淫羊藿苷預防模擬微重力大鼠骨丟失及氧化應激的作用

王中琪 吳西 高玉海 柏鑫 陳克明,3*

1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四○醫院基礎醫學實驗室,甘肅 蘭州 730050

2.甘肅中醫藥大學中醫臨床學院,甘肅 蘭州 730030

3.甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室,甘肅 蘭州 730050

伴隨著載人航空事業的進步,宇航員在太空失重環境發生的骨骼和肌肉丟失、心血管功能障礙等問題卻日益突出,其中骨丟失是至今仍未解決的一個難題[1]。有研究發現在國際空間站任務期間,8名航天員的股骨骨密度降低了3%～10%,其中4名股骨頸骨密度降低了1.7%～10.5%。并且有7名宇航員的腰椎骨密度降低了2.5%～10.6%,而在正常重力環境中患有骨質疏松癥的人群每年的骨量流失率僅為0.5%～1%[2]。這一發現表明,失重條件下骨密度的下降速度遠快于骨質疏松癥的人群[3]。目前針對太空失重引起骨丟失采取的防治措施包括運動預防法、電磁場療法和藥物治療等[4]。但運動療法與電磁場療法存在一定的不便,而長期使用雙膦酸鹽類藥物又存在潛在的副作用,因此筆者嘗試從中醫角度尋找新的治療方法。

中藥淫羊藿最早記載于《神農本草經》,認為其具有溫腎益陽、強筋骨、固精等功效[5]。研究發現淫羊藿有效成分含量研究主要集中于黃酮類成分,其中淫羊藿苷為淫羊藿黃酮類中主要有效成分,在預防絕經后骨質疏松方面也具有較好的療效[6]。相關研究表明淫羊藿苷可以通過激活成骨基因表達,促進骨髓間充質干細胞成骨分化,預防絕經后骨質疏松[7]。程琳燕等[8]研究發現,淫羊藿苷通過下調RANKL-p38/ERK-NFAT信號通路抑制破骨細胞分化,從而保護骨組織結構。同時本課題組前期研究發現,淫羊藿苷可以提高成骨細胞活性,促進骨髓基質干細胞的成骨性分化,抑制破骨細胞發生與骨吸收活性,并且通過體內實驗發現淫羊藿苷可以提高生長期大鼠峰值骨量以及預防切出卵巢發生絕經后骨質疏松[9-15]。

基于淫羊藿苷抗絕經后骨質疏松癥領域的研究以及本團隊前期研究成果,本研究提出淫羊藿苷具有預防微重力環境導致的骨丟失作用的假說。為了證明此假說,本實驗采用國際公認的大鼠鼠尾懸吊模型來研究微重力環境下引起的骨丟失,并查閱相關文獻給予淫羊藿苷50 mg/kg進行干預治療,對比各組大鼠的骨微結構、血清骨代謝指標、骨形成相關蛋白表達水平及氧化應激水平的差異來證明淫羊藿苷能預防模擬微重力環境下大鼠骨丟失并研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:2月齡Wistar雄性大鼠30只,體重(200±10) g。飼養于中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四○醫院動物實驗中心(許可證編號:SYXK(軍)2017-0047),自由進食、攝水。本實驗經中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四○醫院科研管理倫理委員會審查符合動物倫理(審批編號:2021KYLL184)。

1.1.2實驗藥物及試劑:淫羊藿苷(寶雞辰光生物科技有限公司,純度98%,產品批號:HI008055298);戊巴比妥鈉(美國sigma化學公司,產品批號:11715-100G);β-actin、Runx2、COL-1、BMP2、OSX抗體(江蘇親科生物有限公司,批號:AF7018、AF4770、AF7001、DF6034、AF7580);山羊抗兔IgG-HRP抗體(巴傲得生物科技有限公司,批號:BS13278);PINP、CTX-1、OPG、RANKL、8-iso-PGF2α、8-OHdG ELISA試劑盒(泉州睿信生物科技有限公司,批號:20211217-30103B、20211217-35070B、20211217-30397B、20211217-30432B、20211217-30030B、20211217-30027C);MDA、SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:A003-1-2、A001-3-2)。

1.1.3實驗儀器與設備:NMC-100型Micro-CT(平生醫療科技);全波長酶標測試儀(Epoch Biotek);Scientz-48L冷凍型高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技有限公司);MiniChemiTM580型化學發光成像分析系統(森西賽智);DP71型正置顯微鏡(奧林巴斯)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及模型建立:將2月齡雄性Wistar大鼠利用隨機數字表法分為CON組、HLS組、ICA組,每組10只,CON組單只分籠飼養,HLS組和ICA組大鼠均建立大鼠鼠尾懸吊模型,具體模型建立方法參考陳杰等[16]的改良方法。尾吊模型建立后,ICA組按50 mg/kg濃度灌胃給藥,CON組及HLS組給予等體積的蒸餾水灌胃,每日1次,灌服28 d后,腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉下取血處死,摘取主要臟器及骨骼。

