明睛顆粒聯合雷珠單抗對濕性年齡相關性黃斑變性纖維血管膜纖維化相關蛋白表達的影響*

李曉宇，梁麗娜，高云，陳強，李佳豪，郭惠怡

（1.中國中醫科學院眼科醫院，北京 100040；2.中國中醫藥循證醫學中心眼科疾病項目組，北京 100040）

年齡相關性黃斑變性（AMD）是一種隨年齡增加而發病率上升并導致患者中心視力下降的疾病，臨床上分為“干性”和“濕性”兩種類型，其中濕性AMD 又稱作新生血管性AMD（nAMD），其主要病理特征是脈絡膜新生血管（CNV）[1]。由于新生血管的結構與功能不健全，導致局部滲出、出血反復發作，繼而發生纖維化改變，最終導致瘢痕形成[2]?？寡軆绕どL因子（VEGF）藥物是治療nAMD 的主流療法，可有效促進CNV 的消退，但發生纖維化改變時，抗VEGF 藥物療效非常有限。有研究表明，黃斑區已出現纖維血管膜或盤狀瘢痕等眼底表現的患者，抗VEGF 藥物對視力提升幾乎沒有任何幫助[3]。明睛顆粒即涼血化瘀方，是國醫大師唐由之根據多年臨床經驗針對nAMD 所創立，方中以蒲黃為君藥，配合二至丸、黃芪、枸杞子、丹參等藥物組成，以達滋陰養血、涼血化瘀之功效[4]。明睛顆粒前期臨床研究結果顯示：單純應用涼血化瘀方治療nAMD，視力有一定程度的提升，視網膜中央厚度（CRT）降低，可穩定眼底出血、滲出情況，是一種安全有效的治療方法[5-6]；明睛顆粒聯合抗VEGF 藥物治療，較單純應用抗VEGF 藥物治療，視力、CRT、眼底出血滲出面積均見到顯著差異（P＜0.05）[7]。由以上臨床研究可以看出，明睛顆粒對nAMD 有一定療效，與抗VEGF 聯合治療效果更為顯著。聯合用藥是否可以抑制nAMD 纖維化過程，減少纖維血管膜生成，突破單純抗VEGF 治療的瓶頸是研究重點。據此，采用兩階段激光法誘導nAMD 纖維血管膜BN 大鼠模型，觀察明睛顆粒與抗VEGF 藥物聯合治療對病變以及纖維化相關蛋白的影響，進一步探討明睛顆粒的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF 級雄性BN 大鼠，8 周齡，體質量（160～180）g，購于北京維通利華公司。實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2021-0006，使用許可證號：SYXK（京）2019-0049，常規飼料適應性喂養7 天，經眼前節及眼底檢查無眼部病變可納入實驗。本實驗經中國中醫科學院眼科醫院倫理委員會通過，實驗動物福利與倫理均符合《實驗動物管理條例》和《北京市實驗動物管理條例》。飼養溫度18～25 ℃，濕度40%～70%，暴露于12 h 光/暗循環，自由飲食、水。

1.2 主要試劑與儀器 復方托吡卡胺滴眼液購自參天制藥（中國）有限公司（生產批號：MP2222）；10%熒光素鈉注射液購自Alcon 公司（生產批號：J0VJ5）；Davidson’s fixative 購自Phygene Biotechnology Co.Ltd 公司生產（生產批號：20220310）；AF488 偶聯同工凝集素B4 購自美國thermo fisher 公司生產（生產批號：2409033）；鹽酸氯胺酮注射液購自浙江九旭藥業有限公司（生產批號：H20223609）；鹽酸賽拉嗪注射液購自敦化市圣達動物藥品有限公司（生產批號：20211001）；兔抗Collagen 1 抗體購自美國Abcam 公司（生產批號：ab270993）；兔抗Fibronectin抗體購自美國Abcam 公司（生產批號：268020）；兔抗α-SMA 抗體購自美國Abcam 公司（生產批號：ab280888）；兔抗TGF-β1 抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司（生產批號：21898）；熒光二抗羊抗兔594 購自美國Abcam 公司（生產批號：ab150077）；DAPI 抗體購自武漢博士德生物工程有限公司（生產批號：AR1176）；RNeasy plus Universal Mini kits 購自德國QIAGEN 公司（生產批號：73404）；iScript cDNA Synthesis Kit 購自美國Bio-Rad 公司（生產批號：1708891）；iTaq Universal SYBR Green Supermix購自美國Bio-Rad 公司（生產批號：1725121）。

