連翹種子品質檢驗及質量分級標準研究

鄒晨鑫，彭毅丹，劉亦欣，譚啟怡，顏永剛，孫靜，楊新杰（陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046）

連翹Forsythiasuspensa（Thunb.）Vahl.為木犀科連翹屬落葉灌木，早春先花植物，具觀賞價值，為重要的園林綠化植物[1]。在中醫臨床中以其干燥果實作為藥用，通常在果實剛成熟還帶有綠色時進行采收，通過蒸熟或者沸水煮片刻后曬干，將其稱為“青翹”，在果實成熟后采收曬干，稱之為“老翹”。連翹始載于《神農本草經》[2]，其性味苦、微寒，歸肺、心、小腸經，具有清熱解毒、散結消腫、疏散風熱等功效，主治癰疬，風熱感冒，溫病初起，高熱煩渴，神昏發斑，熱淋澀痛等病癥[3]，用途較廣。連翹果實中含黃酮類、苯乙烷類、揮發油類等成分[4]?，F代研究表明，連翹具有抗炎[5]、抗病毒[6]、抗菌[7]、抗氧化、解熱[8]、抗內毒素、抗腫瘤[9-10]、調節免疫[10]等作用。

連翹的藥材商品主要來源于野生資源，被列為國家計劃管理品種[11]。近年來隨著連翹的觀賞和藥用價值的不斷被開發利用，野生資源的保有量難以滿足市場需求，尋求人工播種育苗為最簡單有效的途徑之一[12]?？茖W的種植栽培是確保藥材品質的一個重要措施，優質的種子是進行連翹種植栽培的重要保證，這也是對連翹種子做質量標準評價的重要原因。制訂出連翹種子的質量標準，可以為連翹種子的篩選和使用提供參考價值。

有文獻對連翹種子品質進行過相關的研究，但所收集的連翹種子范圍較小，制訂的標準較低[13-14]。此次研究過程中擴大了連翹種子的范圍，采集16份來自全國連翹主產區的連翹種子，評價連翹種子品質，進行種子的質量分級研究，以期為連翹種子品質標準的制訂提供參考依據。

本研究主要對種子形態色澤、千粒重、含水量、生活力、發芽率和發芽勢進行測定。在實驗過程中使用到的方法有四分法測量凈度、徒手減半法測量千粒重、TTC法測定種子生活力、高溫烘干法測定含水量以及水培法測定種子發芽率。以上實驗方法在種子質量標準制訂中較為經典，被廣泛用于種子相關實驗，具有科學性。在進行數據處理時運用K-均值聚類法和統計學分析來對數據進行處理，K-均值聚類法的優點在于對大型數據集也是簡單高效，時間復雜度、空間復雜度低。最終參考綜合影響因素和實際情況在所得數據的基礎上進行連翹種子的質量分級標準的制訂。

1 材料與方法

1.1 儀器

FA2104萬分之一電子分析天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；MGC-300H人工氣候培養箱、DHG-9030電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 試藥

2，3，5-氯化三苯四氮唑（TTC，含量≥98%，福州飛凈生物科技有限公司）。于2020年9月下旬選擇陜西、山西、河北、河南、山東等五省種植基地對連翹種子進行收集，用于質量檢驗方法評價和質量標準研究。種子編號和具體產地見表1。所有的種子都通過陜西中醫藥大學中藥標本館王繼濤高級實驗師鑒定，均為木犀科植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl.的種子。

表1 連翹種子來源Tab 1 Source of Forsythia suspensa seeds

1.3 方法

1.3.1 凈度分析 參照GB/T3543.2農作物種子檢驗規程扦取樣品，采用四分法[15]。取種子近5 g，置于桌面上分離凈種子。使用電子天平進行精密稱重，并且計算凈種子含量的百分比，所有樣品重復稱量3次，最終取其平均值。凈度公式如式（1）所示。

1.3.2 千粒重的測定 將凈種子混合均勻，采用徒手減半法[16-17]從樣本中取250粒取4份，共1000粒為1組，用分析天平稱重，重復3次，取平均值。

1.3.3 含水量的測定 采用高溫烘干法[18]，稱取0.5 g種子放入干燥培養皿中，放置在溫度達（131±2）℃的恒溫烘箱內烘1 h后取出放入干燥器內冷卻后稱重。計算種子含水量，公式如式（2）所示。

式中M1為培養皿質量，M2為培養皿及樣品烘干前質量，M3為培養皿及樣品烘干后質量。

1.3.4 生活力的測定 采用TTC法測定[19]連翹種子的生活力，活的種子具有一定的呼吸作用，而呼吸作用產生的脫氫酶可使無色的氧化態TTC還原成紅色物質，該方法簡便易行，準確率高，是測定種子生活力的常用方法。使用0.5%的TTC溶液對連翹種子進行染色，拿刀片將種子縱切成兩瓣取其中一瓣于常溫染色12 h后倒出TTC溶液并使用清水沖洗種子，觀察種子染色情況，若種子大部分或者全部被染紅說明種子有生活力。