1.2.2檢測指標:(1)Micro-CT掃描股骨及腰椎。對大鼠左側股骨及第4腰椎進行Micro-CT掃描,感興趣區域為距離股骨髁上2 mm,厚度2 mm區域及第4腰椎椎體中心1 cm3立方體,獲得三維結構圖以及骨小梁詳細結構參數。(2)ELISA血清骨代謝指標分析。大鼠通過腹主動脈采血液樣本,4 ℃冰箱靜置1 h后以3 500 r/min離心15 min,吸取上清液,按照雙抗體酶聯免試劑盒說明書,采用ELISA檢測法測定大鼠血清骨代謝指標PINP、CTX-1、OPG、RANKL的含量。(3)Western blotting分析骨形成相關蛋白。取脛骨髁下4 mm骨組織剪碎,提取骨組織蛋白樣品,上樣,電泳,電轉,封閉2 h,分別加入COL-1、Runx2、BMP2、OSX和β-actin抗體4 ℃過夜,次日加入山羊抗兔IgG-HRP抗體,室溫孵育2 h后曝光,用ImageJ軟件對結果進行量化分析。(4)氧化與抗氧化指標檢測。采用WST-1法檢測血清中的SOD活力,TBA法檢測血清中的MDA含量,ELISA檢測法測定大鼠血清中8異前列腺素F2α(8-iso-PGF2α)和8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的含量。

1.3 統計學處理

采用SPSS 23.0、Graphpad Prism9.3.1軟件進行數據分析,本實驗所有數據均為定量資料,符合正態分布的數據以均數±標準差表示,不服從正態分布采用中位數和四分位數間距(M,IQ)表示。符合正態分布且方差齊性的多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Micro-CT股骨及腰椎掃描結果

通過股骨骨小梁三維重建圖及股骨縱截面可觀察到CON組骨小梁密集交織呈網狀;HLS組的骨小梁分布稀疏且骨小梁之間的孔隙明顯;ICA組骨小梁分布密度與CON組接近(圖1A)。骨小梁參數的量化結果顯示,與CON組相比,HLS組的BMD、BS/TV、BV/TV、Tb.N及Tb.Th均降低(P<0.05),且Tb.Sp升高(P<0.05)。與HLS組相比,ICA組的BMD、BS/TV、BV/TV、Tb.N及Tb.Th均升高(P<0.05),而Tb.Sp降低(P<0.05)(圖1B)。

圖1 各組大鼠股骨遠端Mirco-CT三維重建及掃描參數

同樣在第4腰椎的三維重建圖中,能觀察到CON組的骨小梁交錯排列,形成了緊密的網狀結構;HLS組中的骨小梁分支顯著減少,間隙增大,結構疏松;ICA組骨小梁仍呈致密的網狀結構(圖2A)。根據對骨小梁參數的量化結果可知,與CON組相比,HLS組的BMD、BS/TV、BV/TV、Tb.N及Tb.Th均降低(P<0.05),且Tb.Sp升高(P<0.05)。與HLS組相比,ICA組的BMD、BS/TV、BV/TV、Tb.N及Tb.Th均升高(P<0.05),且Tb.Sp降低(P<0.05)(圖2B)。

圖2 各組大鼠第4腰椎Mirco-CT三維重建及掃描參數

2.2 血清骨代謝指標檢測結果

如圖3所示,與CON組相比,HLS組血清中骨形成指標PINP、OPG含量均降低(P<0.05),而骨吸收指標CTX-1、RANKL含量均升高(P<0.05);ICA組中骨形成指標PINP、OPG含量與骨吸收指標CTX-1含量與CON組相近(P>0.05)。與HLS組相比,ICA組血清中骨形成指標PINP、OPG含量均升高(P<0.05),骨吸收指標CTX-1、RANKL含量均降低(P<0.05)。

圖3 各組大鼠血清骨代謝指標量化結果

2.3 Western blotting 檢測骨形成蛋白結果

如圖4所示,與CON組相比,HLS組BMP2、Runx2、COL-1、OSX蛋白表達均降低(P<0.05);ICA組Runx2、OSX蛋白表達與CON組相近(P>0.05)。與HLS組相比,ICA組BMP2、Runx2、COL-1、OSX蛋白表達均升高(P<0.05)。

