青蒿素類化合物抗腫瘤作用機制研究進展

盛思晗，沈征武1，*（1.上海交通大學醫學院，上海 0005；.上海中醫藥大學中藥學院，上海 0103）

青蒿素（artemisinin，見圖1）是20世紀70年代從傳統中藥菊科植物黃花蒿中分離提取的一種含有過氧橋結構的倍半萜內酯化合物，具有強大的抗瘧活性[1]。近年來，有大量研究報道了青蒿素及其衍生物在抗腫瘤方面的作用[2-4]。青蒿素類衍生物包括雙氫青蒿素、蒿甲醚及青蒿琥酯（見圖1）。目前臨床上主要使用的是蒿甲醚和青蒿琥酯。一項英國的隨機雙盲臨床試驗顯示，口服青蒿琥酯片可降低結直腸癌的復發率，并且具有良好的耐受性[5]。對于垂體腺瘤患者，口服蒿甲醚12個月后，CT掃描顯示其腫瘤密度降低，相關癥狀和體征明顯緩解[6]。研究表明青蒿素及其衍生物具有開發為新型抗腫瘤藥物的潛力。

圖1 青蒿素及其常見衍生物的結構Fig 1 Chemical structure of artemisinin and its common derivatives

然而，青蒿素及其衍生物的抗腫瘤機制尚未完全闡明，許多關鍵問題仍然存在爭議。首先，青蒿素對腫瘤細胞特有的細胞毒性尚未被完全了解，這種特異性可能源于腫瘤細胞比正常細胞有更高的血紅素合成能力[7]。其次，青蒿素類衍生物作用的靶標和具體作用機制尚不明確，青蒿素可以作用于多種關鍵的生物途徑，導致腫瘤細胞死亡，其中較為關鍵的信號通路包括P38-MAPK信號通路、PI3K/Akt信號通路、Ras信號通路、NF-κB信號通路和Wnt/β-catenin信號通路[8-9]。鑒于青蒿素類衍生物的多重靶向性，可以通過高通量的研究方法對其作用機制進行系統性探索。

1 青蒿素及其衍生物的抗腫瘤作用機制

1.1 青蒿素及其衍生物的激活

青蒿素過氧橋被激活后斷裂，產生大量的自由基，參與蛋白質的烷基化[10]。過氧橋結構對抗瘧和抗腫瘤作用至關重要。然而，激活過氧橋的確切機制仍存在爭議，游離亞鐵與血紅素都被認為是過氧橋的激活劑。腫瘤細胞表達高濃度的細胞表面轉鐵蛋白受體，通過內吞作用促進血漿鐵轉運蛋白的攝取。青蒿素可通過與轉鐵蛋白共價標記被腫瘤細胞選擇性地富集[11]。與正常細胞相比，腫瘤細胞具有更高的細胞鐵含量，這為青蒿素的抗腫瘤特異性提供了一個合理的解釋，即腫瘤細胞的富鐵環境導致青蒿素的活化增強[2]。Zhang等[12]發現添加亞鐵血紅素的合成前體可以增加青蒿素對細胞的毒性，加入亞鐵血紅素合成抑制劑（SA）則抑制青蒿素的細胞毒性。熒光探針檢測結果顯示，青蒿素治療后的活性氧生成與血紅素合成和細胞毒性成正相關。Stockwin等[13]發現添加血紅素加氧酶可以抑制青蒿素二聚體的抗腫瘤活性。

蛋白質組學（proteomics）是系統生物學的重要組成部分，能快速準確地解釋藥物分子作用機制。Wang等[14]利用炔烴官能化的青蒿素探針AP1（見圖2）與熒光染料偶聯，監測其與瘧原蟲蛋白的結合。只有在添加血紅素后，AP1探針才能與靶點蛋白結合，在血紅素還原劑的存在下這種結合能力會進一步增強。Wang等[15]在腫瘤細胞中也發現類似的激活機制，青蒿琥酯對結直腸癌（CRC）細胞的特異性細胞毒性是由于腫瘤細胞中血紅素合成能力的提高。添加血紅素合成前體ALA（α-氨基乙酰丙酸）可以顯著增加AP1對結直腸癌細胞的毒性以及與癌蛋白的結合，進而抑制腫瘤生長。Zhou等[16]使用青蒿素探針ART-yne（見圖2）對HeLa細胞蛋白質組進行了研究，在氯化血紅素的存在下，青蒿素探針通過共價修飾多種蛋白質，約80種蛋白質被富集并鑒定為青蒿素烷基化靶標。Zhang等[17]通過化學蛋白質組學方法研究了青蒿素在腫瘤細胞中的作用機制，基于游離血紅素是青蒿素類化合物的激活劑，他們設計并合成了青蒿素衍生物ART-TPP（見圖2），以點擊化學發光法證明炔基化的青蒿素探針ART-TPP-AlK（見圖2）中的TPP基團可以有效地將青蒿素導入線粒體。與青蒿素相比，ART-TPP對腫瘤細胞具有更強的抑制作用。以上結果表明，血紅素在青蒿素活化中起主要作用，而不是游離亞鐵離子。這可能是青蒿素類衍生物抗腫瘤作用的分子機制之一。

