基于網絡藥理學和實驗驗證探討藤黃酸抑制膀胱癌的作用及機制

陳瑞琦，熊洪，劉宏偉（廣東醫科大學附屬醫院泌尿外科研究室，廣東 湛江 524001）

膀胱癌（bladder cancer，BC）是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，是世界上第十大常見癌癥[1]。數據顯示，近年來我國膀胱癌的總發病率呈上升趨勢[2]。膀胱癌根據其浸潤深度可分為肌層浸潤性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC）和非肌層浸潤性膀胱癌（non muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）[3]?，F階段，新輔助化療聯合根治性膀胱切除術是目前治療MIBC的標準方案，然而部分無法接受手術的患者只能采用化療、放療等方法，在治療過程中會出現較大的不良反應[4]。經尿道膀胱腫瘤切除術聯合術后膀胱灌注化療或免疫治療是NMIBC的常規治療方案之一，但是治療效果有限，具有很高的復發率[5]。因此，有必要尋找具有更好療效且不良反應較小的治療膀胱癌的潛在藥物。

研究發現，中藥在抗腫瘤方面具有多靶點、不良反應小、不易產生耐藥性等特點[6]。藤黃是藤黃科植物藤黃（GarciniahanburyiHook.F.）分泌出的樹脂，具有治療癰疽、損傷出血、牙疳蛀齒等作用[7]。藤黃酸（gambogic acid，GA）是從藤黃中提取的主要化合物之一，具有抗氧化、抗炎等多種功能。研究發現，GA可抑制多種腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲能力，并促進其凋亡[8]。網絡藥理學是建立在藥物-基因-疾病的多層次網絡基礎上的新興學科，可以從整體上預測藥物的作用靶點[9]。本研究通過網絡藥理學篩選GA抑制膀胱癌的潛在作用靶點，通過細胞實驗驗證，探討GA抑制膀胱癌的作用及可能機制，為篩選出膀胱癌的潛在輔助治療藥物提供理論基礎。

1 材料

1.1 數據庫與軟件

PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫，PharmMapper（http：//www.lilabecust.cn/pharmmapper/）數據庫，UniProt（https：//www.uniprot.org/）數據庫，GeneCards（https：//www.genecards.org）數據庫，STRING（https：//cn.string-db.org/），David（https：//david.ncifcrf.gov）數據庫，數據分析軟件Cytoscape 3.9.1，在線網站Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），在線網站微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）。

1.2 材料

人膀胱癌UM-UC-3細胞（中科院上海細胞庫），DMEM培養基（貨號：C11995500BT）、胰蛋白酶（貨號：25200072）（美國 Gibco 公司），藤黃酸（成都植標化純生物技術有限公司，貨號：PCS0866），Annexin V-FITC凋亡分析試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），胎牛血清（貨號：Z7185FBS-500）、ECL-Western blot化學發光液（貨號：310208）（美國 Zeta Life 公司），PI3 Kinase（PI3K）兔多克隆抗體、AKT 鼠單克隆抗體、Phospho-AKT（p-AKT）鼠單克隆抗體（美國Proteintech公司），Phospho-PI3 Kinase（p-PI3K）兔多克隆抗體（美國GeneTex公司），Cell counting Kit-8試劑盒（日本同仁化學研究所），Transwell小室（美國Corning公司），基質膠（廣州市沃德生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 獲取GA的作用靶點

在PubChem數據庫以“gambogic acid”為關鍵詞獲取GA 的3D結構式的sdf文件，將文件上傳至 PharmMapper 數據庫，得到GA作用靶點，再將靶點上傳至 UniProt 數據庫，通過ID mapping匹配靶點的基因名稱。

2.2 獲取膀胱癌的靶基因

以 “bladder cancer”為關鍵詞，在GeneCards數據庫檢索膀胱癌的相關靶基因。

2.3 獲取GA抑制膀胱癌的潛在靶基因

通過在線網站 Venny 2.1.0，取前兩步獲取的GA作用靶點和膀胱癌相關靶基因的交集，得到GA抑制膀胱癌的潛在靶基因。

2.4 蛋白互作網絡構建

將GA抑制膀胱癌的潛在靶基因上傳至 STRING數據庫，設置物種為“Homo sapiens”，最低互動分數要求＞0.400，隱藏網絡中斷開的節點，并將tsv數據文件導入Cytoscape 3.9.1分析，通過Betweeness Centrality算法得到潛在靶基因的中介中心性。

