豐富的無量山國家自然保護區［16］，在潛在優勢微生物資源活性和功能方面的挖掘和研究明顯不足。因此從中分離篩選拮抗活性強，且抑菌譜廣的可培養微生物，并針對有益于植物生長、抗病的功能，驗證其多樣化的生物活性，旨在提高植物病害綠色防控的高效性和可持續性，并為拮抗菌株的開發利用提供理論基礎，充實農業綠色發展所需的有效微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試土壤樣品：采樣地點位于云南省大理白族自治州無量山國家級自然保護區，共5 個采樣小區，10 個樣點，每個樣點使用五點取樣法采集樣品，共采集得到50 份樣品，分裝于50 mL的無菌離心管中，帶回實驗室做土壤細菌分離。

供試病原菌：番茄枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.lycopersici）、香蕉枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.cubense）、煙草炭疽病菌（C.micotianae）、煙草赤星病菌（Alternaria alternate）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、草果葉斑病菌（Phoma matteuciicola），由云南省農業科學院農業環境資源研究所分離、鑒定與保存。

1.1.2 供試培養基 本研究所用培養基如表1 所示。

表1 供試培養基成分Table 1 Composition of test media

1.2 方法

1.2.1 功能菌株的分離篩選 土壤細菌的分離：取2 g 混合均勻的土壤樣品于200 mL 的無菌水內，28℃條件下加入適量玻璃珠搖瓶培養4-6 h，吸取200 μL 土壤溶液均勻涂布于NA 平板，28℃恒溫培養24 h 后挑取形態不同的細菌單菌落作為待測菌株。

初篩：以番茄枯萎病菌為指示菌，通過平板對峙法在PDA 培養基兩側分別接種待測菌、直徑5 mm 的病原菌，置于25-30℃的恒溫培養箱暗培養5-7 d，選擇具有抑菌效果的菌株作為候選拮抗菌株。

復篩：以番茄枯萎病菌為指示菌，28℃條件下搖瓶培養24 h 得到各待測候選拮抗菌株發酵液，PDA 培養基中央接種直徑5 mm 的菌餅，在距離菌餅上下左右各2.5 cm 處各放置一個牛津杯，菌株發酵液12 000 r/min 離心5 min 后過無菌濾膜后，每個牛津杯接入200 μL 候選拮抗菌株無菌發酵液，以接無菌水為對照，置于25-30℃的恒溫培養箱暗培養5-7 d，利用瓊脂擴散法檢測菌株發酵液的抑菌效果，選出拮抗活性強的菌株作為后續試驗的研究對象。

1.2.2 功能菌株抑菌廣譜性測定 PDA 培養基中央接種直徑為5 mm 的供試病原菌菌餅，上下左右各2.5 cm 點接待測菌，以接無菌水為對照，置于25-30℃的恒溫培養箱暗培養5-7 d，計算抑菌率。

菌株抑制率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-0.5 cm）×100%

1.2.3 功能菌株對番茄枯萎病菌菌絲生長的影響 拮抗菌株與指示菌于25℃恒溫培養箱內平板對峙培養5-7 d，每處理3 個重復，挑選拮抗交界處菌絲制樣，將樣品浸沒于含有體積分數為2.5%的戊二醛固定液（pH 6.8）中，室溫固定4 h，4℃固定過夜，磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）漂洗3 次，每次間隔10 min；固定后用不同濃度梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%）脫水10 min，最后脫水用100%的乙醇脫水3 次，每次30 min；將樣品置于高真空中進行干燥，在離子濺射儀內噴金，最后在掃描電子顯微鏡下進行觀察并拍照［19］。

1.2.4 功能菌株對番茄枯萎病菌孢子萌發的影響 病原菌培養15 d 后刮取分生孢子，加入無菌水過濾獲得病原菌孢子懸液，28℃下搖床培養72 h 獲得功能菌發酵液，1∶1 等體積加入病原菌孢子懸浮液和功能菌的無菌發酵液至滅菌離心管制成混合液，以只加病原菌孢子懸液為對照，重復3 次，在25℃條件下孵育，于48 h 觀察孢子萌發情況，芽管長度低于孢子短直徑的1/2 視為萌發受到抑制［20］。

