星狀神經節離斷對脊髓損傷大鼠中樞性疼痛行為及CREB SGK1 NF-κB蛋白表達的影響

鄧莉麗 毛冬梅 廖澤青 姚 旌

1）貴州醫科大學研究生院，貴州 貴陽 550004 2）貴州醫科大學附屬醫院，貴州 貴陽 550004

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是指因創傷、炎癥、腫瘤或其他原因造成脊髓結構和功能受損，導致運動、感覺和自主神經功能障礙［1-2］。據統計，SCI年發病率（15～40）/1 000 000 人，跌倒和道路傷害是其主要原因［3］。SCI 給患病家庭帶來巨大的經濟負擔，常引起頑固性中樞神經痛（central pain，CP），嚴重影響患者生活質量及感覺運動功能的恢復。星狀神經節離斷已在臨床應用近一個世紀，用于治療多種疾病，包括復雜的局部疼痛綜合征和外周血管疾?。?］。研究報道，星狀神經節離斷可緩解中樞神經系統病變造成的頑固性疼痛［5］。關于星狀神經節離斷對SCI的影響研究鮮有報道，其具體作用機制也尚不清楚。最新研究發現，在SCI構建的大鼠中樞性疼痛模型中，脊髓丘腦束神經元中的環磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）被激活，而脊髓丘腦束神經元是將疼痛傳遞到脊髓上區域的投射神經元，表明SCI 后的CP 與CREB激活有關［6］。同時，Xu等［7］發現白藜蘆醇可通過抑制核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號通路改善SCI。血清和糖皮質激素調節蛋白激酶1（serum and glucocorticoid-inducible kinase 1，SGK1），對于CREB、細胞功能、離子通道和膜轉運蛋白、NF-κB 及許多其他重要轉錄調節因子水平均具有重要調節作用［8］，Yasukochi 等［9］發現，抑制脊髓中的SGK1 可減輕小鼠神經性疼痛超敏反應。本研究旨在探究星狀神經節離斷對SCI 大鼠中樞性疼痛行為及CREB、SGK1、NF-κB蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級雄性SD 大鼠（200～250 g）購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號SYXK（黔）2018-0001，實驗方案經本院動物倫理委員會審核通過。

1.2 主要試劑白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司；前列腺素E2（PGE2）試劑盒購自上海莼試生物技術有限公司；CREB、SGK1、NF-κB p65、GAPDH 抗體購自Abcam；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢普諾賽生命科技有限公司；Megafuge?8 小型臺式系列離心機購自賽默飛世爾科技公司。

1.3 造模及分組將SD 大鼠按隨機分配原則分成假手術組（Sham 組）、模型組（Model 組）、治療組（Treat 組），各6 例。Model 組、Treat 組大鼠構建SCI模型，大鼠參考文獻［10］的方法構建SCI 模型，將大鼠麻醉后，沿著背部皮膚進行1 cm的中線切口，并對脊椎T10水平區域上的肌肉層進行鈍性解剖，以暴露T10脊椎椎板，隨后進行T10椎體背側椎板切除術，將薄鐵片放置在脊髓上，10 g 的鐵球（直徑2.5 mm）從10 cm 的高度自由下落，導致脊髓嚴重挫傷，然后縫合肌肉和皮膚，術后3 d 使用頭孢呋辛鈉預防感染。在損傷后7 d 內每天行2 次手動輔助膀胱排尿，直至重新建立膀胱反射。根據BBB 運動功能評分、機械痛閾試驗和熱痛閾試驗判斷SCI 模型是否構建成功。Sham 組未使用鐵球砸脊髓，其他步驟相同。Treat 組大鼠在構建SCI 模型后，在頸部正中剪一切口，觀察到梭型的頸上神經節位于右側頸總動脈的分叉處背側面，在其斜向外下方約3 mm處可見一個淡黃色團塊，即為頸交感神經干（右星狀神經節），在近心端將其離斷，最后消毒、縫合傷口［11］。

1.4 運動功能學評價所有大鼠在造模結束2 周后均參照BBB 運動功能評分進行雙盲測量評分。0～7分可評判雙下肢各個關節的活動，8～13 分可觀察雙下肢步態是否協調，14～21 分主要評判運動中爪的精細動作水平（評分標準：正常狀態評分為21 分，后肢癱瘓評分為0 分）。實驗動物置于100 cm×100 cm的開放區域內進行，觀察大鼠雙下肢肢體活動，對其進行評分。

1.5 機械痛閾試驗和熱痛閾試驗首先將大鼠置于透明箱子內適應30 min，隨后用一根vonfrey 細絲從2.0 g 的壓力值垂直刺激大鼠右后腳足底中部皮膚，逐漸增加壓力值，當大鼠出現抬足和舔足行為時，繼續測試3 次，刺激間隔3 min，記錄此時的刺激強度，即為機械縮足反射閾值（paw withdrawal threshold，PWT）。

將大鼠置于溫度50～51 ℃的熱平板上，當大鼠出現抬足和舔足行為時，記錄產生此行為的最短時間即為熱縮足潛伏期（paw withdrawal latency，PWL），每只大鼠測試3次，間隔3 min。