2.5 GO和KEGG分析

將得到的中介中心性最高的20個潛在靶基因上傳至 DAVID 數據庫，限制物種為“Homo sapiens”，選擇GO 生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF），KEGG 通路進行分析，將所得結果通過在線網站微生信進行可視化處理。

2.6 GA溶液的制備

將GA粉末配制成1000 μmol·L－1的GA水溶液，避光儲存于－20℃冰箱，實驗時稀釋成實驗所需濃度。

2.7 細胞培養和分組

將UM-UC-3細胞接種于培養皿，使用DMEM完全培養基（10%濃度胎牛血清），置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，待細胞生長至80%以上時傳代。實驗時按照GA藥物濃度（0、40、80、160 μmol·L－1）分為4組，0 μmol·L－1組為對照組。

2.8 CCK-8實驗

取對數生長期UM-UC-3細胞，接種于96孔板，每孔3×103個細胞，置于細胞培養箱中培養，24 h后棄舊培養基，分別加入含有不同濃度GA的培養基，每組設置3個復孔，繼續培養24、48、72 h，取出96孔板，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，避光孵育2 h后檢測各孔在 450 nm 波長處的光密度（OD）值，計算細胞增殖抑制率。增殖抑制率（%）＝（對照組OD值－實驗組OD值）/對照組OD值×100%。

2.9 細胞克隆形成實驗

取對數生長期UM-UC-3細胞，以每孔1×103個細胞接種于6孔板，24 h后棄舊培養基，分別加入含有不同濃度GA的培養基，10 d后棄培養基，用PBS清洗，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染液染色，沖洗、晾干后拍照，計算克隆形成數目。

2.10 細胞劃痕實驗

取對數生長期UM-UC-3細胞，接種于6孔板，待細胞生長濃度超過90%后用200 μL規格的移液槍頭劃痕，棄舊培養基，分別加入含有不同濃度GA的培養基，顯微鏡下隨機選取3個視野拍照，繼續培養24 h后取出，在相同位置拍照，用Image J軟件測量劃痕面積，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）＝（0 h劃痕面積－24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

2.11 Transwell遷移實驗

取對數生長期UM-UC-3細胞，接種于6孔板，待細胞完全貼壁后棄舊培養基，分別加入含有不同濃度GA的培養基，24 h后棄培養基，胰蛋白酶消化后用不含血清的DMEM培養基制成細胞懸液，調整細胞濃度，取200 μL細胞懸液（含4×104個細胞）加入上室，下室加入600 μL DMEM完全培養基，繼續培養24 h后取出小室，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染液染色，沖洗、晾干后隨機選取3個視野拍照，計算細胞遷移數。

2.12 Transwell侵襲實驗

用無血清DMEM培養基按8∶1的比例稀釋基質膠，取50 μL稀釋后的基質膠鋪于Transwell小室并放入培養箱，待基質膠凝固后取出，其余步驟同“2.1.1”項下Transwell 遷移實驗。

2.13 流式細胞術檢測細胞凋亡

取對數生長期UM-UC-3細胞接種于6孔板，待細胞完全貼壁后棄舊培養基，分別加入含有不同濃度GA的培養基，繼續培養24 h后取出，收集培養基和貼壁細胞，重懸，取1×106個細胞，PBS清洗，離心后棄PBS，使用195 μL Annexin V-FITC結合緩沖液制成細胞懸液并移入流式管，分別加入5 μL Annexin V和10 μL PI，避光孵育20 min，使用流式細胞儀分析。

2.14 Western blot 實驗

取對數生長期UM-UC-3細胞接種于培養皿，分別加入含有不同濃度GA的培養基，繼續培養24 h后棄培養基，PBS清洗，提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度，加熱變性，置于－20℃冰箱保存。SDSPAGE凝膠配制試劑盒配置凝膠，每孔上樣30 μg，經電泳、電轉、封閉、切膜后加入對應一抗（GAPDH 1∶10 000，FoxO1 1∶2000，AKT 1∶2000，p-AKT 1∶2000，PI3K 1∶500，p-PI3K 1∶500），置于4℃冰箱孵育過夜。次日取出條帶，洗膜3次后分別加入對應二抗，孵育1 h，洗膜3次，化學發光法曝光成像，Image J軟件統計分析蛋白相對表達水平。

2.15 統計學分析

使用 SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析，所有實驗重復3次，實驗數據以均數±標準差表示，兩組均數比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 GA抑制膀胱癌的潛在靶點

