龜板抑制破骨分化改善骨質疏松性骨折

張鵬 陳弘林 伍子賢 余思瑤 招文華 尚奇 何嘉輝 陳桂鋒 余富勇 梁德 江曉兵 任輝* 余翔,4*

1.廣州中醫藥大學,廣東 廣州 510405

2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院,廣東 廣州 510405

3.廣州醫科大學第二附屬醫院,廣東 廣州 510260

4.廣東省中醫臨床研究院,廣東 廣州 510405

骨質疏松性骨折(osteoporotic fracture,OF)作為骨質疏松癥最嚴重的并發癥,其發病率逐年升高,預計2035年我國髖部、椎體以及腕部OF約有483萬例,至2050年將達599萬例[1]。臨床多使用骨吸收抑制劑來治療OF,但這些藥物的臨床運用由于其使用過程中存在的并發癥而受到限制[2]。近年來,中醫藥在治療OF上展現出良好的療效,國內外專家學者也逐漸開始關注這一領域[3-4]。

龜板(plastrum testudinis,PT)具有補腎強骨的功效,近年來對龜板抗OF的研究越來越多,但多集中在PT促進骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化方面,研究表明龜板提取物及含藥血清對大鼠BMSCs有促增殖作用,在臨床上有較好的實際運用和發展前景[5]。網絡藥理學能從多分子、多靶點、多途徑的角度闡述藥物干預疾病的治療原理[6]。因此,本文擬運用網絡藥理學和實驗驗證探討PT治療OF的潛在機制。

1 資料與方法

1.1 龜板化合物及靶點信息的獲取

借助BATMAN數據庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)尋找龜板的相關活性物質及其對應靶點,將閥值“Score cutoff”設置為10[7]。

1.2 骨質疏松性骨折靶點集及龜板治療骨質疏松性骨折的潛在靶點獲取

在GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://www.omim.org)數據庫檢索得到OF靶點集,并借助R軟件將其與1.1中得到的靶點交集映射獲取兩者的交集靶點。

1.3 龜板治療骨質疏松性骨折的靶點蛋白互作網絡構建

將交集靶點輸入至STRING數據庫(https://string-db.org/),去除孤立蛋白后得到蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)信息,并將其導入到Cytoscape 3.7.2(http://www.cytoscape.org/)軟件構建PPI網絡,借助網絡拓撲學分析進一步篩選核心靶點。

1.4 龜板-活性成分-靶標-骨質疏松性骨折網絡的構建

組建“龜板-活性成分-靶標-骨質疏松性骨折”四者之間的對應信息,將其導入至Cytoscape 3.7.2 軟件進行網絡可視化。

1.5 GO生物過程富集分析

交集靶點的GO生物過程(biological process,BP)富集分析通過R軟件完成,以點狀圖的形式展示顯著性排在前20的富集條目。此外,將交集靶點導入Cytoscape 3.7.2 軟件中進行GO.BP富集分析,篩選出主要與OF相關的生物學過程(P<0.05),可視化展示上述生物學過程及其對應的交集靶點。

1.6 KEGG通路富集分析

同樣利用R軟件對交集靶點進行KEGG分析,將富集得到的信號通路(P<0.05)按照顯著性進行排序展示,并構建“通路-靶標”之間的對應關系,通過Cytoscape 3.7.2軟件進行網絡可視化展示[8]。

1.7 實驗驗證

1.7.1實驗動物:SPF級雌性SD大鼠30只,購自廣州中醫藥大學醫學實驗動物中心。所有動物實驗均經廣州中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準(No.TCMF1-2021068)。

1.7.2實驗試劑:重組人RANKL(6449-TEC)購于美國R&D Systems公司,重組人M-CSF(11792-H08Y)購于北京義翹神州科技股份有限公司,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒購于美國Sigma公司,胎牛血清(FBS)、α-MEM培養基購于賽業生物科技有限公司,CCK8試劑購于上海碧云天生物技術有限公司,龜板購于廣州中醫藥大學第一附屬醫院(批號:KG37243537)。

