基于網絡藥理學和動物實驗探討桃紅四物湯抗缺血性腦卒中的分子機制

王藝霖，孟祥國，葉宇航，胡霞敏*（1.上海中醫藥大學研究生院，上海 010；.上海健康醫學院，上海 0118；.上海理工大學，上海 0009）

缺血性腦卒中，中醫稱之為中風，是指由于腦的供血動脈（頸動脈和椎動脈）狹窄或閉塞、腦供血不足導致的腦組織壞死的總稱[1]，具有高發病率、高死亡率和高致殘率等特點[2]。目前臨床上被FDA認證的治療方法只有靜脈溶栓及動脈取栓[3]，其目的是迅速恢復缺血區的血流，挽救缺血半暗帶的神經元，緩解腦組織因缺血缺氧引起的神經功能損傷[4]，但由于治療時間窗狹窄限制了其在臨床上的應用。

《內經》有對中風病病機進行論述：情志失調，血逆瘀于腦，是中風病發生的根本機制[5]。桃紅四物湯（Taohong Siwu decoction，THSWD）是《醫宗金鑒》記載的經典名方，由桃仁、紅花、當歸、川芎、白芍、熟地黃六味藥材組成[6]。其在四物湯補血養血的基礎上，加入活血祛瘀的桃仁及活血通經的紅花，使此方養血而不滯血，活血而不破血，補中有行，破中有收，六藥合用，達到活血行氣、扶正祛邪之功效[7]。臨床表明，桃紅四物湯對缺血性腦卒中有明顯的治療作用[8]，但其機制有待進一步闡明。本研究通過網絡藥理學及實驗驗證探討桃紅四物湯治療腦卒中的物質基礎及可能的分子機制，為后續實驗研究提供研究思路。

1 材料

1.1 實驗動物

C57BL/6 小鼠50 只（雄性，SPF級，浙江維通利華實驗動物技術有限公司，6～8周，No：20220923Abzz0619000896），飼養于上海健康醫學院實驗動物中心，進食進水自由，動物實驗通過上海健康醫學院實驗動物倫理委員會批準（倫理批件號：20220621）。

1.2 試藥

2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，上海阿達瑪斯試劑有限公司，貨號：45959B），兔抗PI3K（貨號：4228S）、AKT（貨號：4060S）、白細胞介素（IL）-1β（貨號：12242S）、IL-18（貨號：57058S）（Cell Signaling Technology公司），β-actin（美國 Proteintech Group 公司，貨號：81115-1-RR），HRP 標記的山羊抗兔 IgG HRP 標記的山羊抗小鼠 IgG（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：GB23301）。

桃紅四物湯組方：川芎8 g（批號：230513），桃仁9 g（批號：2023062101），當歸12 g（批號：230902），熟地黃15 g（20230707），紅花9 g（批號：20230717-1），白芍10 g（批號：230717）（上海中醫藥大學附屬曙光醫院）。根據小鼠與人體表面積比值系數減壓濃縮至0.36 g·mL－1。

1.3 儀器

體視顯微鏡（日本Olympus公司），EPS-600 數顯式穩壓穩流電泳儀、Tanon 4800 系列全自動化學發光/熒光圖像分析系統（上海天能科技有限公司），多普勒激光散斑血流儀（上海瑞沃德有限公司）。