圖2 青蒿素探針Fig 2 Artemisinin probes

青蒿素被激活后產生活性氧自由基（ROS），其包括羥基、超氧物和過氧化氫[18]，ROS可以誘導細胞膜、DNA、蛋白質和細胞器的損傷，在細胞自噬、凋亡和周期阻滯中起重要作用[19-20]。與正常細胞相比，腫瘤細胞抗氧化酶的表達水平比正常細胞低，因此對ROS損傷更為敏感。由此推測青蒿素的抗腫瘤作用可能依賴于ROS的產生[21]。Mercer等[22]發現，用青蒿琥酯處理HeLa細胞16 h后，細胞中ROS水平增加，48 h后細胞毒性作用才出現，該實驗表明ROS損傷是青蒿琥酯對抗腫瘤作用的起點。Greenshields等[23]發現青蒿琥酯處理的卵巢癌細胞表現出強烈的ROS誘導和細胞增殖周期阻滯。其中ROS依賴性細胞增殖周期阻滯于G2/M期，而非ROS依賴性細胞周期阻滯于G1期。不同的細胞周期阻滯取決于卵巢癌細胞暴露的青蒿琥酯濃度。Wang等[24]發現，雙氫青蒿素可以通過誘導ROS的產生，使K562細胞內線粒體功能紊亂并引發細胞自噬。然而Lu 等[25]的研究表明雙氫青蒿素誘導 HL-60 細胞線粒體損傷和細胞凋亡是通過激活p38 MAPK信號通路，而與 ROS 無關，因為細胞內 ROS 的含量沒有變化，并且雙氫青蒿素在不同細胞內不一定都能產生 ROS，可能與細胞的不同生物學背景有關，青蒿素及其衍生物的活性氧機制仍在研究中。

1.2 誘導腫瘤細胞周期阻滯

細胞周期紊亂和失控性生長幾乎是所有腫瘤的共同特征[26]。青蒿素及其衍生物能夠調控細胞周期相關基因的表達，阻斷細胞周期進程，從而發揮抗腫瘤作用。Mondal等[27]研究發現，青蒿素可誘導宮頸癌細胞發生G0/G1期細胞周期阻滯，并推測這可能是通過下調G0/G1期細胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4的表達，上調周期蛋白p21Waf1/Cip1的表達，從而影響細胞有絲分裂，抑制腫瘤細胞的增殖。雙氫青蒿素在體內外顯著抑制HCT116、DLD1和RKO細胞的增殖，全基因組RNA-seq分析發現雙氫青蒿素誘導的差異表達基因主要富集在細胞周期途徑中，包括CDK1、CCNB1和PLK1。分子對接結果表明雙氫青蒿素與CDK1/CCNB1復合物之間存在較強的結合[28]。青蒿琥酯可以通過下調CDK2、CDK4、Cyclin D1、Cyclin B1的表達，將膠質母細胞瘤細胞系A172、U87、U251的細胞周期阻滯在G0/G1期[29]。青蒿琥酯劑量依賴性地抑制BRL-3A和AML12小鼠肝細胞的增殖，使得其細胞增殖周期阻滯于G0/G1期。Western blot結果顯示青蒿琥酯可誘導CDK2、CDK4、Cyclin D1和Cyclin E1顯著下調[30]。上述研究顯示，青蒿素類衍生物在不同的腫瘤細胞系中可以導致細胞周期阻滯發生在G0/G1或G2/M期，具體取決于細胞系的差異。