1.6 樣本采集在進行運動功能學評價以及機械痛閾試驗和熱痛閾試驗后，對各組大鼠進行取材。大鼠麻醉成功后通過腹主動脈采取3 mL 血液，隨后迅速取出T10損傷節段脊髓大約6 mm，均分為2段，一段固定在4%多聚甲醛進行HE染色、TUNEL染色；一段用于Western Blot試驗。

1.7 ELISA 法檢測血清炎性因子和致痛因子水平取收集的血液應用賽默飛世爾科技公司的Megafuge?8小型臺式系列離心機以4 500 r/min的速度離心獲得上清液，參照試劑盒檢測IL-1β、TNF-α、PGE2水平。

1.8 HE染色檢測脊髓組織病理變化取固定在4%多聚甲醛的脊髓組織用梯度乙醇在脫水機中脫水，隨后將蠟浸泡過的組織嵌入包埋機中，將修剪好的蠟塊放在石蠟切片機上制備4 μm的切片，將石蠟切片脫蠟至水后蘇木素-伊紅染色，脫水封片，最后在顯微鏡下鏡檢采集圖像分析脊髓組織病理變化。

1.9 TUNEL 染色檢測細胞凋亡取各處理組石蠟切片，將切片經脫蠟后置于乙醇溶液中，隨后將玻片置于4%多聚甲醛孵育15 min，去除殘液后置于PBS孵育15 min，每個樣本滴加100 μL濃度20 g/mL的蛋白酶K溶液，用PBS沖洗3次后加入DAPI染色，在熒光顯微鏡下成像，并計數細胞凋亡數量。

1.10 Western Blot 檢測CREB、SGK1、NF-κB p65通路蛋白表達取脊髓組織研磨后加入RIPA 裂解液提取總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度后，經凝膠電泳分離蛋白，轉移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉，加入一抗CREB（1∶2 000）、SGK1（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶2 000）和GAPDH 抗體（1∶1 000），4 ℃過夜，TBST洗滌后加入二抗，TBST洗膜，加ECL曝光顯色，凝膠成像系統分析目的蛋白，ImagJ軟件計算蛋白灰度值。

1.11 統計學分析采用SPSS 25.0統計學軟件分析數據，數據在進行正態分布和方差齊性檢驗后以均數±標準差（±s）表示，單因素方差分析多組間數據，SNK-q 檢驗比較2 組間數據。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學觀察和運動功能學評估與Sham 組相比，Model組大鼠BBB運動功能評分、PWT、PWL值顯著下降（P＜0.05）；與Model 組相比，Treat 組BBB 運動功能評分、PWT、PWL值顯著升高（P＜0.05）。見表1、圖1。

圖1 星狀神經節離斷對大鼠BBB運動功能評分、PWT、PWL值的影響Figure 1 Effect of stellate ganglion transection on BBB motor function score，PWT，and PWL values in rats

表1 各組大鼠星狀神經節離斷后的BBB運動功能評分、PWT、PWL值 （±s）Table 1 BBB motor function scores，PWT，and PWL values of rat stellate ganglion transection in each group （±s）

表1 各組大鼠星狀神經節離斷后的BBB運動功能評分、PWT、PWL值 （±s）Table 1 BBB motor function scores，PWT，and PWL values of rat stellate ganglion transection in each group （±s）

組別Sham組Model組Treat組BBB運動功能評分/分20.37±2.13 5.12±0.54 10.49±1.21 PWT/g 17.76±1.19 7.84±0.79 10.17±1.10 PWL/s 14.65±2.34 6.34±0.68 8.87±0.90

2.2 星狀神經節離斷對大鼠炎性因子及PGE2 的影響由圖2 可知，與Sham 組相比，Model 組大鼠IL-1 β、TNF-α、PGE2 水平顯著升高（P＜0.05）；與Model 組相比，Treat 組IL-1β、TNF-α、PGE2 水平顯著降低（P＜0.05）。

圖2 星狀神經節離斷對大鼠炎性因子及PGE2的影響Figure 2 Effect of stellate ganglion disconnection on inflammatory factors and PGE2 in rats

2.3 脊髓組織病理形態學觀察HE 染色顯示，Sham 組大鼠脊髓組織結構形態完好，細胞呈正常形態，神經纖維分布均勻且行走規則。與Sham 組相比，Model 組脊髓組織及細胞完整性破壞嚴重，形成大量空洞，神經纖維排列紊亂，可見大量炎性細胞浸潤。與Model 組相比，Treat 組脊髓組織結構形態明顯改善，脊髓組織空洞化有所好轉，炎性細胞浸潤也減少，神經纖維排列趨于正常。見圖3。

圖3 各組HE染色結果（×200）Figure 3 HE staining results of each group（×200）

2.4 星狀神經節離斷對脊髓組織神經細胞凋亡的影響與Sham組相比，Model組脊髓組織中細胞凋亡數量明顯增加（P＜0.05）；與Model組相比，Treat組脊髓組織中的細胞凋亡數量明顯減少（P＜0.05）。見圖4～5。