2 方法與結果

2.1 網絡藥理學

2.1.1 桃紅四物湯核心成分-核心靶點-通路網絡的構建 應用TCMSP和Uniprot數據庫，以口服生物利用度≥30%，分子類藥性≥0.18為標準篩選獲取桃紅四物湯活性成分及活性成分的預測靶點，再通過GeneCards、PharmGkb、OMIM、TTD、Drugbank 5個疾病數據庫獲取缺血性腦卒中相關的疾病靶點，兩者取交集，將活性成分和交集靶點導入Cytoscape 3.9.0構建“活性成分-作用靶點”網絡獲得9個核心化合物：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、豆甾醇（stigmasterol）、黃芩素（baicalein）、楊梅酮（myricanone）、β-胡蘿卜素（beta-carotene）、常春藤皂苷（hederagenin）。交集靶點上傳至STRING數據庫，篩選score＞0.95的靶點導入Cytoscape構建PPI網絡，獲得12個潛在核心靶點，分別為MAPK14、RELA、TNF、TR53、MAPK1、MYC、FOS、HSP9AA1、ESR1、AKT1、HF1A、CTNNB1。利用使用R語言軟件的R包“ClusterProfiler”對交集靶點進行通路富集分析，選取前8條通路，運用Cytoscape軟件構建“核心成分-核心靶點-通路”網絡圖，見圖1。PI3K/AKT信號通路是調節細胞遷移、增殖、分化和凋亡的重要途徑，為經典的抗凋亡/促生殖的信號傳導通路之一，是預防缺血性腦卒中的關鍵級聯信號通路，其通過調節線粒體障礙、細胞凋亡、細胞自噬、氧化應激和炎癥反應等多種機制在抗腦卒中中發揮重要作用[9]。由圖1可發現核心靶點AKT1、RELA、TP53、MYC、HSP、MAPK1涉及PI3K/AKT信號通路。

圖1 “核心成分-核心靶點-通路”網絡圖Fig 1 Core compound-core target-pathway network

2.1.2 GO功能富集分析 通過R包“ClusterProfiler”對交集靶點GO功能富集分析獲得2823個GO功能條目，主要涉及氧化應激、炎癥反應等生物過程（BP）。交集靶點在BP、細胞組分（CC）、分子功能（MF）中顯著富集的前10個GO條目，見圖2。研究發現，神經炎癥在缺血性腦卒中中發揮重要作用[10]。腦缺血后繼發性損傷的機制可能是由于缺血性腦卒中后腦內炎癥的產生，炎癥反應加快了缺血性損傷的形成并影響神經元死亡和神經組織再生。提示桃紅四物湯發揮腦保護作用可能與抗炎有關。

圖2 桃紅四物湯與缺血性腦卒中疾病GO富集分析圖Fig 2 GO functional enrichment analysis of THSWD in treating ischemic stroke

2.1.3 分子對接 將鑒定篩選得到的9個潛在核心化合物作為配體，將涉及PI3K/AKT信號通路的核心靶點蛋白和PI3K蛋白作為受體進行分子對接。首先，從TCMSP數據庫下載核心成分的結構并以mol2格式保存。然后從RCSB（PDB）數據庫下載核心靶點的配體結構，使用Autodock對接每個成分和配體。結合能＜－5 kcal·mol－1的對接分數表明該化合物與靶點之間具有良好的結合活性，結合能越低，說明結合活性越好。結果表明，大部分核心成分與PI3K/AKT相關蛋白具有較好的結合能力，進一步驗證了桃紅四物湯可能通過調節PI3K/AKT信號通路防治缺血性腦卒中，見表1。將結合能較低的對接結果進行可視化，見圖3。

表1 分子對接結合能Tab 1 Binding energy of molecular docking

圖3 分子對接結果可視化Fig 3 Visualization of molecular docking results

圖4 激光多普勒血流圖Fig 4 Laser Doppler flow chart

2.2 動物實驗驗證

2.2.1 動物分組及給藥 將小鼠適應性喂養7 d后，隨機分為假手術組（Sham組），模型組[腦缺血再灌注損傷（MCAO/R）組]，桃紅四物湯低、中、高劑量組，每組10只。于飼養第8日開始給藥，假手術組、模型組給予蒸餾水，10 mL·kg－1灌胃；桃紅四物湯低、中、高劑量組分別給予桃紅四物湯煎煮液0.9、1.8、3.6 g·kg－1灌胃。