Novus Spectra DP 型Nd：YAG 倍頻激光治療機（美國Lumenis 公司）；OPTO-RIS 型視網膜成像系統（英國Optoprobe Science LTD 公司）；Envisu R2210 型光學相干斷層掃描儀（德國Leica 公司）；LSM880 型激光共聚焦掃描顯微鏡（德國ZEISS 公司）；7500 型RT-PCR 檢測儀（ABI 公司）。

2 實驗方法

2.1 兩階段激光誘導大鼠nAMD 纖維血管膜模型建立 鹽酸氯胺酮-鹽酸賽拉嗪混合麻醉劑肌注（4 mL/kg）麻醉BN 大鼠，右眼單眼造模，復方托吡卡胺滴眼液散瞳，0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液局麻。第一階段激光：氪激光在后極部距視盤約2～3 個PD處眼底血管間光凝3、6、9 三個點位，設定參數：光斑直徑100 μm，曝光時間0.1 s，功率280 mW。激光聚焦后一槍擊破Bruch’s 膜，伴有氣泡產生為有效點，若無氣泡產生或傷及血管則為無效點。在第一階段激光后7 d，激光束瞄準7 d 前建立的激光斑，參數設定與第一階段相同，進行第二階段激光[8]。

2.2 分組與給藥 根據ARIFIN 提出的資源方程法進行動物實驗的樣本量計算[9]，組間ANOVA 公式：n=DF/k+1，n 為每組動物數量，k 為組數。取整得n=15，三組共45 只。采用隨機數字表法，將45 只造模后的BN 大鼠隨機分為3 組：模型組、抗VEGF 藥物組（抗VEGF 組）、明睛顆粒聯合抗VEGF 藥物組（MJKL+抗VEGF 組）。模型組：予蒸餾水灌胃；抗VEGF 組：予玻璃體腔注射雷珠單抗注射液，鹽酸氯胺酮-鹽酸賽拉嗪混合麻醉劑肌注（4 mL/kg）麻醉大鼠，復方托吡卡胺滴眼液散瞳。一手固定大鼠頭部并用顯微鑷固定球結膜，另一手持微量注射器沿45°方向從眼球顳側角膜緣外約2 mm 處進針，在瞳孔區看到針尖后，緩慢注射雷珠單抗5 μL/眼。注藥后等待10s 緩慢拔出針頭，以防止藥液外流。術后予左氧氟沙星眼膏涂眼。MJKL+抗VEGF 組：予玻璃體腔注射雷珠單抗注射液同上，同時予明睛顆粒灌胃，灌胃量1 g/mL/只/d。10 只正常BN 大鼠不造模，常規飼養作為對照。造模后1 d 開始給藥，連續給藥40 d。

2.3 眼底彩照（FP）、眼底血管熒光造影（FFA）活體觀察病變 麻醉大鼠，復方托吡卡胺滴眼液充分散大右眼瞳孔，使用OPTO-RIS 型視網膜成像系統對大鼠眼底進行拍照。再將光源轉換到Blue 通道，腹腔注射10%的熒光素鈉注射液0.15～0.2 mL，與顯微鏡鏡頭接觸并調至最佳拍照角度。拍照完成后用氯化鈉注射液沖洗雙眼，用氧氟沙星眼膏點眼以預防感染。通過Image J 對病變面積與光密度值（MD）進行測量。

2.4 光學相干斷層掃描（OCT）活體觀察病變局部高度 打開Envisu R2210 型光學相干斷層掃描儀，將麻醉且瞳孔散大狀態的實驗鼠放于鼠臺，雙眼角膜保持濕潤，通過輕微挪動鼠臺位置與調節旋鈕，使成像清晰。通過Bioptigen Diver 圖像處理軟件與Image J 軟件對病變高度進行測量。

2.5 HE 染色觀察 予過量復合麻醉劑處死BN 大鼠，快速剪斷視神經后取出眼球，固定液中固定后放于石蠟包埋盒，放入全自動組織脫水機進行脫水，將完成脫水的組織裝于已標記好的包埋盒中浸入60 ℃石蠟完成包埋。將蠟塊進行連續石蠟切片，展片烤片后進行HE 染色，室溫晾干后可光學顯微鏡下觀察各組視網膜病理改變。