1.3.5 發芽率測定 從收集的連翹果實中收取種子，置于干燥處貯藏。把樣品種子置于培養皿中并加自來水浸泡2 h，取沉于水中的飽滿種子，使用1%高錳酸鉀溶液消毒30 min，最后使用自來水、蒸餾水依次沖洗備用。將培養皿、鑷子以及濾紙放入高壓滅菌鍋中滅菌，在培養皿的底部放2層劃有網格線的濕濾紙作為發芽基質，將處理好的連翹種子放入培養基中，用滴管定期補清水，使種子保持濕潤狀態，連翹種子以胚根露白為發芽標準[18]。

每個培養皿（d＝90 mm）放入50粒種子，每組實驗重復3次，均在人工氣候培養箱內進行培養，培養箱中溫度為25℃，濕度為60%，光照強度均為12 000 lx[14]。記錄種子發芽情況，觀察14 d后，統計種子的總發芽數，計算發芽率和發芽勢，公式如式（3）所示。發芽勢是發芽期間日發芽數達到最大值，發芽的種子數占供試種子數的百分率。

1.3.6 種子基本特征鑒定 將健康飽滿的種子置于桌面上，使用游標卡尺測量30粒種子的長和寬，并觀察種子顏色、形態及表面特征。

2 結果與分析

2.1 種子凈度

從表2、3可以看出不同地區的連翹種子凈度差異較大，分布在31.86%～94.60%，平均值為60.47%。由此可知，不同地區連翹種子的凈度差別較大，含果皮、果梗、短枝、石子等雜質，其中河北省保定市安國市河西村（Z10）的連翹種子凈度最高，陜西省商洛市洛南縣靈口鎮（Z3）的連翹種子凈度最低。主要原因是不同產地對連翹種子采集加工處理的方式不同，有些產地種子加工處理較為粗糙，導致種子凈度過低。

表2 連翹種子質量檢測結果分析Tab 2 Quality analysis of Forsythia suspensa seeds

表3 16批連翹種子質量檢測結果Tab 3 Quality of 16 batches of Forsythia suspensa seeds

2.2 千粒重

來自全國主產區的16份連翹種子的千粒重在2.12～3.81 g，平均值為2.88 g。其中千粒重最小的是來自陜西延安市黃龍縣（Z14）的種子，河南洛寧縣（Z13）的種子的千粒重最大（見表2、3）。

2.3 含水量

來自全國主產區的16份連翹種子的含水量在2.72%～8.45%，平均含水量為4.82%。其中含水量最低為2.72%，來自河南省洛陽市嵩縣（Z12），河北省邯鄲市涉縣（Z11）的含水量最高為8.45%（見表2、3）。

2.4 種子活力

來自全國主產區的連翹種子之間的生活力有很大的區別，本次實驗16份連翹種子的生活力在23.33%～90.67%，平均生活力為55.54%。其中生活力最低的為陜西省寶雞市眉縣營頭鎮（Z15）的種子，最高的為河北省保定市安國市河西村（Z10）的種子。生活力測定結果區別較大的原因主要與實驗所選用的染色方法、染色時間、染色溫度以及染色試劑的濃度等有關[16]，故本次實驗測定各產地連翹種子生活力時，統一測定標準，減少誤差（見表2、3）。

2.5 發芽率與發芽勢

來自全國主產區的16份連翹種子發芽率和發芽勢之間有著很大的區別，發芽率變化范圍為0～92.00%，發芽勢的變化范圍是0～36.00%。其中最高的為河北省保定市安國市河西村（Z10）的種子發芽率高達92.00%；陜西省商洛市洛南縣石門鎮、陜西省商洛市山陽縣色河鋪鎮、陜西省商洛市商南縣湘河鎮、河南省洛陽市嵩縣白云山、河南省洛寧縣神靈寨和陜西省寶雞市眉縣營頭鎮的種子發芽率均未達10.00%，其中陜西寶雞市眉縣營頭鎮（Z15）的種子發芽率為0，為16份樣本中最低。河北省保定市安國市河西村（Z10）的種子發芽勢最高達36.00%，陜西省寶雞市眉縣營頭鎮（Z15）的種子發芽勢最低為0。通過對產地分析的比較可以發現，各個連翹產地的生態環境和氣候環境都有所差異，會導致連翹種子的成分和水分的含量不同，經研究發現河北省的連翹種子的發芽率普遍高于其他省份。