1.2.5 功能菌株脂肽類抗性基因PCR 檢測 取斜面保藏純化菌株，平板劃線法接種于NA 培養基上，挑取單菌落接種于NB 培養基，30℃ 180 r/min 振蕩培養24 h，取1.5 mL 菌液10 000 r/min 離心處理5 min，去除上清液，用200 μL ddH2O 重懸，95℃沸水處理10 min，冰浴處理5 min，10 000 r/min 離心處理5 min，提取上清液為菌株DNA 模板。本研究所使用的10 對特異性引物（表2）均由北京擎科生物科技有限公司合成，利用上述特異性引物分別對菌株進行PCR 擴增。擴增體系為20 μL，具體參照申云鑫等［9］的方法：10×buffer 2.0 μL、dNTPs 1.6 μL、DNA 模板1.0 μL、Taq DNA 聚合酶 0.2 μL、上下游引物各1.0 μL、ddH2O 補滿體系。擴增條件：98℃ 2 min；98℃ 10 s，52℃ 15 s（ituC）或54℃ 15 s（bymC）或 58℃ 15 s（srfA），72℃ 10 s，35 個循環；72℃ 5 min，擴增結束后于4℃條件下保存備用。使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，在凝膠成像系統中觀察檢測結果。

表2 脂肽類抗性基因檢測引物Table 2 Detection primers for lipopeptide resistance genes

1.2.6 功能菌株促生及番茄枯萎病防治效果測定 刮取PDA 平板上28℃恒溫培養5-8 d 的病原菌，分散到6 g/L CMC（羧甲基纖維素鈉）溶液中制成孢子懸液，孢子濃度調至2.0×106CFU/mL。功能菌株28℃恒溫振蕩培養2-8 d，稀釋成2.0×108CFU/mL 的菌懸液。選取生長狀態良好且一致的盆栽苗，CK1 為空白組（單接無菌水）、營養對照組CK2（單接NB 培養基）、對照組CK3（單接病原菌）、試驗組（接種病原菌和功能菌），每個處理20 盆、每盆1 株，重復3 次，幼苗移栽定殖3 d 后，采用灌根的方式接種病原菌，每盆接種量為100 mL，待病原菌定殖3 d 接入等量功能菌懸液。30 d 后統計發病情況，病情分級標準參考王靜等［21］的方法：0 級為無癥狀；1 級為1 片或2 片葉子明顯變黃；2 級為3 片或4 片真葉變黃且葉片萎蔫下垂；3 級為5 片或6 片真葉變黃或真葉萎蔫下垂；4 級為全株嚴重萎蔫以致枯死。測定番茄苗的株高、根長、莖葉鮮重、根鮮重、葉綠素含量等指標，而后于180℃烘干至恒重，測定莖葉干質量、根干重等指標。

防效（%）=（對照組病情指數-處理組病情指數）/對照組病情指數×100%

病情指數=Σ（各級病株數×該病級值）/（總株數×最高級值）×100

1.2.7 功能菌其他生物活性測定 產鐵載體功能測定時，先取0.060 5 g 鉻天青S 溶于50 mL 去離子水，加入0.002 7 g 氯化鐵攪拌混勻獲得A 液；再稱取0.072 9 g 十六烷基三甲基溴化銨溶于40 mL 去離子水獲得B 液，將A 液緩慢倒入B 液攪拌均勻得CAS顯色液，將待測菌株點接于CAS 雙層顯色培養基的中心上層，若菌落周圍變紅或產生透明圈則表明有活性。解磷、解鉀、固氮、溶鋅、體外產酶功能測定時，將待測菌株點接于平板中心的上下左右各2.5 cm 處，置于28℃條件下恒溫箱暗培養24 h，觀察各功能平板是否有透明圈產生以檢測其相應活性，觀察淀粉酶活性時需滴加盧戈氏碘液（碘5.0 g、碘化鉀10.0 g、蒸餾水加至100 mL）顯色?？股厮幟魴z測：取300 μL 菌株發酵液均勻涂布于NA 平板上，待平板干燥后將藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）放置于平板中央，28℃恒溫培養箱暗培養24 h觀察實驗結果，產生透明圈則證明菌株對相應抗生素敏感，不產生則證明菌株對相應抗生素不敏感。