圖4 各組大鼠骨形成蛋白表達結果

2.4 氧化與抗氧化指標檢測結果

與CON組相比,HLS組血清中氧化指標8-iso-PGF2α、8-OhdG和MDA含量均升高(P<0.05),抗氧化指標SOD酶活力降低(P<0.05)。與HLS組相比,ICA組血清中8-iso-PGF2α、8-OHdG、MDA含量降低(P<0.05),SOD酶活力升高(P<0.05)(圖5)。

圖5 各組大鼠氧化與抗氧化指標結果

3 討論

骨丟失導致的骨小梁的顯微結構和幾何形狀的改變是丟失程度的直觀顯示[17]。本實驗首先通過Micro-CT提供的三維圖像,觀察骨小梁的形態結構和數量,分析骨小梁的參數變化。其結果能清晰地對比出各組間的骨丟失程度,與CON相比,HLS組骨小梁分布稀疏且連續性較差,骨小梁厚度減少,說明尾吊后導致HLS組發生骨丟失,骨微結構遭到破壞;與HLS組相比,ICA組骨小梁增厚,連續性較好,分布均勻。說明淫羊藿苷預防了骨小梁結構的破壞,抵抗了骨丟失導致的骨小梁形態特征改變。

在骨骼重建過程中,成骨細胞和破骨細胞會分泌不同的細胞因子、蛋白質和特定分子,這些分子可以影響骨吸收和骨形成[18]。這些分子也被稱為骨形成標志物和骨吸收標志物,在血清中檢測可反映骨細胞的活動狀態[19]。本實驗中HLS組PINP、OPG均降低,CTX-1、RANKL均升高,說明模擬微重力環境下大鼠成骨活動減弱,骨礦化減少,骨吸收增加;ICA組相較于HLS組PINP、OPG均升高,CTX-1、RANKL均降低,說明淫羊藿苷可以改善尾吊大鼠造成的成骨活動減弱,骨吸收增加。同時ICA組骨形成指標PINP、OPG含量與骨吸收指標CTX-1含量與CON組相近,說明灌服淫羊藿苷能促進尾吊大鼠骨形成,抑制骨吸收,并在一定程度上使骨形成和骨吸收恢復至正常水平?；谝陨?本研究也對參與骨形成的相關蛋白COL-1、BMP-2、Runx2、OSX的表達進行了檢測,結果顯示HLS組的骨形成相關蛋白均呈下降趨勢,ICA組的骨形成相關蛋白均高于HLS組,但與CON組仍存在一定差距。說明淫羊藿苷能在一定程度上調大鼠骨組織中COL-1、BMP2、Runx2、OSX的表達量,進而減緩微重力導致的骨丟失。

長時間的空間飛行后,人體內氧化劑的產生和抗氧化劑的防御之間的平衡被打亂,過量的氧化劑會導致骨骼氧化損傷[20]。相關研究表明,模擬微重力條件下成骨細胞的活性氧水平升高,增殖速率減慢,成骨活性下降,抗氧化干預能恢復成骨細胞細胞增殖速率和代謝[21]。MDA是常見氧化代謝產物,可以反映出體內細胞的損傷程度,8-iso-PGF2α和8-OhdG也是氧化損傷標志物,分別與脂質和DNA相關[22]。同時,測量SOD可以間接反映人體清除氧自由基的能力,與氧化損傷結合指標起來,可以較為全面地反映氧化應激狀態。本實驗中大鼠在微重力環境下體內脂質過氧化水平升高,清除氧自由基的能力下降,而淫羊藿苷能夠減輕大鼠體內氧化應激水平預防骨丟失。相關研究表明,尾吊后大鼠體內的氧化標志物顯著升高,并且包慧蘭等[23]、趙博雅等[24]的研究中發現淫羊藿苷能抑制心肌線粒體MDA含量,增加心肌線粒體SOD活性。上述結果進一步驗證本結論,淫羊藿苷能夠減輕尾吊狀態引起的氧化應激程度從而減少對骨細胞的損害,維持正常骨微結構及骨質量。

綜上所述,本研究結果表明模擬微重力環境會引起骨密度下降,最大載荷下降,骨微結構退化,而淫羊藿苷能促進骨形成,抑制骨吸收,減輕體內氧化程度,提升抗氧化能力從而有效預防大鼠產生氧化應激反應導致骨丟失。未來,通過更多的實驗和研究,也可以繼續探索我國傳統中藥在太空探索和太空醫學等領域的應用,為太空探索提供更多解決方案。