2.2.2 MCAO/R模型小鼠的構建 小鼠飼養第11日，除空白組外，其余各組均依據Zea-Longa線栓法[11]的操作步驟建立MCAO/R小鼠模型，采用激光多普勒血流儀分別于缺血前、缺血后5 min和再灌注后5 min監測小鼠腦血流情況，與缺血前相比，缺血后的小鼠左腦血流明顯缺失，再灌注后大部分血流恢復，表示小鼠造模成功?？瞻捉M10 只，模型組8只，桃紅四物湯低、中、高劑量組各9 只造模成功，分別于術后24、48、72 h分別進行神經功能學評分，評分后采用二氧化碳氣體麻醉處死，每組3只小鼠斷頭取腦，－20℃冰箱中保存，待TTC染色；每組3只小鼠同法取右側大腦組織置液氮中速凍固定，－80℃冰箱中保存，供Western blot檢測用。

2.2.3 桃紅四物湯對MCAO/R小鼠神經功能損傷的影響 參照Zea-Longa評分標準和mNss法分別于缺血1.5 h再灌注24、48 和72 h對神經功能缺損評分。Longa法評分標準：0分，無神經功能缺損；1 分，對側前爪不能完全伸展；2 分，向對側自發性旋轉；3分，向對側傾倒；4 分，意識喪失。mNSS法評分項目包括運動實驗、感覺實驗、平衡木實驗、反射喪失和不正常運動4項，評分從0～18 分，0 分為正常無缺陷，18 分為最大缺陷。結果顯示：與 Sham組相比，模型組神經功能評分明顯增高，主要表現為提尾時右側前爪不能完全伸直，置于水平桌面時，向患側轉圈，偏癱等癥狀；與模型組相比，桃紅四物湯中、高劑量組能明顯減輕神經功能障礙，見圖5。

圖5 桃紅四物湯對C57BL/6小鼠MCAO/R Longa評分和mNss評分的影響Fig 5 Effect of THSWD on Longa score and mNss score of MCAO/R mice

2.2.4 桃紅四物湯對MCAO/R小鼠腦梗死體積的影響 TTC是一種脂溶性光敏感復合物，常用來染色檢測哺乳動物組織的缺血梗死，可使正常腦組織染成紅色，缺血區因組織壞死呈白色。?。?0℃冰箱中腦組織迅速自視交叉點前后1 mm厚度冠狀面切片（約5片），置于1%TTC溶液中，37℃避光孵育30 min，4%多聚甲醛溶液4℃固定過夜，掃描拍照。用Image J軟件計算腦梗死體積。腦梗死體積（%）＝左側腦半球梗死范圍/（左側腦半球總范圍＋右側腦半球總范圍）×100%。結果顯示，與Sham組相比，模型組腦梗死體積明顯升高；與模型組相比，桃紅四物湯中、高劑量組腦梗死體積明顯減小，且高劑量組腦梗死體積減小最明顯，表明桃紅四物湯可有效減少小鼠MCAO/R后腦梗死體積，見圖6。

圖6 桃紅四物湯對小鼠腦梗死體積的影響Fig 6 Effect of THSWD on the infarct volume

2.2.5 桃紅四物湯對MCAO/R小鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達的影響 網絡藥理學及分子對接技術提示桃紅四物湯可能通過激活PI3K/AKT信號通路調節神經炎癥發揮腦保護作用。用Western blot方法對腦組織中PI3K、AKT蛋白表達進行檢測。取Sham組、MCAO/R組及藥效最為明顯的桃紅四物湯高劑量組左半腦組織，加入RIPA裂解液勻漿，提取蛋白。蛋白樣本經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉后加入PI3K、AKT、β-actin抗體，4℃孵育過夜；加入對應山羊抗兔/鼠抗體，孵育2 h，使用ECL發光系統顯像，使用Image J軟件進行灰度值（DPI）分析。結果顯示，與Sham組比較，模型組小鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達均降低；與模型組比較，桃紅四物湯組小鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達升高（見圖7）。

2.2.6 桃紅四物湯對MCAO/R小鼠神經炎癥的影響

基于以上分析結果，檢測了腦組織中IL-1β、IL-18炎性因子的蛋白表達。結果顯示（見圖8），桃紅四物湯可明顯降低小鼠促炎因子IL-1β、IL-18的水平。

圖8 桃紅四物湯對IL-1β、IL-18蛋白表達的影響Fig 8 Effect of THSWD on the expression of IL-1β and IL-18 protein