通過PubChem獲得GA的3D結構式（見圖1），通過PharmMapper數據庫和UniProt數據庫獲得有效靶點219個；通過GeneCards數據庫獲取膀胱癌相關基因11 618個。將兩者上傳至Venny 2.1.0，取交集，得到GA抑制膀胱癌的潛在靶點57個。

圖1 藤黃酸的3D結構式Fig 1 3D structural formula of gambogic acid

3.2 蛋白互作網絡構建和核心靶點分析

通過使用STRING數據庫，得到GA抑制膀胱癌潛在靶點的蛋白互作圖（見圖2），其中節點數量55個，邊數60條，平均節點度2.18，平均局部聚類系數為0.416，蛋白互作富集P值為0.007 48。Betweeness Centrality算法得到中介中心性最高的20個靶點，見表1。

表1 藤黃酸抑制膀胱癌的潛在靶點(前20)Tab 1 Potential targets of inhibition of bladder cancer induced by gambogic acid (Top 20)

圖2 藤黃酸抑制膀胱癌的潛在靶點的蛋白互作圖Fig 2 Protein-protein interaction diagram of the potential targets of inhibition of bladder cancer induced by gambogic acid

3.3 GO和KEGG分析

將中介中心性最高的20個靶點進行GO和KEGG通路富集分析，得到GO分析條目66條，其中包括維持中性粒細胞內穩態等26個BP；囊泡膜等17個CC；參與氧氣轉運等28個MF，見圖3；KEGG 通路富集分析顯示GA抑制膀胱癌可能與PI3K/AKT、FoxO1、HIF-1等信號通路相關，見圖4。通過查閱文獻得知FoxO1作為FoxO家族的成員可以抑制膀胱癌，故后續選擇FoxO1進行驗證。

圖3 藤黃酸抑制膀胱癌的20個潛在靶基因的GO富集分析Fig 3 GO enrichment analysis of 20 potential target genes which inhibit bladder cancer by gambogic acid

圖4 藤黃酸抑制膀胱癌的20個潛在靶基因的KEGG通路富集分析Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis of 20 potential target genes which inhibit bladder cancer by gambogic acid

3.4 GA抑制UM-UC-3細胞的增殖能力

CCK-8實驗結果顯示，GA處理24 h后，與對照組相比，各實驗組UM-UC-3細胞的增殖均受到抑制，見表2；細胞克隆形成實驗結果顯示，與對照組相比，各實驗組的克隆形成數目均降低，見圖5。提示GA可抑制UM-UC-3細胞的增殖能力。

表2 藤黃酸對UM-UC-3細胞增殖能力的影響(±s，n＝3)Tab 2 Effect of gambogic acid on the proliferation ability of UM-UC-3 cells (±s，n＝3)

表2 藤黃酸對UM-UC-3細胞增殖能力的影響(±s，n＝3)Tab 2 Effect of gambogic acid on the proliferation ability of UM-UC-3 cells (±s，n＝3)

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Note：Compared with the control group，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.

組別藥物作用時間OD值增殖抑制率/%對照組GA 40 μmol·L－1組GA 80 μmol·L－1組GA 160 μmol·L－1組24 h1.64±0.11－24 h1.43±0.08*13.79±1.23 24 h1.30±0.12**21.52±2.79 24 h1.08±0.05***36.92±3.40對照組GA 40 μmol·L－1組GA 80 μmol·L－1組GA 160 μmol·L－1組48 h3.46±0.02－48 h2.59±0.04***22.67±3.52 48 h2.11±0.10***37.01±2.41 48 h1.42±0.18***55.05±0.94 72 h4.22±0.08－72 h2.59±0.05***38.54±0.61 72 h1.98±0.05***53.09±2.12 72 h1.44±0.01***65.76±0.47對照組GA 40 μmol·L－1組GA 80 μmol·L－1組GA 160 μmol·L－1組

圖5 藤黃酸對UM-UC-3細胞克隆形成能力的影響Fig 5 Effect of gambogic acid on the colony formation of UM-UC-3 cells

3.5 GA抑制UM-UC-3細胞的遷移和侵襲能力

細胞劃痕實驗結果顯示，GA處理24 h后，與對照組相比，各實驗組UM-UC-3細胞的劃痕愈合面積降低，見圖6；Transwell實驗結果顯示，GA處理24 h后，與對照組相比，各實驗組UMUC-3細胞的遷移和侵襲數均降低，見圖7。提示GA抑制UM-UC-3細胞的遷移和侵襲能力。

圖6 藤黃酸對UM-UC-3細胞遷移能力的影響（×200）Fig 6 Effect of gambogic acid on the migration of UM-UC-3 cells（×200）

