不同處方美沙拉秦（嗪）腸溶片中相關雜質的分析

吳琦琦，劉軼，周明，李帥，李曉燕，劉雁鳴，文亮（湖南省藥品檢驗檢測研究院，長沙 410001）

美沙拉秦（嗪），化學名為5-氨基-2-羥基苯甲酸[1-2]，是臨床治療潰瘍性結腸炎和克羅恩病的一線藥物[3-4]。由瑞典PharmaciaAB公司開發，于英國TillotsLabs公司1985年首次上市。目前國內共有3家企業生產。本品已知雜質共有16種[5]，大多含有硝基苯或氨基苯結構片段，具有潛在的基因毒性。通過基因毒性預測軟件Derek和Sarah分析，其雜質A、雜質B、雜質C、雜質E、雜質I、雜質J、雜質M、雜質N、雜質S均為陽性，其中雜質A為對氨基酚，因可誘導DNA的斷裂而具有明確的遺傳毒性?！稓W洲藥典》對這些雜質進行了嚴格的控制；而國內現行質量標準有3個，部分標準缺失有關物質項，部分標準雜質檢出能力差，可能會存在質量風險。潰瘍性結腸炎和克羅恩病根治困難、易反復發作，一旦患病，往往需要長期服藥[6]。因此，亟須對其首選藥物——美沙拉秦（嗪）腸溶片上市后的安全性、有效性及質量可控性進行相關的評價性研究[7]。

1 儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀、Agilent 1260 2D-6120二維液質聯用儀（美國安捷倫公司）；梅特勒托利多V20水分測定儀（瑞士梅特勒托利多公司）；瑞士萬通XP205電子天平（精度0.01 mg）。

美沙拉秦（嗪）腸溶片：企業1（51批次樣品）、企業2（32批次樣品）、企業3（32批次樣品）；甲醇為色譜純，磷酸氫二鉀、10%四丁基氫氧化銨水溶液為分析純，水為純化水。

2 方法

2.1 液相色譜條件

色譜柱為Agilent1 C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相A為磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二鉀4.35 g，加水溶解并稀釋至1000 mL，用磷酸調pH值至7.2）-TBAH溶液[取10%四丁基氫氧化銨水溶液80 mL，加水稀釋至200 mL，用硫酸溶液（1→2）調節pH值至7.5]-甲醇-水（250∶50∶100∶600）；流動相B為磷酸鹽緩沖液-TBAH溶液-甲醇-水（250∶50∶500∶200），按表1梯度洗脫，流速為1.0 mL·min－1；柱溫為40℃；檢測波長為240 nm；進樣量為10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution

2.2 質譜參數

采用ESI離子源、正離子及負離子全掃描模式，m/z范圍為70～1000，掃描時間0.2 s，噴霧電壓2.5 kV，去溶劑溫度500℃，去溶劑氣體800 L·h－1。

2.3 溶液的制備

取供試品10片，研細，精密稱取細粉適量（約相當于美沙拉秦40 mg），置100 mL量瓶中，加甲醇20 mL和0.2 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液0.5 mL，置500 mL量瓶中，用0.2 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。臨用時新制。

3 結果

3.1 雜質譜

采用“2.1”項下條件對115批美沙拉秦（嗪）腸溶片樣品進行了分析，結果如圖1所示。主要檢出4種雜質，雜質3為歐洲藥典中雜質G，3家企業樣品均有檢出，其余為未知雜質，且均為企業1生產的樣品特有。各雜質含量測定結果如表2所示。

圖1 美沙拉秦（嗪）腸溶片雜質譜Fig 1 Impurity spectrum of mesalazine enteric-coated tablets

表2 各雜質含量測定結果(%)Tab 2 Content of impurities (%)

3.2 雜質1、雜質2來源分析

首先考慮是否為原輔料引入。各企業所用原輔料如表3所示。將企業1所用原輔料分別采用“2.1”項下條件測定，結果如圖2所示，均無該3個雜質峰，證明不是原輔料直接引入。

圖2 企業1原輔料色譜圖Fig 2 API and excipients chromatograms of enterprise 1

表3 美沙拉秦(嗪)腸溶片處方Tab 3 Prescription of mesalazine enteric-coated tablets

從該企業的留樣庫里調取了5批留樣（均為本次研究涉及的批次），采用“2.1”項下條件進樣測定，結果與市售樣品一致。提示該雜質可能在出廠時已經存在，不由儲存產生。

取處方量的原輔料進行壓片前工藝的模擬，分別于原輔料混合、制粒、60℃干燥3 h 3個步驟取樣測試。結果如圖3所示，從原輔料混合后，雜質1就開始出現，并在制粒、干燥后該雜質逐漸增多。

圖3 企業1制粒過程樣品色譜圖Fig 3 Chromatogram of sample pelletizing process from enterprise 1

對比3家企業所用輔料，發現乳糖、微晶纖維素和滑石粉是企業1所特有，分析乳糖的結構發現，乳糖是由葡萄糖及半乳糖所組成的雙糖，即由葡萄糖的第四個碳原子上的羥基與半乳糖中第一個碳原子的β-半縮醛羥基失水成苷鍵而得。因此仍然保持著葡萄糖分子上所含醛基的還原性。如圖4所示，美沙拉秦結構中含有伯胺基，在加熱的條件下能與還原糖發生羰氨反應（Maillard反應），氨基與羰基縮合生成席夫堿。溫度20～25℃即可發生Maillard反應，一般每相差10℃，反應速度相差3～5倍，30℃以上速度加快，高于80℃時，反應速度受溫度和氧氣影響小。水分含量在10%～15%時，反應易發生。該企業工藝參數顯示，本品為濕法制粒，干燥溫度為60℃，均利于Maillard反應的發生。