2.6 視網膜色素上皮（RPE）-脈絡膜-鞏膜鋪片 取材后全眼球置于4%多聚甲醛液中固定24 h 后去除眼前節，再將眼杯置于4%多聚甲醛液中固定1 h，取出眼杯并做4 個放射狀切口，用顯微鑷小心去除視網膜神經上皮層，確認RPE-脈絡膜-鞏膜復合體可完全鋪展；將脈絡膜鋪片置于裝有0.25%Triton溶液的24 孔板，加入2%BSA，加入IB4 凝集素，避光4 ℃孵育24 h。將脈絡膜鋪片鋪展于載玻片上，滴入抗熒光衰減封片劑后封上蓋玻片，4℃避光保存，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2.7 免疫熒光染色分析 在（-23±2）℃下行垂直視網膜的8 μm 冰凍切片，室溫風干后放于-20 ℃冰箱。從-20 ℃取出切片，置于57 ℃恒溫箱中烤片30 min。滴加1%TritonX-100 溶液，快速滴加2%BSA，加入一抗（Collagen-1，Fibronectin，α-SMA，TGF-β1），加入二抗，加DAPI 溶液，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察蛋白表達情況。

2.8 qRT-PCR 采用TRIzol 提取試劑盒提取每組視網膜組織的總RNA，并對RNA 濃度進行測定。根據iScript cDNA Synthesis Kit 試劑盒的相關說明將RNA 經逆轉錄合成cDNA 模板。由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成引物，引物序列見表1。以GAPDH 為內參基因，擴增完成后采用PCR 儀自動分析軟件進行熒光數據分析，用比較Ct 法對各組Collagen-1 mRNA，Fibronectin mRNA，α-SMA mRNA和TGF-β1 mRNA 的表達量進行分析測定。

表1 Primer sequences of qRT-PCR

2.9 統計學分析 采用GraphPad Prism 8.0.1 進行統計分析與圖表制作。計量資料數據采用均數±標準差（±s）表示，符合正態分布且方差齊的計量資料選取單因素方差分析（one-way ANOVA）進行組間的比較，采用LSD-t 檢驗進行兩兩比較；選取t 檢驗進行兩組間的比較。當P＜0.05 時，差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 nAMD 纖維血管膜模型的建立 FP 結果顯示氪激光光凝致使Bruch’s 膜破裂，光凝部位呈灰白色水腫，第一階段激光光凝后，光斑處未見出血；7 d后行第二階段激光，光凝部位呈灰白色水腫，部分光斑處可見到出血。FFA 與OCT 結果顯示：第二階段激光后40 d，纖維血管膜生成。見圖1。

圖1 模型的建立

3.2 明睛顆粒聯合雷珠單抗對纖維血管膜滲漏情況的影響 模型組病變滲出面積與MD 值均較正常組顯著升高（P＜0.05）；抗VEGF 組、MJKL+抗VEGF 組滲出面積與MD 值較模型組顯著降低（P＜0.05）。MJKL+抗VEGF 組MD 值較抗VEGF 組顯著降低（P＜0.05），但滲出面積差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 病變滲漏情況

3.3 明睛顆粒聯合雷珠單抗對纖維血管膜病變高度的影響 模型組病變局部高度值均較正常組顯著升高（P＜0.05）；抗VEGF 組、MJKL+抗VEGF 組較模型組顯著降低（P＜0.05）；MJKL+抗VEGF 組較抗VEGF 組顯著降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 病變高度情況

3.4 明睛顆粒聯合雷珠單抗對視網膜病理組織改變的影響 H&E 染色結果示：正常組視網膜結構完整，排列清晰有序；模型組造模后40 d，光斑處視網膜神經上皮層水腫隆起、視網膜結構紊亂、纖維血管膜形成最為明顯；抗VEGF 組視網膜結構損傷程度較模型組明顯減輕；MJKL+抗VEGF 組視網膜結構損傷程度最輕。見圖4。

3.5 明睛顆粒聯合雷珠單抗對病變面積的影響 脈絡膜鋪片結果顯示：正常組未見病變，模型組病變面積較正常組顯著增大（P＜0.05）；抗VEGF 組、MJKL+抗VEGF 組較模型組顯著減少（P＜0.05）；MJKL+抗VEGF 組較抗VEGF 組顯著減少（P＜0.05）。見圖5。