1.3 誘導腫瘤細胞凋亡

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主有序的死亡過程，旨在維持內環境穩定。青蒿素類衍生物主要通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，其敏感性與腫瘤細胞中抗凋亡基因和促凋亡基因的表達水平相關。大量研究已經報道，青蒿素類衍生物在多種腫瘤細胞中具有顯著的凋亡誘導作用。Jamalzadeh等[31]發現經青蒿琥酯處理的乳腺癌細胞中，caspase-8、caspase-9、caspase-3的水平顯著升高，表明青蒿琥酯通過內源性和外源性半胱氨酸蛋白酶依賴途徑誘導細胞凋亡，從而抑制乳腺癌MCF-7細胞的生長。另外，Xiao等[32]的研究發現，在A-253細胞中，青蒿素上調了Bax、Bim、Bad、Bak蛋白的表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL的表達，并釋放了細胞色素C進入細胞質。此外，青蒿素還可以增加ROS的生成，進一步激活促凋亡蛋白PARP1和caspase-3，從而引發細胞凋亡。雙氫青蒿素對Jurkat淋巴瘤細胞具有明顯的增殖抑制作用，細胞凋亡率與藥物濃度成正相關。Western blot分析結果顯示，凋亡相關基因p53、c-caspase3、Bax和cPARP的蛋白表達顯著增加，Bcl-2蛋白表達則降低[33]。青蒿素衍生物誘導腫瘤細胞發生凋亡可能是其有效的作用機制之一。

1.4 誘導腫瘤細胞自噬

自噬是細胞為清除功能失調的細胞器或錯誤折疊的蛋白質而進行的進化保守過程[34]。自噬通過清除受損細胞和細胞器，發揮機體對腫瘤細胞的抑制作用，從而限制細胞增殖。在惡性腫瘤發生的早期階段，自噬發揮抑制腫瘤的作用。Li等[35]的研究發現，在上皮性卵巢癌中，青蒿素可通過誘導自噬來干預細胞周期相關的NF-κB信號通路，使腫瘤細胞周期停滯于G2/M期，從而抑制其生長。雙氫青蒿素可促進人舌鱗腫瘤細胞發生自噬，經雙氫青蒿素處理后的腫瘤細胞中，自噬體形成標志蛋白（LC3-Ⅲ）和自噬起始因子（Beclin-1）的表達明顯增加[36]。經青蒿琥酯處理的惡性淋巴瘤細胞中，可以觀察到自噬小體出現，并且自噬相關蛋白Beclin-1及LC3-Ⅰ/Ⅱ的表達也增加[37]。PI3K/AKT/mTOR信號通路是自噬的經典負調控途徑，雙氫青蒿素通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，來促進SMMC-7721細胞自噬，并抑制人肝癌SMMC-7721細胞的增殖[38]。青蒿素類衍生物能誘導多種腫瘤細胞發生自噬性細胞死亡，如腦膠質瘤細胞和結腸癌細胞等[39-40]。

1.5 抑制腫瘤血管生成

血管生成在腫瘤的生長和轉移中起重要作用。青蒿素類衍生物能夠通過調節不同癌細胞株的血管內皮生長因子（VEGF）來抑制血管生成。在血管生成調節因子中，VEGF及其受體（VEGFR2和VEGFR1）都是生理和病理條件下最有效的血管生成刺激因子。Verma等[41]通過動物模型實驗證明，青蒿琥酯能下調β-連環蛋白（β-catenin）信號傳導，降低VEGF及基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）等血管生成標志物的水平，抑制血管生成，發揮抗腫瘤作用。雙氫青蒿素通過上調ETS-1轉錄因子抑制VEGFR1介導的促血管生成反應，誘導VEGFR1的表達[42]。因此，青蒿素類衍生物通過抑制血管生成相關基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的促血管生成作用。因此，青蒿素類衍生物通過抑制血管生成相關基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的促血管生成作用。