圖4 乳糖與美沙拉秦的反應Fig 4 Reaction of lactose with mesalazine

用“2.2”項下方法測試雜質1的分子量，如圖5所示，在負離子模式下，分子離子峰質荷比為476，正離子模式下，分子離子峰的質荷比為478，證明該雜質的分子量為477。乳糖的分子量為342，美沙拉秦的分子量為153，兩者縮合脫水后的分子量恰好就是477。雜質2與雜質1質荷比相同，可能為雜質1的異構體。

圖5 雜質1質譜圖Fig 5 Mass spectrum of impurity 1

綜上所述，雜質1可能為輔料乳糖與美沙拉秦原料在生產過程中發生了Mailard而產生的。

3.3 雜質4來源分析

與同企業未檢出雜質4批次的樣品比較，檢出雜質4的樣品除去包衣后的片芯顏色都偏深，且片子硬度偏軟，其水分分別為3.24%與3.41%。于企業1留樣庫里調取了同批次的留樣進行測定，結果如表4所示。從企業留樣庫里調取的同樣批次的樣品均未檢出雜質4，片芯顏色均顯類白色，且片子硬度較大，水分值分別為1.94%與2.08%。提示樣品在流通儲存過程中發生了變化（硬度變小，水分增加），該雜質可能于流通儲存環節中產生。

表4 不同來源美沙拉秦樣品中雜質4的檢測情況Tab 4 Detection of impurity 4 in mesalazine samples from different sources

將美沙拉秦原料及3個企業的樣品分別進行高溫、高濕、光照、高溫＋高濕四種條件的影響因素試驗，結果如表5所示。在單獨的光照、高溫及高濕的條件下，本品的性狀及雜質4沒有改變，但在高溫及高濕的共同作用下，企業1樣品的性狀發生了改變，同時產生了雜質4（見圖6）。企業2及企業3樣品的性狀均未發生改變，也未產生雜質4。

圖6 企業1雜質色譜圖Fig 6 Impurity chromatogram of enterprise 1

表5 各因素對不同來源美沙拉秦樣品中雜質4的影響Tab 5 Effect of various factors on impurity 4 in mesalazine samples from different sources

分析各企業處方發現，企業1使用了輔料微晶纖維素。微晶纖維素吸濕性強，在高濕度下會吸濕增加水分，水分作為反應介質，增加了系統的塑性和分子流動性，同時形成水膜，反應就在此發生，進一步引起美沙拉秦降解，雜質顯著增加。

企業2和企業3的處方未使用微晶纖維素，其樣品比較穩定，高溫高濕放置7 d后，性狀未發生變化，雜質未見增加。

用LC-MS測試雜質4的分子量，結果如圖7所示，負離子模式下，分子離子峰質荷比為260；正離子模式下，分子離子峰的質荷比為262。證明該雜質的分子量為261。

圖7 雜質4質譜圖Fig 7 Mass spectrum of impurity 4

根據其分子量初步推測，雜質4的結構可能為圖8所示。具體情況還有待進一步研究證實。

圖8 雜質4可能的結構圖Fig 8 Possible structure of impurity 4

4 討論

4.1 不同處方的樣品雜質譜有較大差異

本文對市售各企業多批樣品進行了有關物質考察，共檢出4個主要雜質，其中雜質1、雜質2和雜質4為企業1生產的樣品的特有雜質，雜質3為所有樣品的共有雜質。提示不同處方的樣品雜質譜有較大差異。

4.2 企業1處方不合理，應對其進行變更

雜質1、雜質2為企業1處方中輔料與原料發生反應產生的，同時，企業1處方中的輔料還可能會促進雜質4的生成。提示企業1處方不合理，應對其進行變更。

4.3 原輔料相容性應引起重視

《藥用輔料與藥物相容性研究指導原則》指出：藥物制劑中各種藥用輔料、藥用輔料的雜質及藥物活性成分之間不得發生化學反應，不產生新化學成分或雜質，進而不影響藥物的療效。乳糖與美沙拉秦會產生Maillard反應，生成雜質，含美沙拉秦的制劑中應避免使用乳糖作為輔料。

微晶纖維素吸濕性強，在高濕度下會吸濕增加水分，可能會引起美沙拉秦降解速率的增大，使制劑雜質顯著增加，含美沙拉秦的制劑中也應避免使用微晶纖維素作為輔料。

4.4 小結

本文對目前市售的不同處方的美沙拉秦（嗪）腸溶片的雜質進行全面分析，通過建立新的雜質檢測方法及雜質譜，從雜質種類、雜質個數、雜質來源、不同處方樣品的穩定性等方面進行分析，從而對其產品質量及生產工藝進行評價，同時，使各企業對自身產品質量狀況、同品種質量現狀以及產品質量改進等各方面有客觀的認識和了解，為藥品監督管理部門今后對美沙拉秦（嗪）腸溶片的監督管理提供了參考。