黃芪-莪術-重樓配伍調控巨噬細胞極化對結直腸癌細胞增殖、遷移影響

杜利莉,王鋼,梁研,趙凡,應佳輝,尹剛,唐德才,卞勇

(1.南京中醫藥大學實驗動物中心,江蘇 南京 210023;2.南京中醫藥大學中醫學院,江蘇 南京 210023;3.南京中醫藥大學藥學院,江蘇 南京 210023)

結直腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤,發病率和死亡率逐年上升[1]。腫瘤中主要浸潤的巨噬細胞即腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophages,TAMs),在不同刺激條件下可極化為不同表型,即經典激活的M1表型和交替激活的M2表型。其中,M2型巨噬細胞具有免疫抑制,參與腫瘤細胞增殖,參與淋巴管、血管生成和轉移以及更具治療耐藥性等特性[2]。研究顯示,結直腸癌中TAMs傾向于轉化為具有促癌作用的M2表型,通過分泌生長因子促進結直腸癌增殖、侵襲、遷移和血管生成,并通過分泌趨化因子募集調節性T細胞,抑制T細胞和NK細胞的抗腫瘤免疫作用,中斷免疫細胞相互作用,產生結直腸癌免疫抑制微環境[3]。介導腫瘤微環境的免疫抑制和免疫逃逸的M2型巨噬細胞的靶向治療已成為改善結直腸癌治療效果和患者預后的潛在方法[4-5]。

黃芪補氣固表,莪術活血祛瘀,重樓清熱解毒,互相配伍相使,在結直腸癌臨床治療中具有較好的抗腫瘤轉移、降低復發率效果[6]。研究表明,黃芪、莪術、重樓三者復合相使能明顯降低結腸癌裸鼠模型原位瘤的體積和肝轉移灶數[7]。黃芪-莪術-重樓配伍又能通過降低血管內皮通透性、抑制腫瘤侵襲性偽足的形成及成熟,從而抑制結直腸癌轉移[8-9]。另有研究顯示,黃芪、莪術、重樓均具有抗腫瘤和免疫調節作用[10-12]。黃芪-莪術配伍能抑制M2型巨噬細胞極化及其向腫瘤微環境的浸潤,從而抑制結直腸癌細胞生長和轉移[13]。因此,本研究擬基于巨噬細胞極化探究黃芪-莪術-重樓配伍抗結直腸癌生長轉移的作用及機制,為黃芪-莪術-重樓配伍的臨床應用提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗細胞

人單核細胞THP-1、結直腸癌細胞HCT116均購于中國科學院細胞庫。

1.2 主要藥物與試劑

黃芪為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao的干燥根;莪術為溫郁金CurcumawenyujinY. H. Chen et C. Ling的干燥根莖;重樓為云南重樓ParispolyphyllaSmith var. yunanensis (Franch.) Hand.-Mazz.的干燥根莖。上述藥材飲片均購自江蘇省中醫院中藥房,并由南京中醫藥大學陸兔林教授鑒定。

胎牛血清(上海諾娃,AB-FBS-0500S,);佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)(美國Sigma,P1585);人IL-4(美國PeproTech,96-200-04-5);CCK-8試劑盒(上海碧云天,C0039);IL-10 ELISA試劑盒(上海酶聯,m1064299);TNF-α ELISA試劑盒(上海酶聯,m1077385);TGF-β ELISA試劑盒(上海酶聯,m1064258);RNA提取試劑盒(南京諾唯贊,R711);反轉錄酶試劑盒(南京諾唯贊,R223-01);SYBR qPCR試劑盒(南京諾唯贊,Q711-02);RIPA裂解液(蘇州新賽美,WB3100);PMSF(上海碧云天,ST506);蛋白磷酸酶抑制劑(北京索萊寶,P1260);Anti-IL-10抗體(英國Abcam,ab133575);Anti-CD206抗體(英國Abcam,ab64693);Anti-ARG1抗體(英國Abcam,ab96183);Anti-TNF-α抗體(英國Abcam,ab307164);Anti-iNOS抗體(英國Abcam,ab178945);Anti-GLS抗體(英國Abcam,ab156876);Anti-GAPDH抗體(武漢三鷹,10494-1-AP);HRP Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(武漢三鷹,SA00001-2)。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(蘇州凈化,SW-CJ-1FD),CO2培養箱(美國Thermo,BB150),Countstar細胞計數儀(上海睿鈺,IC1000),酶標儀(瑞士Tecan,Infinite M1000 Pro),倒置顯微鏡(德國Leica,ebq100-04),熒光定量PCR儀(杭州朗基,Q2000A),垂直電泳儀(武漢賽維爾,SVE-2),化學發光儀(北京君意,JY-ClearECL)。