圖4 TUNEL染色檢測細胞凋亡（×200）Figure 4 TUNEL staining for detecting cell apoptosis（×200）

圖5 各組大鼠脊椎組織細胞凋亡數量比較Figure 5 Comparison of the number of apoptotic cells in spinal tissue of rats in each group

2.5 星狀神經節離斷對脊髓組織CREB、SGK1、NF-κB p65 蛋白表達水平的影響由圖6～7 可知，與Sham 組相比，Model 組大鼠CREB、SGK1、NF-κB p65 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與Model 組相比，Treat 組CREB、SGK1、NF-κB p65 蛋白水平顯著下降（P＜0.05）。

圖6 各組大鼠CREB、SGK1、NF-κB p65蛋白表達比較Figure 6 Comparison of CREB, SGK1, NF-κ B p65 protein expression in each group

圖7 各組大鼠CREB、SGK1、NF-κB p65蛋白表達比較Figure 7 Comparison of CREB, SGK1, NF-κB p65 protein expression in each group

3 討論

SCI主要癥狀為感覺喪失或損害，損傷的相關繼發性后果是慢性神經性疼痛［12］。約50%的SCI 患者會出現使人衰弱的CP，但尚無有效的治療方法。脊髓損傷后的CP 嚴重影響患者的健康狀況和生活質量［13］。因此，迫切需要尋找有效、安全和新穎的療法［14］。星狀神經節離斷在臨床上已應用十分廣泛，常用于治療各種疼痛綜合征，如慢性區域疼痛綜合征Ⅰ型和Ⅱ型、皰疹后神經痛、頸肩臂綜合征、神經性疼痛［15］。Chaudhary等［16］發現，在頸椎手術期間星狀神經節離斷可減輕CP。本研究參考既往文獻構建SCI 模型，結果發現Sham組大鼠脊髓組織結構形態完好，細胞呈正常形態，神經纖維分布均勻且行走規則，與Sham 組相比，Model 組脊髓組織及細胞完整性破壞嚴重，形成大量空洞，神經纖維排列紊亂，可見大量炎性細胞浸潤，BBB 運動功能評分、PWT、PWL 值顯著下降，表明模型構建成功。星狀神經節離斷治療后脊髓組織結構形態明顯改善，脊髓組織空洞化有所好轉，炎性細胞浸潤減少，神經纖維排列趨于正常，BBB 運動功能評分、PWT、PWL值顯著增加，暗示星狀神經節離斷可能對SCI誘導的CP起到改善效果。

研究報道，急性SCI 早期階段會促進IL-1β和TNF-α等多種促炎性細胞因子的釋放，促使大部分小膠質細胞呈促炎M1 型轉化，同時聚集于SCI 部分，分泌更多的炎性細胞因子，通過形成級聯瀑布效應進一步加重局部炎癥反應，從而造成CP［17］。Song 等［18］發現，通過增加SCI 大鼠PGE2 水平可介導星形膠質細胞炎癥反應。本研究顯示Model 組大鼠IL-1β、TNF-α、PGE2水平顯著升高，而星狀神經節離斷處理后IL-1β、TNF-α、PGE2 水平顯著下降，表明星狀神經節離斷可能通過抑制IL-1β、TNF-α、PGE2的釋放減輕炎癥反應及疼痛，進而對SCI 誘導的CP起改善效果。細胞凋亡又稱“程序性細胞死亡”，Sun等［19］報道，可通過抗炎和抗細胞凋亡機制減輕家兔脊髓缺血再灌注損傷。抑制細胞凋亡可對SCI 大鼠發揮神經保護作用［11］。Turtle等［20］也發現，SCI 引起的疼痛可能與細胞凋亡有關。本研究顯示，Model 組大鼠細胞凋亡數量顯著升高，而星狀神經節離斷處理后細胞凋亡數量顯著減少，表明星狀神經節離斷可能通過抑制細胞炎癥以及細胞凋亡發揮治療SCI 大鼠中樞性疼痛的作用。

SGK1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AGC亞家族的成員，阻斷SGK1可顯著減弱疼痛反應和病理性疼痛的發展。SGK1 在各種類型病理性疼痛的發展中發揮重要作用，且靶向SGK1可能是一種新的疼痛管理治療策略［21］。此外，SGK1 可影響轉錄因子，如CREB、NF-κB p65，并參與炎癥因子和激素的分泌、神經興奮性、細胞增殖和凋亡、細胞代謝等多種生物過程［8，22］。Xiao 等［23］發現SGK1 通過調節NF-κB p65蛋白水平提高嗎啡誘導的大鼠鎮痛耐受。本研究發現Model組大鼠CREB、SGK1、NF-κB p65蛋白水平顯著升高，而星狀神經節離斷治療后CREB、SGK1、NF-κB p65蛋白水平顯著降低，表明星狀神經節離斷可下調CREB、SGK1、NF-κB p65 蛋白水平以及減輕SCI大鼠中樞性疼痛。

星狀神經節離斷可下調SGK1、CREB、NF-κB p65表達，減輕炎癥反應以及疼痛，對SCI大鼠中樞性疼痛起改善作用。本文不足是關于機制方面的研究較淺，下一步將深入研究以完善。