1.7.3龜板水提液的制備:參照本課題組前期研究基礎[9]。100 g龜板粉碎后,加1 L純水,微沸1 h,獲得提取液,剩余藥渣重復操作微沸2次后獲得提取液。所有提取液0.22 μm過濾除菌,分裝并密封后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.7.4OF大鼠模型的構建及龜板的干預:將30只雌性SD大鼠隨機分為3組:假手術組、OF組和OF+PT組,每組10只。其中假手術組僅予術口切開,生理鹽水灌胃;根據既往報道的方法[10],OF組大鼠去除雙側卵巢3個月后,于L6椎體側造一直徑為3 mm、深度為3 mm的圓形骨缺損,以模擬骨質疏松性椎體骨折后局部骨缺損狀態;OF+PT組予構建大鼠L6椎體OF模型,龜板水提液灌胃,灌胃濃度按照人和動物間體表面積折算的等效劑量比值換算為:3.15 g/(kg·d)。造模成功后,灌胃治療4周后處死各組大鼠并取材,取L6傷椎行micro-CT、HE染色評估OF模型大鼠骨缺損愈合的情況。

1.7.5實驗細胞培養:所有臨床實驗均通過本院倫理委員會的批準(No.K[2019]129)。在本研究中,從確診為OF[11-12]的男性患者(n=3)中取外周靜脈血10 mL,均經患者知情同意。根據文獻報道的方法[13],從血液樣本中提取人外周血單核細胞(human peripheral blood monocytes,HPBMs)進行培養。

1.7.6CCK8法檢測龜板對HPBMs活性的影響:取HPBMs以1×104/孔的密度接種于96孔板中,培養24 h后分為對照組和龜板干預組,對照組加入含25 ng/mL M-CSF的α-MEM培養基,龜板干預組加入含不同濃度梯度的龜板水提液和25 ng/mL M-CSF的α-MEM培養基,共設置5、10、20、30 μg/mL 4個濃度梯度,置于培養箱中繼續培養,分別于給藥后0、1、3、5、7 d取出1塊培養板,檢測HPBMs的吸光度值(OD 450 nm)。

1.7.7TRAP染色鑒定龜板對HPBMs破骨分化的影響:取HPBMs以2×105個/cm2的密度接種于24孔板中,選取CCK8法檢測得到對HPBMs無細胞毒性的龜板水提液濃度進行干預,即用含25 ng/mL M-CSF、50 ng/mL RANKL及不同濃度龜板水提液的培養液誘導培養,隔天換液。干預10 d后進行TRAP染色,將具有3個以上細胞核,且細胞質染成酒紅色的細胞定義為TRAP染色陽性(TRAP+)的成熟破骨細胞。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 龜板成分及作用靶點信息

通過BATMAN數據庫檢索去重后得到龜板6個活性成分,包括苯丙氨酸(Phenylalanine)、甲硫氨酸(Methionine)、蘇氨酸(Threonine)、碳酸鈣(Calcium Carbonate)、亮氨酸(Leucine)、天冬氨酸(Aspartic Acid),以及342個作用靶標。

2.2 龜板治療骨質疏松性骨折的潛在靶點獲取

共獲得OF相關靶點840個,與 342個PT靶點交集映射得到34個交集靶點。交集靶點信息見表1。

表1 龜板治療骨質疏松性骨折的潛在靶點基因

2.3 PPI網絡和龜板-活性成分-靶標-骨質疏松性骨折網絡構建

交集靶點構建的PPI網絡圖共涉及32個節點,126條邊。該網絡中有17個靶點蛋白的度值超過平均值(7.875),視其為核心靶點,詳見表2。龜板-活性成分-靶標-骨質疏松性骨折網絡圖由42個節點和79條邊組成,線條代表龜板、活性成分、作用靶點和骨質疏松性骨折之間的對應關系,網絡拓撲學分析提示度值排名前3位的核心活性成分為苯丙氨酸(Phenylalanine,度值=21)、甲硫氨酸(Methionine,度值=9)、蘇氨酸(Threonine,度值=4)。

表2 龜板治療骨質疏松性骨折的核心靶點

2.4 GO.BP富集分析

GO.BP富集分析共獲得802個結果,主要涉及破骨分化的調節、氧化應激反應、糖皮質激素反應、NF-κB信號的正向調控、雌激素反應、凋亡信號通路的調控等。此外,利用Cytoscape 3.7.2進行交集靶點的GO.BP富集分析并篩選與OF密切相關的結果,主要涉及調節炎癥反應、激素代謝及細胞周期等生物過程。