1.2.8 功能菌株鑒定 平板劃線法接種拮抗活性菌株，28℃的恒溫培養箱暗培養24-48 h 觀察并拍攝記錄掃描電子顯微鏡下的菌株形態，參照《伯杰氏系統分類手冊》［22］和《常見細菌系統鑒定手冊》［23］進行形態特征和生理生化鑒定分析。

分子生物學鑒定：接種功能菌株至NB 液體培養基，30℃、180 r/min 條件下搖床培養，無菌條件下取樣測定菌液OD600值，當OD600值近似于1（約1×109CFU/mL）時停止培養，用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 試劑盒提取菌株的基因組DNA。采用細菌16S rRNA 通用引物27F/1492R（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）、gyrA 基 因引 物F/R（5'-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3',5'-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3）、rpoB 基因引物2292F/3354R（5'-AGGTCAACTAGTTCAGTATGGAC-3',5'-AAGAACCGTAACCGGCAACTT-3'）進行PCR 擴增，擴增產物純化回收，送至北京擎科生物科技有限公司進行測序，測序結果經BLAST 檢索后與GenBank 數據庫中相關種屬的基因序列進行比較分析，選同源性較高的菌株的序列作為參比對象，用Clustal X 進行多序列比對，并采用鄰接法（neighbor-joining）用Mega7.0 構建供試菌株與參比菌株之間的系統發育樹。

1.2.9 數據處理 使用Excel 和SPSS Statistics 22.0進行數據統計分析，采用GraphPad Prism 8.0 制圖。

2 結果

2.1 功能菌株分離篩選

經過初篩，10 株菌株對番茄枯萎病菌具有較強的拮抗活性，抑菌率均在70%以上（表3），其中菌株SH-53、N4471 和N9456 的抑菌率最高，分別為92.35%、87.29%和88.47%，經過復篩，菌株SH-53、N4471 和N9456 的無菌過濾發酵液對番茄枯萎病菌抑菌效果顯著高于其他菌株，故以該3 株菌株作為后續研究對象。

表3 功能菌株篩選結果Table 3 Results of screening functional strains

2.2 功能菌株抑菌廣譜性測定

3 個功能菌株對多種病原菌均表現良好拮抗活性（圖1），菌株SH-53 對香蕉枯萎病菌、煙草炭疽病菌、煙草赤星病菌、玉米大斑病菌、油菜菌核病菌、草果葉斑病菌拮抗活性分別達到75.3%、82.4%、84.1%、88.8%、81.2%、87.6%，菌株N4471 對香蕉枯萎病菌、煙草炭疽病菌、煙草赤星病菌、玉米大斑病菌、油菜菌核病菌、草果葉斑病菌抑菌率分別達71.8%、80.6%、77.6%、85.9%、77.6%、85.9%，菌株N9456 對香蕉枯萎病菌、煙草炭疽病菌、煙草赤星病菌、玉米大斑病菌、油菜菌核病菌、草果葉斑病菌的抑菌率分別達76.5%、81.8%、80.0%、87.1%、84.1%、90.6%。

圖1 功能菌株SH-53、N4471、N9456 抑菌譜Fig.1 Bacteriostatic spectrum of functional strain SH-53,N4471,and N9456

2.3 功能菌株對番茄枯萎病菌菌絲生長的影響

與正常的病原菌菌絲相比，在菌株SH-53 的影響下，番茄枯萎病菌菌絲發生畸形彎曲，部分節間腫大，還出現斷裂、泡囊結構；菌株N4471 使番茄枯萎病菌的菌絲出現不規則形變，菌絲鈍化且菌絲量變少、節間縮短，菌絲發生斷裂；受菌株N9456影響，番茄枯萎病菌菌絲畸形、變短、數量減少、彎曲變細（圖2）。