圖5 脈絡膜鋪片顯示病變面積

3.6 明睛顆粒聯合雷珠單抗對蛋白表達的影響 Collagen-1、Fibronectin、TGF-β1 熒光強度結果顯示：模型組均顯著高于正常組（P＜0.05）；抗VEGF組、MJKL+抗VEGF 組顯著低于模型組（P＜0.05）；MJKL+抗VEGF 組較抗VEGF 組顯著降低（P＜0.05）。α-SMA 熒光強度結果顯示：模型組顯著高于正常組（P＜0.05）；抗VEGF 組、MJKL+抗VEGF 組顯著低于模型組（P＜0.05）；但MJKL+抗VEGF 組與抗VEGF組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖6、圖7。

圖6 免疫熒光顯示Collagen-1、Fibronectin、α-SMA、TGF-β1 表達

3.7 明睛顆粒聯合雷珠單抗對mRNA 相對表達量的影響 Collagen-1 mRNA、Fibronectin mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA 相對表達量結果顯示：模型組均顯著高于正常組（P＜0.05）；抗VEGF 組、MJKL+抗VEGF 組顯著低于模型組（P ＜0.05）；MJKL+抗VEGF 組顯著低于抗VEGF 組（P＜0.05）。見圖8。

圖8 qRT-PCR 顯示Collagen-1 mRNA、Fibronectin mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA 相對表達量

4 討論

新生血管的管壁結構畸形脆弱，容易導致滲漏與出血，這種管壁的破壞與引發的局部炎癥可釋放基質細胞和免疫細胞，從而促使新生血管內皮束向纖維血管膜的轉變，這一轉化過程被稱作“血管纖維化轉換”[10]。在血管纖維化轉換過程中，視網膜色素上皮細胞、內皮細胞和部分巨噬細胞發生凋亡，導致纖維化成分占據病變的主導地位。CNV 的纖維化改變雖然可以對滲出起到一定限制發展的作用，但過度纖維化最終會導致視網膜下瘢痕形成，以至于永久性的黃斑形態改變和視力喪失[11]。臨床上，nAMD 黃斑區纖維血管膜的改變表現為視網膜內或視網膜下的黃白色隆起區域，邊界較為清楚，通常含有血管組織，其形成、發展過程與成纖維細胞、細胞生長因子及細胞外基質的共同作用有關。為了剖析繼發于nAMD 的視網膜下纖維化的機制，首先要建立合適的動物模型。本研究在傳統一次激光建立CNV 模型的基礎上[12]，改進為通過兩階段的激光灼傷以誘導滲漏或出血，相較于傳統的激光造模法，兩階段激光使病灶面積更大，持續時間長，且具有高水平的纖連蛋白表達。在第二階段激光造模后40d，FP 可見邊界清晰的灰黃色改變，伴有出血、滲出及水腫，OCT 示中高反射，組織病理學可見纖維化改變且病變處可檢測到纖維化相關蛋白的表達，與nAMD 纖維血管膜改變相符。該模型的建立，更加適合于研究黃斑纖維化的發病機制和評價抗nAMD 的治療藥物[10]。

隨著抗VEGF 藥物在臨床的廣泛應用，抗VEGF藥物雖然可以在短期內快速控制并改善病情，但越來越多的研究發現應用抗VEGF 藥物治療后期可出現纖維化改變，嚴重影響患者視力。Heier 等[13]予nAMD 患者每月1 次玻璃體腔注射雷珠單抗，連續給藥24 月，隨訪2～6 年后發現，過半的患者出現了黃斑區纖維化。Roman 等[14]發現nAMD 患者接受貝伐單抗治療后發生了RPE 撕裂現象，認為與血管的纖維化有關。此外，Hwang 等[15]報道了黃斑區沒有明顯出血的患者在接受抗VEGF 藥物治療后也發生了嚴重的黃斑部纖維化病變，由此說明纖維化改變并非出血引起，而應用抗纖維化療法可能對患者后期視力有益。nAMD 纖維血管膜在中醫病名中并無記載，根據其癥狀，可歸為“視瞻昏渺”“視直如曲”“暴盲”等范疇。本病與年老體弱有關，以虛為本，因虛致病，虛實夾雜。與陽明脈衰、生化乏源，天癸竭、天真衰，筋不動、肝氣衰等病機有關[16]。國醫大師唐由之根據多年臨床經驗認為nAMD 的基本病機為肝腎陰虛為本，虛火灼絡為標，臨床診療nAMD 應以涼血化瘀為主要治法，創立涼血化瘀方（即明睛顆粒），在提升視力，改善眼底出血、滲出情況，均起到一定作用[17-18]。在抗VEGF 藥物的基礎上聯合明睛顆粒的治療方案，或可提升抗VEGF 藥物的療效范圍與作用時間，中西醫結合治療方案或許是當下nAMD 后期纖維化改變的突破點。