2.5 KEGG分析

使用R軟件對34個靶點基因進行KEGG分析,共得到67個結果,主要涉及與破骨分化、炎癥反應、激素代謝密切相關的通路。篩選得到相關信號通路共有22條,詳見表3。

表3 富集的信號通路

2.6 Micro-CT及HE染色檢測龜板對OF模型大鼠骨缺損愈合的影響

如圖1所示,micro-CT結果提示龜板可有效治療大鼠骨質疏松性椎體骨折骨缺損,HE染色結果顯示龜板干預4周后可有更多骨形成,促進OF大鼠椎體骨折骨缺損愈合。

圖1 龜板干預4周后micro-CT和HE染色結果

2.7 CCK8檢測龜板對HPBMs增殖的影響

通過CCK8法檢測發現,龜板水提液濃度在不超過10 μg/mL的情況下對HPBMs無細胞毒性,見圖2。

圖2 CCK8 檢測結果

2.8 TRAP染色鑒定龜板對HPBMs破骨分化的影響

在不影響HPBMs增殖的相應濃度龜板水提液干預下,發現隨著龜板水提液濃度的增加,成熟破骨細胞的數量明顯減少(圖3),差異具有明顯的統計學意義(P<0.000 1),這證明龜板能夠抑制RANKL誘導的HPBMs破骨分化。

圖3 TRAP染色分析及量化

3 討論

3.1 活性成分、靶標與PPI網絡分析

通過對龜板-活性成分-靶標-骨質疏松性骨折網絡圖進行分析,發現龜板6個活性成分分別調控34個靶點影響其對骨質疏松性骨折的治療機制。如血漿苯丙氨酸(Phenylalanine)濃度升高可能會對骨骼狀況有不利影響,降低骨強度,增加骨折的風險[14]。蘇氨酸(Threonine)是AKT(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)的蛋白底物,活化的AKT磷酸化蘇氨酸等多種底物參與調節成骨、破骨細胞信號轉導中發揮重要作用的PI3K/AKT通路,影響成骨、破骨細胞的增殖、分化及凋亡,進而影響骨密度[15]。碳酸鈣等礦物元素是機體骨代謝平衡的重要底物,可增加骨鈣含量和骨密度,對OF有較好的防治作用[16]。

經PPI網絡篩選后得到度值位列前三的作用靶點為FOS、TNF、BDNF,推測它們可能在龜板治療OF過程中起到關鍵作用。FOS是c-fos基因轉錄產物編碼的蛋白,在調控細胞分裂、增殖、分化、凋亡等方面具有重要作用[17]。FOS與破骨細胞關系密切,FOS表達受抑制時破骨細胞數量隨之減少[18]。此外,FOS可通過影響RANKL-RANK介導的破骨細胞生成信號傳導途徑,抑制破骨細胞生成[19]。因此,FOS對調節骨折愈合骨形成和骨吸收起著重要作用[20]。TNF與炎癥反應密切相關,可誘導M-CSF的表達,NF-κB因子可被其激活進而啟動RANKL誘導的破骨細胞形成過程,增強骨吸收[21]。BDNF(腦源性神經營養因子)與骨的發育有著密切的聯系,BDNF能促進破骨細胞增殖分化[22]。另外,BDNF和IGF-1具有協同作用,它們共同調節ERK/p38 MAPK通路活性,促進軟骨細胞增殖和分化[23]。同時,有研究顯示BDNF基因可能通過MAPK通路調控成骨分化[24]。

3.2 GO和KEGG分析

GO分析結果所反映的內容類似于PPI網絡規律,多涉及炎癥反應、激素代謝和細胞周期(如破骨細胞分化)的調節。而KEGG分析結果反映的內容也印證了PPI網絡拓撲學分析及GO分析結果所展現的規律。例如,TNF信號通路的相關研究表明,炎性因子TNF-α可促進RANKL表達,誘導破骨細胞形成[21]。MAPK信號通路可通過促進骨保護素(OPG)表達[25],進而與RANK競爭性結合RANKL,最終導致破骨細胞的凋亡[26];Estrogen(雌激素)信號通路可以協同Wnt等多條信號通路共同調控成骨細胞和破骨細胞的增殖、分化和凋亡[27]。

3.3 體內外實驗分析

近年來對龜板抗OF的研究越來越多,針對其起效機制的研究也主要集中于促進BMSCs成骨分化方面[5],對于龜板影響破骨分化的機制鮮有報道。而本文通過網絡藥理學研究結果發現,對破骨分化的調節可能是龜板抗骨質疏松性骨折的重要機制。為了驗證網絡藥理學研究結果的可靠性,本研究開展了動物實驗,證實龜板可有效治療OF模型大鼠的骨缺損,并且通過體外實驗首次探究了龜板干預下的OF患者HPBMs表型,發現龜板能顯著抑制HPBMs破骨分化。

綜上所述,本研究結果提示龜板可能通過多種化合物、靶點和通路調節炎癥反應、激素代謝及細胞周期來治療OF,其中抑制破骨分化可能是龜板抗OF的重要機制。