圖2 功能菌株對番茄枯萎病菌菌絲的影響Fig.2 Effects of functional strains on the mycelia of Fusarium oxysporum causing tomato wilt disease

2.4 功能菌株對番茄枯萎病菌孢子萌發的影響

菌株SH-53、N4471、N9456 發酵液對番茄枯萎病菌的分生孢子萌發有明顯抑制作用。48 h 番茄枯萎病菌孢子萌發效果如圖3 所示，對照組大部分孢子長出了明顯的芽管，而處理組大部分孢子還未產生芽管，或芽管長度低于孢子短直徑的1/2。

圖3 番茄枯萎病菌孢子萌發（孵育48 h）顯微鏡觀察效果Fig.3 Microscopic observation of spore germination of tomato wilt bacterium F.oxysporum（Incubated for 48 h）

2.5 功能菌株脂肽類抗性基因PCR檢測

對10 組功能基因進行的PCR 檢測，結果（圖4）顯示，3 個功能菌株均具有脂肽類抗性基因srfA（1 300 bp）、fenA（1 000 bp）、ituA（1 047 bp）、ituC（575 bp）、ituD（647 bp）、bymC（875 bp），其中菌株SH-53 和菌株N9456 還具有脂肽類抗性基因sfp（675 bp）、fenB（1 600 bp）、bymA（1 200 bp），菌株N9456 還具脂肽類抗性基因bymB（983 bp）。

圖4 功能菌株脂肽類抗性基因PCR 電泳產物Fig.4 PCR electrophoresis products of lipopeptide synthesis genes in functional strains

2.6 功能菌株促生及番茄枯萎病防治效果

番茄幼苗經功能菌株接種處理30 d 后，3 個功能菌株對番茄幼苗促生效果良好（圖5）。處理組SH-53、N4471、N9456 株高分別較空白對照組（CK1）顯著增加47.5%、38.9%和45.3%，分別較營養對照組（CK2）增加34.6%、26.7%和32.5%；莖粗分別較對照組（CK1）增加64.9%、67.8%和61.5%，分別較營養對照組（CK2）增加20.2%、22.3%和17.7%；根長分別較對照組（CK1）增長76.8%、36.4%和52.9%，分別較營養對照組（CK2）增長52.3%、17.5%和31.7%；地上部分鮮重分別較對照組（CK1）增重54.2%、52.8% 和69.4%，分別較營養對照組（CK2）增重50.7%、49.2%和65.5%；地上部分干重分別較對照組（CK1）增重113.6%、165.4%和125.4%，分別較營養對照組（CK2）增重47.5%、83.2%和55.6%；地下部分鮮重分別較對照組（CK1）增重49.3%、101.9%和86.5%，分別較營養對照組（CK2）增重11.8%、51.2%和39.7%；地下部分干重分別較對照組（CK1）增重214.3%、278.6%和150.0%，分別較營養對照組（CK2）增重109.5%、152.4%和66.7%（表4）。

圖5 番茄苗促生效果圖Fig.5 Growth-promoting effect diagram on tomato seedling

表4 功能菌株對番茄幼苗生長的影響Table 4 Effects of functional strains on the growths of tomato seedlings

處理30 d 后，接種病原菌孢子懸浮液處理的番茄苗表現出莖基部皺縮的癥狀，且葉片自下而上逐漸發黃枯萎，剖開莖基部維管束明顯呈現褐色發黑狀。只接種病原菌的對照組（CK3）發病較為嚴重，病情指數達75.6，在混接病原菌及功能菌株SH-53、N4471、N9456 發酵液處理下，番茄幼苗發生番茄枯萎病的病情指數顯著降低為11.7、33.9、30.0，表明3 株功能菌對番茄枯萎病均有顯著的抑制作用（P＜0.05），功能菌株SH-53、N4471、N9456 對番茄枯萎病的防治效果分別為84.7%、55.0%、59.7%。表明3 個菌株均能有效抑制番茄枯萎病的發生，其中以菌株SH-53 的防治效果最好，其植株健康狀態與營養對照組（CK2）的番茄幼苗無明顯差異（圖6）。