2 方法

2.1 黃芪-莪術-重樓配伍凍干粉制備

參照前期研究[8-9],按藥物用量比例4∶2∶3取黃芪、莪術、重樓飲片,浸泡0.5 h后,煎煮、過濾收集濾液。旋轉蒸發濃縮為生藥量濃度為1 g·mL-1的藥液,-80 ℃冷凍過夜,次日于凍干機進行凍干,得到黃芪-莪術-重樓配伍凍干粉,得率11.76%,-20 ℃保存備用。使用時稱量所需量的凍干粉溶于細胞培養基中,并用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾除菌。

2.2 細胞培養

THP-1細胞、HCT116細胞分別培養于含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液的RPMI-1640培養基及DMEM培養基中,并置于37 ℃,5%CO2的細胞培養箱培養。

2.3 M0、M2型巨噬細胞誘導極化

取對數生長期的THP-1細胞接種于6孔板中,接種密度為每孔5×105個。加入100 ng·mL-1PMA刺激24 h,細胞貼壁誘導分化為M0型巨噬細胞;PMA誘導24 h后更換培養基并加入20 ng·mL-1IL-4刺激48 h誘導其向M2型巨噬細胞極化。

2.4 CCK-8檢測細胞活力

2.4.1 黃芪-莪術-重樓配伍濃度篩選 取對數生長期的THP-1細胞,用含100 ng·mL-1PMA的培養基重懸后,取每孔100 μL接種于96孔板中,接種密度為每孔1×104個,于37 ℃,5%CO2的細胞培養箱中培養。24 h后更換培養液分別為含0、0.5、1、2、4、8、10 mg·mL-1黃芪-莪術-重樓配伍凍干粉的培養基,培養箱中繼續培養。48 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑,孵育2 h后,酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度(OD值)。

2.4.2 細胞分組給藥 確定黃芪-莪術-重樓配伍濃度后,THP-1細胞經PMA處理后,分為M0組(PMA處理)、M2組(PMA+IL-4處理)、M2+黃芪-莪術-重樓組(PMA+IL-4+黃芪-莪術-重樓配伍處理)。各組給藥處理48 h后更換培養基為無血清培養基,繼續培養24 h,取上清,離心,制成條件培養基(CM)。取HCT116細胞以每孔6×103個接種于96孔板,24 h后更換培養基為CM,細胞分為M0-CM組、M2-CM組、M2+黃芪-莪術-重樓-CM組。培養24 h后加入CCK-8 溶液孵育后檢測OD值, 探討培養細胞上清對HCT116細胞增殖的影響。

按公式:細胞存活率=(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%,計算細胞存活率。

2.5 qPCR檢測IL-10、CD206、ARG1、TNF-α、iNOS、IL-1β、GLS mRNA表達水平

按2.4.2項下THP-1細胞分組進行給藥,培養48 h后收集細胞。使用Freezol Reagent和反轉錄酶試劑盒提取RNA并合成cDNA。按ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix說明書進行IL-10、IL-1β、TNF-α、iNOS、GLS mRNA水平檢測。反應條件:95 ℃,30 s;95 ℃,10 s,60 ℃,30 s并收集熒光,共40個循環;60→95 ℃,每隔0.5 ℃讀熒光值生成熔解曲線。以GAPDH作為內參,使用2-ΔΔCt計算相對表達水平。引物由北京擎科生物科技股份有限公司和上海生工生物工程股份有限公司合成,引物序列信息見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.6 Western blot檢測IL-10、CD206、ARG1、TNF-α、iNOS、GLS蛋白表達水平

按2.4.2項下THP-1細胞分組進行給藥,培養48 h后收集細胞,使用RIPA裂解液、PMSF及蛋白磷酸酶抑制劑配制的蛋白裂解液進行總蛋白的提取。SDS-PAGE法進行蛋白電泳、轉膜、封閉,一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育。ECL試劑顯影拍照。采用Image J軟件進行蛋白條帶灰度值分析。

2.7 ELISA法檢測細胞上清IL-10、TGF-β、TNF-α水平

按2.4.2項下THP-1細胞分組進行給藥,培養48 h后收集細胞培養上清,離心去除沉淀物后按ELISA試劑盒說明書檢測細胞培養上清中IL-10、TGF-β、TNF-α水平。

2.8 Transwell實驗檢測結直腸癌細胞遷移

按2.4.2項下HCT116細胞分組并用CM重懸HCT116細胞,吸取200 μL細胞懸液于Transwell小室上方,細胞密度為每孔5×104個。小室下方加入含10%胎牛血清的培養基600 μL。培養24 h后,擦去上室未遷移細胞,經多聚甲醛固定、結晶紫染色后,顯微鏡對遷移細胞進行觀察和計數。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 黃芪-莪術-重樓配伍對巨噬細胞活力的影響