1.6 降低腫瘤細胞耐藥性

腫瘤化療受到藥物毒性和腫瘤耐藥性的限制，其中多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）最為常見。MDR表現為細胞內游離的細胞毒性藥物濃度較低，這通常與蛋白膜轉運蛋白有關，如P-糖蛋白（ABCB1/MDR1/P-gp）、多藥耐藥相關蛋白（MRPs）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP/ABCG2）和肺耐藥蛋白等，它們通過三磷酸腺苷（ATP）將藥物排出細胞外，從而降低藥物功效[43]。青蒿素與傳統的抗腫瘤藥物作用機制不同，不會出現交叉耐藥，并且可逆轉腫瘤細胞的多重耐藥。Zhang等[44]研究發現，雙氫青蒿素可以抑制腫瘤細胞中P-糖蛋白的表達，增強腫瘤細胞對順鉑的敏感性。青蒿素類衍生物還可以增加多藥耐藥的腫瘤細胞中吡柔比星和阿霉素的細胞毒性[45]。食管癌組織中ABCG2的異常高表達與食管癌的多藥耐藥有關。研究顯示青蒿琥酯可以調節腫瘤細胞中ABCG2的表達，逆轉食管癌的耐藥性[46]。青蒿素衍生物還可抑制轉運蛋白的表達，當與其他化療藥物聯合使用時，可增加細胞內藥物的濃度，從而在一定程度上緩解腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。青蒿素類衍生物顯示出降低腫瘤細胞耐藥性的潛力，可通過抑制耐藥相關蛋白的表達，增強化療藥物的療效，有可能為腫瘤治療提供新的策略和途徑。

1.7 免疫調節作用

腫瘤免疫治療旨在激發或調動機體的免疫系統，增強腫瘤微環境中免疫細胞對腫瘤的活性，以控制和殺傷腫瘤細胞。然而，近年來部分腫瘤免疫治療的效果并不理想，其中一部分原因是機體未能產生免疫應答或免疫抑制[47]。有研究表明，青蒿素在不同的疾病模型可能具有雙向調節免疫系統的作用[48]。青蒿素通過促進T細胞活化和抑制腫瘤中調節性T細胞（Tregs）及髓系抑制細胞（MDSCs）的免疫抑制來抑制4T1腫瘤細胞在體內的生長[49]。適當濃度的雙氫青蒿素有助于T細胞的增殖，增強T細胞介導的對胰腺癌細胞的殺傷活性，其機制可能是通過增加細胞內穿孔素、顆粒酶B和IFN-γ的分泌來提高T細胞的抗腫瘤活性[50]。雙氫青蒿素-熊去氧膽酸偶聯物可以抑制多種腫瘤細胞的增殖，并且在裸鼠的A549異種移植瘤和小鼠的Lewis肺癌模型中也顯示出體內抗腫瘤活性[51]。進一步的研究表明該化合物可以抑制PI3K/Akt、NF-κB和MAPK信號通路，進而抑制T細胞的增殖與激活，抑制IFN-γ的產生，表現出強烈的免疫抑制活性，因而具有治療自身免疫性疾病的潛力[52]。由于PI3K/Akt、NF-κB和MAPK信號通路不僅與細胞免疫相關，也與腫瘤的發生和發展密切相關。因此，青蒿素類化合物有可能是與上述信號通路共同的調節因子結合，而表現出腫瘤抑制和免疫抑制的雙重活性。同樣，青蒿琥酯可抑制NF-κB、PI3K/Akt、JAK/STAT和MAPK通路，具有治療類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡和潰瘍性結腸炎等自身免疫性疾病的潛力[53]。雙氫青蒿素對系統性紅斑狼瘡小鼠的Treg/Th17具有免疫調節作用，通過恢復Treg/Th17平衡來減輕系統性紅斑狼瘡癥狀[54]。因此，通過對青蒿素作用機制的深入研究，有可能開發出治療腫瘤及自身免疫性疾病的新型青蒿素類藥物[55]。

2 總結

青蒿素類化合物在體內外抗腫瘤實驗中，展現出高效和廣譜的抗腫瘤效果。然而，關于青蒿素類化合物的抗腫瘤作用機制存在眾多且復雜的觀點，有些觀點甚至相互矛盾。綜合文獻報道，青蒿素類化合物主要的抗腫瘤作用機制包括產生ROS損傷、阻滯腫瘤細胞周期、誘導細胞凋亡和抑制腫瘤細胞血管生成，從而減少腫瘤細胞的侵襲和轉移。至于青蒿素類化合物究竟是以某種特定作用機制為主，還是通過多種作用機制共同發揮抗腫瘤作用，仍需進一步研究。與傳統化療藥物相比，青蒿素類化合物具有降低腫瘤耐藥性和調節腫瘤免疫的潛力，這可能成為未來研究的重點。然而，在臨床實踐中，青蒿素類化合物作為抗腫瘤藥物的使用案例相對較少。此外，青蒿素類化合物產生抗腫瘤效應的靶蛋白尚未明確，通過結合化學生物學與蛋白質組學的研究，可以更好地了解青蒿素類化合物的細胞和分子機制，有可能發現青蒿素類化合物治療腫瘤的真正作用靶點，這對于進一步開發青蒿素類抗腫瘤藥物具有重要意義。