圖6 功能菌株對番茄幼苗枯萎病的防控效果Fig.6 Effects of functional strains on the prevention and control of tomato fusarium wilt

2.7 功能菌株其他生物活性測定

研究結果表明（圖7），3 株功能菌均具有溶鋅功能，均能分泌蛋白酶、淀粉酶，菌株SH-53、N4471 還具有解磷、固氮的功能，并具有分泌纖維素酶及產鐵載體的能力。菌株SH-53 對青霉素、氨芐西林不敏感，對紅霉素、慶大霉素、鏈霉素、四環素、萬古霉素敏感；菌株N4471 對慶大霉素敏感，而對紅霉素、鏈霉素、四環素、青霉素、萬古霉素、氨芐西林不敏感；菌株N9456 對青霉素、氨芐西林、紅霉素、慶大霉素、鏈霉素、四環素、萬古霉素均表現出不同程度的敏感。

圖7 菌株生物活性測定結果Fig.7 Results of strain biological activity assay

2.8 功能菌株鑒定結果

3 個功能菌在NA 培養基上的菌落形態及掃描電鏡下的形態如圖8 所示，3 個菌株在掃描電鏡下均表現為桿狀形態，菌株SH-53 菌落中心呈乳白色，邊緣半透明，產色素，菌落形狀不規則呈褶皺狀，邊緣整齊，較規整，菌落表面黏稠，略微凸起。菌株N4471 菌落中心呈乳白色，邊緣半透明，不產色素，菌落形狀不規則，略呈放射狀，較規整。菌株N9456 菌落中心呈乳白色，黏液狀且形狀不規則，具有整個邊緣且邊緣半透明，略微凸起，不產色素。經形態學初步鑒定菌株SH-53、N4471、N9456 為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。

圖8 功能菌株菌落形態及掃描電鏡圖Fig.8 Colony morphology and scanning electron microscopy of functional strains

生理生化鑒定結果（表5）顯示，3 個菌株均為革蘭氏陽性菌，需氧且均能產生芽孢，接觸酶、V-P實驗均為陽性，且均能發生硝酸還原反應及使明膠液化，此外菌株SH-53、N4471 還具有產吲哚的能力。

經NCBI Blastn 搜索并 與GenBank 數據庫中相關種屬基因序列比較分析后，菌株SH-53、N4471、N9456 屬于芽孢桿菌屬。菌株SH-53 與B.amyloliquefaciens ZJU1，菌株N4471 與B.cabrialesii TE3，菌株N9456 與B.siamensis LS5 分別處于同一獨立分支，且其引導支持率分別達到100%、100%、99%（圖9）。結合形態學鑒定和生理生化特征，鑒定菌株SH-53 為解淀粉芽孢桿菌，菌株N4471 為卡式芽孢桿菌，菌株N9456 為暹羅芽孢桿菌。

圖9 菌株SH-53、N4471 和N9456 基于16S rRNA、gyrA、rpoB 序列的系統分析發育樹Fig.9 Phylogenetic trees of the strain SH-53,N4471 and N9456 based on 16S rRNA,gyrA,and rpoB sequences