圖7 藤黃酸對UM-UC-3細胞遷移和侵襲能力的影響（×200）Fig 7 Effect of gambogic acid on the migration and invasion ability of UM-UC-3 cells（×200）

3.6 GA促進UM-UC-3細胞的凋亡

細胞凋亡檢測實驗結果顯示，GA處理24 h后，與對照組相比，各實驗組UM-UC-3細胞的凋亡率均增加，見圖8。提示GA可促進UM-UC-3細胞的凋亡。

圖8 藤黃酸對UM-UC-3細胞凋亡的影響Fig 8 Effect of gambogic acid on the apoptosis of UM-UC-3 cells

3.7 GA調控UM-UC-3細胞PI3K/AKT/FoxO1信號通路的表達

Western blot 實驗結果顯示，GA處理24 h后，與對照組相比，各實驗組UM-UC-3細胞的AKT蛋白表達水平未見變化，PI3K、p-PI3K均下調，FoxO1表達量上調；與對照組相比，GA 80、160 μmol·L－1組 UM-UC-3細胞的p-AKT表達量下調，見圖9。提示GA可以下調PI3K、p-PI3K、p-AKT的表達，上調FoxO1的表達。

圖9 藤黃酸對UM-UC-3細胞PI3K/AKT/FoxO1信號通路相關蛋白表達的影響Fig 9 Effect of gambogic acid on the expression of PI3K/AKT/FoxO1 signaling pathway-related proteins in UM-UC-3 cells

4 討論

研究表明，中藥可以直接抑制腫瘤的進展，也能減少化療、放療引起的不良反應，目前已經被廣泛運用于腫瘤的輔助治療上，具有一定的療效[10]。GA是近年的研究熱點之一，有多項研究發現GA具有抗腫瘤作用。例如GA以劑量依賴的方式抑制前列腺癌細胞的增殖能力，并誘導其凋亡[11]。此外，GA可以抑制結腸癌HCT116和CT26細胞的增殖、遷移和侵襲，并引發抗腫瘤免疫反應[12]。本研究發現，與對照組相比，GA處理后UM-UC-3細胞的增殖、遷移、侵襲能力均下降，提示GA可以抑制UM-UC-3細胞的增殖、遷移和侵襲能力；流式細胞術結果顯示，GA處理后UM-UC-3細胞的凋亡率高于對照組，提示GA可以促進UM-UC-3細胞的凋亡。

本研究通過網絡藥理學分析，篩選出57個GA抑制膀胱癌的潛在靶點，其中EP300和NOS2是中介中心性最高的兩個靶點。研究表明，EP300在膀胱癌中易發生突變，引起抗腫瘤免疫反應[13]。NOS2已被證明在多種癌癥中高表達，并且可作為癌癥預后的不良預測因子[14]。KEGG通路富集分析顯示GA抑制膀胱癌與PI3K/AKT、HIF-1和FoxO1信號通路具有較高相關性。HIF-1是一個在生物體代謝過程中起關鍵作用的調節因子，在多種良性或惡性腫瘤的表達均上調[15]。FoxO是一個可調節多種生物過程的轉錄因子，在細胞的衰老、凋亡、分化、DNA損傷修復等方面都能發揮功能，并且具有抑癌作用[16]。PI3K/AKT信號通路是細胞內最重要的信號通路之一，參與多種細胞功能；但PI3K/AKT信號通路在癌癥的發展過程中往往會過度激活，促進癌癥的發展[17]。研究發現，FoxO轉錄因子在多種癌癥的發展過程中會作為PI3K/AKT信號通路的下游靶點而受到抑制[18]。例如PI3K/AKT信號通路通過抑制FoxO1的磷酸化，調控hnRNP-F蛋白的表達，進而促進膀胱癌的增殖[19]。因此，本研究選擇PI3K/AKT/FoxO1通路，通過Western blot進行驗證，結果顯示GA可以下調PI3K、p-PI3K、p-AKT的表達，并上調FoxO1的表達，所以推測GA抑制膀胱癌的作用可能和PI3K/AKT/FoxO1信號通路有關。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學及細胞實驗方法，探討了GA抑制膀胱癌的作用及可能機制。研究表明，GA可以抑制膀胱癌UM-UC-3細胞的增殖、遷移、侵襲能力，并促進其凋亡；其機制可能與調控PI3K/AKT/FoxO1信號通路有關。但本研究存在一定的不足之處，研究機制不夠深入，后續需通過挽救實驗及動物實驗進一步驗證。