CCK-8結果顯示,0.5、1、2 mg·mL-1黃芪-莪術-重樓配伍對巨噬細胞活力無明顯抑制作用。當黃芪-莪術-重樓配伍濃度達到4、8、10 mg·mL-1時,細胞活力顯著下降且具有劑量依賴性,差異均有統計學意義(P<0.01,P<0.001)(圖1)。因此,選取2 mg·mL-1進行后續實驗。

注:與空白對照組相比,

3.2 黃芪-莪術-重樓配伍對巨噬細胞極化表型標志物mRNA表達水平的影響

與M0組相比,經IL-4誘導的M2組IL-10、CD206、ARG1 mRNA表達均顯著升高(P<0.01,P<0.001,圖2),而經黃芪-莪術-重樓配伍處理的M2+黃芪-莪術-重樓組IL-10、CD206、ARG1 mRNA表達均顯著降低(P<0.05,P<0.01),IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA表達顯著升高(P<0.05,P<0.01)。

注:與M0組相比,**P<0.01,***P<0.001;與M2組相比,

3.3 黃芪-莪術-重樓配伍對巨噬細胞極化表型標志物蛋白表達水平的影響

Western blot結果顯示,與M0組相比,M2組IL-10、CD206、ARG1蛋白表達顯著升高(P<0.01,P<0.001,圖3);與M2組相比,M2+黃芪-莪術-重樓組IL-10、CD206、ARG1蛋白表達均顯著降低(P<0.05,P<0.01),TNF-α、iNOS蛋白表達顯著升高(P<0.01,P<0.001)。

注:與M0組相比,**P<0.01,***P<0.001;與M2組相比,

3.4 黃芪-莪術-重樓配伍對細胞上清中細胞因子水平的影響

ELISA結果顯示,與M0組相比,M2組細胞上清中IL-10、TGF-β水平顯著升高(P<0.01,P<0.001,圖4);與M2組相比,M2+黃芪-莪術-重樓組細胞上清中IL-10、TGF-β水平顯著降低(P<0.05,P<0.01),TNF-α水平顯著升高(P<0.01)。

注:與M0組相比,**P<0.01,***P<0.001;與M2組相比,

3.5 黃芪-莪術-重樓配伍抑制M2型巨噬細胞極化對結直腸癌細胞增殖、遷移的影響

CCK-8結果顯示,與M0-CM組相比,M2-CM組干預顯著促進HCT116細胞增殖(P<0.001,圖5A),M2+黃芪-莪術-重樓-CM組較M2-CM組顯著抑制HCT116細胞增殖(P<0.001)。同時,Transwell遷移實驗結果顯示,與M0-CM組相比,M2-CM組HCT116細胞遷移數顯著增多(P<0.01,圖5B),而與M2-CM組相比,M2+黃芪-莪術-重樓-CM組HCT116細胞遷移數顯著減少(P<0.01)。

注:A.CCK-8檢測HCT116細胞增殖能力,n=4;B.Transwell檢測HCT116遷移能力(×100),n=3;與M0-CM組相比,**P<0.01,***P<0.001;與M2-CM組相比,

3.6 黃芪-莪術-重樓配伍對巨噬細胞GLS mRNA和蛋白表達的影響

qPCR結果顯示,與M0組相比,M2組GLS mRNA水平顯著升高(P<0.01,圖6A);與M2組相比,M2+黃芪-莪術-重樓組GLS mRNA表達顯著下降(P<0.05)。Western blot結果顯示,與M0組相比,M2組GLS蛋白水平顯著升高(P<0.001,圖6B);與M2組相比,M2+黃芪-莪術-重樓組GLS蛋白表達顯著下降(P<0.01)。

注:A.qPCR檢測GLS mRNA表達水平;B.Western blot檢測GLS蛋白表達水平;與M0組相比,**P<0.01,***P<0.001;與M2組相比,

4 討論

腫瘤發生發展常以“虛、瘀、毒”為核心病機。正氣虧虛、瘀血凝滯、癌毒走竄,機體免疫異常,結直腸癌細胞可逃避免疫系統監視進行異常增殖。研究顯示,含黃芪、莪術或重樓的中藥配伍或復方基于此病機進行抗腫瘤治療并取得一定療效[14-15]。在結腸癌原位移植瘤模型小鼠中,黃芪-莪術配伍可下調上皮間質轉化標志物N-cadherin、MMP-7等表達,降低結腸癌免疫相關指標,調節Th17/Treg動態平衡維持腫瘤微環境穩態,抑制腫瘤生長[16]。前期研究已證實,黃芪-莪術-重樓配伍能夠抑制結直腸癌生長和轉移[8-9]?；谇捌谘芯?本文探究黃芪-莪術-重樓配伍調控免疫抗結直腸癌生長轉移的新機制。

