高通量測序聯合動物實驗探索復方澤漆顆粒治療銀屑病的作用機制*

董同同,王久香,吳敏,劉濤峰

1.安徽中醫藥大學,安徽 合肥 230031; 2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院,安徽 合肥 230031

銀屑病(psoriasis,Ps)是一種易復發的皮膚病,又稱“牛皮癬”,以紅斑鱗屑為臨床特征,其發病機制與環境、遺傳及免疫細胞等多種因素相關[1]。此外,精神刺激、氣候變化、吸煙飲酒、不良飲食習慣等也是本病的誘發或加重因素[2]。Ps的全球發病率約為0.09%～5.10%[3],中國發病率約為0.47%[4]。西醫治療Ps主要采用甲氨蝶呤、環孢素、激素類藥物、生物制劑等,這些療法均具有一定療效,但不能根治Ps。相比之下,中藥復方可以整體調節,針對多個生物過程或靶點發揮作用,逐漸成為臨床治療Ps的關注點。

復方澤漆顆粒(皖藥制字BZ20080004號)在臨床上應用多年,療效顯著,且無明顯副作用。前期研究發現,復方澤漆顆粒能夠改善Ps患者臨床癥狀、降低銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(psoriasis area and severity index,PASI)評分、降低血清白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)水平[5-8],但其具體作用機制尚不清楚。因此,本研究基于人體皮膚組織高通量測序結果,采用復方澤漆顆粒對咪喹莫特誘導的Ps小鼠模型進行干預,觀察小鼠皮損組織c-Fos、c-Jun表達情況和表皮層病理學變化,探索復方澤漆顆?？筆s的潛在分子機制。

1 材料

1.1 臨床資料健康組:安徽中醫藥大學第一附屬醫院皮膚科就診的非Ps患者;Ps組:2020年2月至2021年12月在安徽省中醫院皮膚科就診的Ps患者(n=10)。臨床試驗獲安徽中醫藥大學醫學倫理委員會審核批準,倫理審批號:2021AH-50。

1.2 實驗動物BALB/c小鼠60只,體質量18～22 g,由杭州子源實驗動物科技有限公司提供,許可證號:SCXK(浙)2019-0004。動物飼養于安徽中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物房,溫度20～26 ℃,相對濕度30%～50%,通風良好。動物實驗經安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準,倫理審批號:2023023。

1.3 藥物與試劑復方澤漆顆粒[6](由澤漆、白花蛇舌草、大青葉、板藍根、雞血藤、土茯苓、半枝蓮、貫眾、龍膽草、黃芩、莪術、五味子組成,安徽中醫藥大學第一附屬醫院藥劑部提供,批號:20220305);GAPDH抗體、山羊抗兔IgG HRP、山羊抗小鼠IgG HRP(Proteintech公司,貨號:60004-1-1、SA00001-1、SA00001-2);c-Fos抗體、c-Jun抗體(成都正能生物,貨號:340249、R23335);反轉錄試劑盒(上海新貝生物,貨號:R202-02);RNA提取試劑盒(上海奕杉生物,貨號:RN001);濃縮型正常山羊血清、熒光標記山羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司,貨號:AR1009、BA1032);DAPI(碧云天,貨號:C1002)。

1.4 儀器二維電泳系統(天能公司,型號:VE-180);化學發光凝膠成像系統(耶拿公司,型號:CheStudio515);全光譜波段酶標儀(上海賽默飛公司,型號:SkyHigh);熒光定量PCR儀(美國羅氏公司,型號:LightCycler 480Ⅱ);倒置熒光顯微鏡(Olympus 公司,型號:CK40-F200);低速離心機(可成公司,型號:L4-5K);高速冷凍離心機(Kendro公司,型號:D3752)。

2 方法

2.1 臨床皮膚組織制備健康組:取患者的正常皮膚組織;Ps組:治療前,切取患者的皮損組織。采用復方澤漆顆粒治療,溫開水沖服,飯后30 min服用,每次1袋(10 g),每日3次。經臨床評估皮損癥狀好轉后,留取患者的皮膚組織。