2.6 種子基本特征鑒定

連翹種子扁平，橢圓形，一側具薄翅，且翅不規則，使連翹一端呈三角形，一端呈半圓形；成熟種子黃棕色或黑褐色，飽滿，氣微香，質堅脆；種子長5.14～6.36 mm，寬1.56～2.34 mm。

2.7 種子質量分級標準的制訂

2.7.1 K-均值聚類分析 通過SPSS 20.0軟件以及Excel統計數據分析對連翹種子的五項數據進行K-均值聚類分析并分為三級，最終類中心值見表4。16份連翹種子中1級有1個（Z10），2級有9個（Z2、Z5、Z7、Z12、Z13、Z14、Z15），3級有5個（Z1、Z3、Z4、Z6、Z8、Z9、Z11），具體見圖1和表4。

圖1 連翹種子聚類分析樹狀關系圖Fig 1 Forsythia suspensa seeds cluster analysis

表4 K-均值聚類最終類中心(n＝16)Tab 4 K-mean cluster final class center (n＝16)

2.7.2 種子質量分級標準的制訂 通過K-均值聚類分析，初步將所測得的種子分為三類，根據分析數據最后確定在連翹種子的分級標準過程中，把發芽率和生活力作為一級參數，因為種子是否具有活性和發芽率直接關系到連翹的產量，將種子的凈度、含水量以及千粒重作為二級參數。研究其他影響因素和K-均值聚類分析，并參考實際情況，制訂出連翹種子質量分級標準（見表5），在分級標準中一級可作為品質良好的種子，可在生產過程中優先考慮。二級為質量合格的種子，可在栽種生產中可選擇性使用。三級為未達標的種子，不建議在種植栽培過程中使用此類種植，否則收益不佳。

表5 連翹種子質量分級標準Tab 5 Quality classification standards of Forsythia suspensa seeds

3 結論

3.1 不同產地連翹種子品質檢驗結果

不同產地的連翹種子各項指標之間有較大的差異，種子形態長5.14～6.36 mm，寬1.56～2.34 mm。發芽率在0～92.00%，生活力在23.33%～90.67%；平均生活力為55.54%。凈度在31.86%～94.60%，平均值為60.47%；千粒重在2.12～3.81 g，平均值為2.88 g。含水量在2.72%～8.45%，平均含水量為4.82%。河北省保定市安國市河西村連翹種子的凈度、生活力、發芽率及發芽勢較高，陜西寶雞市眉縣營頭鎮連翹種子的各項指標值相對較低，其連翹種子的發芽率為0，可能與其種子為陳舊種子或存儲不當有關。

3.2 連翹種子質量初步分級標準

通過K-均值聚類分析，可將不同產地連翹種子初步分為三類，其中一級為品質良好的種子，二級為質量合格的種子，三級為未達標的種子。通過分析可知，影響連翹種子質量的主要因素有發芽率、發芽勢、生活力、種子凈度、千粒重、含水量。根據國際種子的分級標準，結合連翹生產的現狀，綜合考慮選定發芽率、生活力、千粒重、水分、凈度作為連翹種子質量分級標準，初步制訂了連翹種子等級規定值。

4 討論

通過試驗結果可以發現來自不同產地的連翹種子的質量存在較大差異。凈度差異較大是因為種子中含果皮、果梗、短枝、石子等雜質，不同產地的連翹種子因采收時間及加工方法不同導致所含雜質有差異。千粒重和含水量的差異可能是由于不同產地間的氣候及生態環境不同，導致種子的顆粒大小以及飽滿度有較大差異。其中作為種子質量最重要參數發芽率和生活力在不同產區之間也有很大的差異，這對本次試驗的最終目的即制訂連翹種子質量標準起到主要影響。本次試驗連翹種子的發芽率在0～92.00%；生活力在23.33%～90.67%。分析其發芽率與生活力的差異大與地理分布、氣候環境、采收時節以及貯藏過程都有著很大的關系。

在中醫藥臨床應用中連翹以果實入藥，具有清熱解毒、消腫散結等功效；其藥材商品主要來源于野生資源。但是近年來隨著對連翹的不斷研究開發，連翹的野生資源保有量難以滿足市場需求，所以人工栽培種植變為連翹藥材的主要來源之一。目前市場上并沒有連翹種子統一的質量標準，市售連翹種子中常常出現以次充好、新老種子混合出售等情況，從而導致連翹種子質量混亂，嚴重影響連翹藥材的種植。因此對連翹種子進行品質檢驗和質量標準分級研究尤為必要，是連翹藥材規范化生產亟待解決的重要問題。

本實驗嚴格按照《農作物種子檢驗規程》及有關種子分級方法要求，結合連翹種子的自身特點進行連翹種子質量的初步研究，所提出的分級標準可供有關部門制訂通用標準時參考。