3 討論

芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）作為植物病害生物防治的主要微生物種群，具有抑菌譜廣、抗逆性高和不易產生抗藥性等特點［24］。3 株芽孢桿菌SH-53、N4471、N9456 對自然環境適應性良好，除番茄枯萎病菌以外，對香蕉枯萎病菌、煙草炭疽病菌、玉米大斑病菌等多種病原菌均有良好抑菌活性。從微觀角度探尋菌株高效抑菌的機制，本研究發現3 株拮抗菌對番茄枯萎病菌菌絲均有不同程度的破壞、致畸作用。前人研究表明，芽孢桿菌在生長代謝的過程中會產生多種抗菌物質，其中包括具有廣譜抑菌活性的脂肽類抗生素，如polymyxins、surfactins、iturins、fengycins 等［25］，許本宏［26］通過試驗發現，脂肽類化合物iturin A 和bacillomycin F 能使菌絲發生變形、畸形發育而破壞其生長，而3 株拮抗菌均具有srfA、fenA、ituA、ituC、ituD、bymC 等脂肽類抗性基因，表明其高效廣譜的抑菌活性可能來自于這些基因的高效表達，通過脂肽類抗生素的合成來抑制菌絲的生長發育。

菌株SH-53、N4471、N9456 分別被鑒定為解淀粉芽孢桿菌、卡式芽孢桿菌和暹羅芽孢桿菌，對番茄枯萎病防效良好，國內外均有學者驗證了這些種群作為生防菌株的應用潛力。解淀粉芽孢桿菌作為一種重要的生防微生物，具有防治植物病害、促進植物生長、改善根際土壤微生物種群結構等作用［27］，該種群對橡膠樹炭疽病菌（C.acutatum）、水稻基腐病菌（Dickeya zeae）、西瓜枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.niveum）等多種病原物都有良好的抑菌活性［28-30］?？ㄊ窖挎邨U菌也被證實在小麥種植過程中具備生防促生潛力［31］，并對番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）具有較強抑菌活性［32］。暹羅芽孢桿菌［33］對附子白絹病菌（Sclerotium rolfsii）、花生冠腐病菌（Aspergillus niger）、灰葡萄孢等也有較好抑菌效果［34-36］。雖然生防微生物自身具備病原拮抗能力，但投放田間后常常會因農藥施用或殘留等影響，影響種群數量，進而影響生防效果［2］。菌株SH-53、N4471 對多種抗生素的抗性，將有助于提高其在實際應用過程中的穩定性。不僅如此，菌株包括分泌蛋白酶、溶鋅、產鐵載體在內的諸多生物活性，也被證實能通過改善農藝性狀、提高土壤肥力、促進土壤中難溶性化合物的降解［37］等提高植物的抗病能力。肖瑀軒等［38］分離的暹羅芽孢桿菌CML548 能同時產生蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶，并發現其具有優良的益生性狀。褚睿等［39］發現具解鉀、分泌蛋白酶、鐵載體功能的貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）N6 對黃瓜（Cucumis L.）幼苗生長有顯著的促進作用。土壤中的鐵元素通常以氧化物等溶解度極低的形式存在，微生物產生的鐵載體，可以特異螯合Fe3+，促進植物對鐵元素的吸收［40］。另外環境中鋅離子濃度過高也會影響菌株生物膜的形成［41］，進而影響其拮抗病原菌的能力。Sellappan 等［42］發現配施可溶性鋅肥和可溶鋅的芽孢桿菌，有助于提高玉米（Zea mays L.）籽粒的生長及產量特性和養分積累。故菌株的抗病能力及各種生物活性的加持有利于應用過程中作物的生物強化。

本研究所篩選菌株的優勢在于其高效廣譜的抗病能力及豐富的生物活性，如何有針對性地提高其抗病能力并發揮生物活性的功效，在生產實踐中是不可忽略的環節。后續可通過菌株發酵條件的優化來提高其生長量和抑菌效果，并尋找生物相容性強的載體、助劑提高其穩定性，從而提升生物菌劑的開發速度，降低菌株開發成本，為植物病害綠色防控充實微生物菌株資源。

4 結論

本研究篩選的3 株生防芽孢桿菌（SH-53：解淀粉芽孢桿菌，N4471：卡式芽孢桿菌，N9456：暹羅芽孢桿菌）具有高效廣譜的抑菌活性，可分泌蛋白酶和淀粉酶，且具有溶鋅的功能，并具有srfA、fenA、ituA、ituC、ituD、bymC 等脂肽類抗性基因，可顯著降低番茄枯萎病病情指數，并對番茄植株生長有促進作用。