巨噬細胞是減輕病原免疫反應和維持腸道內環境穩定的關鍵細胞[17]。巨噬細胞極化與結直腸癌預后相關,且M2型巨噬細胞與較差的結直腸癌特異性生存率相關[18]。Liu等[19]通過體內外實驗證實,黃芪活性成分黃芪甲苷顯著減少M2型巨噬細胞和增加M1型巨噬細胞以抑制結直腸癌CT26細胞增殖并誘導細胞凋亡,減少TGF-β、IL-10等抗炎因子產生,增加腫瘤中TNF-α等促炎因子產生,抑制結直腸癌腫瘤生長;Yu等[20]發現肺癌中重樓皂苷Ⅶ使巨噬細胞轉化為M1型巨噬細胞,招募CD8+T細胞腫瘤內浸潤,發揮抗腫瘤免疫逃逸作用;重樓皂苷Ⅱ誘導微環境中M2型巨噬細胞為M1型,在胃癌荷瘤裸鼠體內表現出良好的抑瘤率[21]。最新研究顯示,黃芪、莪術配伍抑制M2極化進而抑制結直腸癌生長轉移[13]。通過建立巨噬細胞極化模型發現,黃芪-莪術-重樓配伍下調M2型巨噬細胞標志物IL-10、ARG1、CD206 mRNA和蛋白表達(P<0.05,P<0.01),并上調M1型巨噬細胞標志物IL-1β mRNA表達及TNF-α、iNOS mRNA和蛋白表達(P<0.05,P<0.01,P<0.001),同時促進巨噬細胞分泌TNF-α并抑制IL-10、TGF-β分泌(P<0.05,P<0.01),表明黃芪-莪術-重樓配伍對巨噬細胞極化具有調控作用。結合共培養實驗發現,黃芪-莪術-重樓配伍干預巨噬細胞后的細胞培養上清顯著抑制HCT116細胞增殖和遷移(P<0.01,P<0.001),提示黃芪-莪術-重樓可能通過調控巨噬細胞極化抑制結直腸癌生長轉移。

谷氨酰胺代謝與結直腸癌更強的生存能力、耐藥性和不良預后密切相關,抑制谷氨酰胺代謝可增強抗腫瘤免疫反應,降低結直腸癌小鼠腫瘤生長,提高存活率[22-23]。另有研究顯示,谷氨酰胺參與調節巨噬細胞激活和免疫功能,并誘導巨噬細胞極化[24-25]。GLS是調控谷氨酰胺代謝的關鍵酶,可催化谷氨酰胺轉化為谷氨酸,谷氨酸隨后可轉化為α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate,α-KG),作為回補底物參與三羧酸循環,為腫瘤細胞提供增殖、遷移所需能量[26]。Feng等[27]發現,GLS特異性抑制劑可顯著抑制M2型巨噬細胞標記基因表達,而其介導的谷氨酰胺分解可促進M2巨噬細胞浸潤和活化。此外,抑制GLS表達,中斷谷氨酰胺代謝,可上調TNF-α、抑制IL-10等表達,將M2型巨噬細胞極化為M1型,抑制腫瘤生長[28]。前期研究發現,黃芪-莪術-重樓配伍的活性成分之一莪術醇,通過抑制谷氨酰胺酶GLS1表達,中斷谷氨酰胺分解,增加細胞內谷氨酰胺含量并降低谷氨酸、α-KG等水平,抑制結直腸癌侵襲和遷移[29]。本研究探究黃芪-莪術-重樓配伍調控巨噬細胞極化時發現,巨噬細胞中GLS mRNA和蛋白表達顯著下調(P<0.05,P<0.01)。因此,猜測黃芪-莪術-重樓配伍可能通過抑制GLS表達,中斷谷氨酰胺代謝,誘導M2型巨噬細胞極化為M1型巨噬細胞,從而抑制結直腸癌生長、轉移。

綜上,黃芪-莪術-重樓配伍能夠調控巨噬細胞極化抑制結直腸癌細胞增殖、遷移,其機制可能與谷氨酰胺代謝有關。為更全面揭示黃芪-莪術-重樓配伍、谷氨酰胺代謝、巨噬細胞極化、結直腸癌之間的關系,仍需開展更多的體內外實驗進行深入研究,以期為黃芪-莪術-重樓配伍臨床應用提供理論和實驗依據。