多種細胞因子及蛋白參與了纖維化過程，如轉化生長因子-β1（TGF-β1）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、1 型膠原蛋白（Collagen-1）及纖維連接蛋白（FN）等[19-20]。轉化生長因子-β（TGF-β）具有調節細胞生長、增殖、分化的作用，是促進細胞外基質的形成并抑制其降解的主要介質，在纖維形成過程中起主導作用。TGF-β1 是纖維化過程中的關鍵調節因子，可以激活下游的Smad 信號，從而促進新生血管生成、成纖維細胞增生、肌成纖維細胞分化、基質沉積、膠原合成等病理過程，引起組織發生纖維化改變。Gian 等[21]研究發現nAMD 患者中TGF-β1 持續升高，表明TGF-β1 參與了nAMD，且TGF-β1 的作用與VEGFA 無關。Collagen-1（Ⅰ型膠原）是軟組織纖維化的最終效應分子。在Col1α1-GFP 小鼠中，脈絡膜血管系統中的部分周細胞被GFP 標記，用作譜系示蹤劑來研究周細胞在視網膜下纖維化中的作用，結果顯示將脈絡膜血管周圍生態位確定為光凝后視網膜下纖維化的新來源。在TGF-β1 高表達的轉基因小鼠模型中，Collagen-1 基因表達上調，組織纖維化改變更為明顯。因此，通過調控TGF-β1 的表達來抑制Collagen-1 的過度形成從而減少組織纖維化形成值得進一步探索與研究。此外，成年哺乳動物含有大量間質及血管周圍的成纖維細胞，它們能夠轉化為肌成纖維細胞，從而表達收縮性蛋白，如α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）。纖維連接蛋白（FN）廣泛存在于動物組織和組織液中，有研究表明，纖維化組織中成纖維細胞表面FN 呈過度表達狀態。

本實驗結果顯示：與單純抗VEGF 組相比，MJKL+抗VEGF 組在病變滲出強度、病變面積、病變高度等方面改善程度更為顯著，從形態學及組織病理學方面顯示出聯合治療的優勢。而從纖維化相關蛋白表達分析來看，MJKL+抗VEGF 組Collagen-1、Fibronectin、TGF-β1、α-SMA 因子的熒光強度和mRNA 相對表達量亦均低于抗VEGF 組。由此可見，明睛顆粒聯合抗VEGF 藥物，較單純應用抗VEGF 藥物能更好地抑制實驗性nAMD 纖維血管膜生長。此外，課題組同期進行了明睛顆粒治療nAMD的前瞻性、隨機、雙盲、安慰劑平行對照、多中心的臨床研究，結果顯示在最佳矯正視力、黃斑出血面積與滲出面積中均可見到明睛顆粒聯合抗VEGF藥物組優于單純應用抗VEGF 組，且隨訪1 年時聯合用藥組纖維化發生率為25%，而單純應用抗VEGF 組為31.43%，與本次動物實驗結果相一致。

綜上，本研究通過對兩階段激光建立實驗性nAMD 纖維血管膜模型進行研究，發現明睛顆粒聯合抗VEGF 藥物較單一應用抗VEGF 藥物，在降低TGF-β1、Collagen-1、Fibronectin、α-SMA 纖維化相關蛋白的表達及抑制纖維血管膜病變中顯示出更強的作用，提示明睛顆?？赡芡ㄟ^降低纖維化相關蛋白的表達水平，對nAMD 后期纖維化改變起到一定的抑制作用。本結果為明睛顆粒在nAMD 中晚期的應用提供了理論基礎，亦為中藥聯合抗VEGF 藥物治療提供了實驗依據。