2.2.7 統計學分析 本實驗采用 GraphPad Prism 9 軟件對數據進行統計學分析。采用單因素方差，后用Turkey法分析兩組間差異分析進行統計學分析，用均數（mean）±標準誤（SEM）表示，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 討論

中醫認為中風是由于氣血逆亂，腦脈痹阻或血溢于腦所致。因此，活血理氣是其基本治療原則。桃紅四物湯方中桃紅、紅花為主，主力活血化瘀；熟地、當歸養血；白芍補血；川芎活血行氣，是活血化瘀的經典名方。本研究使用網絡藥理學及分子對接技術初步探討了桃紅四物湯抗缺血性腦卒中的機制，利用TCMSP數據庫共獲取到桃紅四物湯的成分43個，治療缺血性腦卒中的靶點179個，進一步篩選獲得桃紅四物湯干預缺血性腦卒中的主要成分可能為槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、黃芩素、楊梅酮、β-胡蘿卜素、常春藤皂苷，核心靶點可能為AKT1、

RELA、TP53、MYC、HSP、MAPK1、TNF、MAPK14等。槲皮素[12]、木犀草素[13]、β-谷甾醇[14]、山柰酚[15]、黃芩素[16]、豆甾醇[17]、常春藤皂苷[18]有相關抗腦卒作用的文獻報道，AKT1、TNF、MAPK1、MAPK14等核心靶點與炎癥反應的調節密切相關，這與現代藥理學研究發現桃紅四物湯具有抗炎的藥理作用一致。

GO分析和KEGG分析富集結果顯示桃紅四物湯抗缺血性腦卒中的潛在靶點涉及對脂多糖的反應、氧化應激等多種生物學過程，涉及脂質和動脈粥樣硬化通路，PI3K/AKT信號通路等。本研究從以上分析中選取了PI3K/AKT信號通路相關蛋白，并利用分子對接技術將核心成分與PI3K/AKT信號通路相關蛋白進行分子對接，發現核心成分與PI3K/AKT信號通路相關蛋白具有較好的結合能力。由于炎癥反應和PI3K/AKT信號通路在缺血性腦卒中的發生發展中起重要作用，所以我們可以推斷桃紅四物湯抗缺血性腦卒中的機制可能與激活 PI3K/AKT多條信號通路和調節神經炎癥有關。

在小鼠MCAO/R模型上對桃紅四物湯抗腦缺血再灌注損傷的保護作用進行驗證，結果發現，桃紅四物湯可明顯降低MCAO/R模型小鼠的神經功能評分，改善神經功能障礙；TTC染色顯示桃紅四物湯可顯著縮小腦梗死體積，表明其對缺血性腦卒中有較為顯著的防治作用。同時，根據網絡藥理學及分子對接結果的提示，我們對PI3K/AKT信號通路相關蛋白和炎癥因子IL-1β、IL-18表達水平進行了檢測。結果顯示桃紅四物湯可明顯提高PI3K、AKT的蛋白表達，降低IL-1β、IL-18的表達。以上結果表明桃紅四物湯能激活PI3K/AKT信號通路，減輕神經炎癥，發揮抗腦缺血再灌注作用。

綜上，本研究探討中醫傳統藥方桃紅四物湯抗腦卒中可能的作用機制。結合現代中藥網絡藥理學及分子對接技術對桃紅四物湯抗腦卒中的關鍵成分及作用靶點進行了推測，并選擇了其中較為重要的PI3K/AKT信號通路進行了初步的驗證，提示桃紅四物湯作用機制與激活PI3K/AKT信號通路，減輕神經炎癥有關，該研究結果對豐富桃紅四物湯的現代研究，進一步探索桃紅四物湯防治缺血性腦卒中的作用機制提供了線索，對其二次開發具有重要意義。但本研究僅對網絡藥理學推測結果中的PI3K/AKT通路進行了驗證，因此要闡明桃紅四物湯抗腦卒中的作用機制仍需更深入的研究。