2.2 Ps小鼠模型制備實驗前一天刮掉小鼠背部毛發,面積約2 cm×3 cm。在小鼠剃毛部位涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg,連續7 d,每天1次。造模第7天,小鼠背部出現紅斑、鱗屑,提示Ps模型建立成功。

2.3 小鼠分組與給藥將小鼠按隨機數字表法分為空白組、模型組、復方澤漆顆粒組、甲氨蝶呤組,每組15只。除空白組外,其余各組采用“2.2”項方法進行造模。造模首日開始灌胃,劑量按人與小鼠體表面積換算,復方澤漆顆粒、甲氨蝶呤的灌胃劑量為 1 mg·kg-1,空白組與模型組給予等劑量生理鹽水,早晚各1次。

2.4 小鼠皮膚組織制備末次給藥后,1%戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠(60 mg·kg-1),切取小鼠背部皮膚組織進行后續實驗。

2.5 高通量測序技術檢測Ps患者皮膚組織差異表達mRNA健康組和Ps患者治療前后的皮膚組織經Trizol裂解后提取總RNA,使用微量分光光度計測定RNA純度。檢測合格的RNA樣品經過DNase I消化,使用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA,打斷成為短片段,加入隨機引物合成cDNA一鏈、二鏈,連接產物進行PCR反應,進而構建RNAseq文庫,并使用Illumina二代測序技術上機檢測。采用DESeq2軟件對有生物學重復的樣本進行分析,使用R軟件中的phyper函數進行統計檢驗,以|log2FC|≥1、P<0.05篩選差異表達mRNA。通過美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數據庫預測差異表達mRNA的靶基因,物種設置為Homo sapiens,參考基因組版本為GCF_000001405.39_GRCh38.p13。借助R軟件中的phyper函數對靶基因進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以FDR≤0.05篩選KEGG通路。

2.6 Western blot檢測小鼠皮膚組織c-Fos、c-Jun蛋白表達水平使用RIPA裂解緩沖液(PIPAPMSF=1001)提取小鼠皮膚組織總蛋白,配制12%分離膠,行凝膠電泳,轉移蛋白至0.22 μm PVDF膜(低溫,220 mA,1.5 h),使用5%脫脂牛奶封閉2 h。加入c-Fos抗體(1800)、c-Jun抗體(1800),4 ℃孵育過夜。使用磷酸鹽緩沖液(PBST)洗膜3次,每次10 min。二抗(15 000)室溫孵育2 h,PBST洗膜3次,每次10 min。ECL化學發光液顯影,曝光和拍照。運用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,計算目的蛋白的相對表達量。

2.7 qPCR檢測小鼠皮膚組織c-FosmRNA、c-JunmRNA表達水平從小鼠皮膚組織提取總RNA,將mRNA逆轉錄為cDNA。取5 μL cDNA作為模板,進行PCR反應,15 μL擴增體系1 μL模板cDNA、上下游引物各0.25 μL、7.5 μL SYBR Green混合液、6 μL水;擴增條件:95 ℃ 2 min預變性,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,45個循環。以Tubulin作為內參基因,以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。通過Primer 6.0軟件設計引物,由上海新貝生物科技有限公司合成引物,引物序列見表1。

表1 引物序列

2.8 HE染色觀察小鼠皮膚表皮層病理學變化切取各組小鼠背部皮損區域皮膚組織或正常皮膚組織,用4%多聚甲醛溶液固定過夜;組織樣本使用酒精梯度脫水、浸蠟包埋,行組織切片(厚度5 μm);石蠟切片經二甲苯脫蠟,蘇木精、伊紅染色,光學顯微鏡下觀察皮膚組織表皮層病理學改變。

3 結果

3.1 Ps患者治療前后皮膚組織高通量測序結果與治療前比較,Ps患者治療后的皮膚組織中mRNA下調9 670個,mRNA上調8 570個,見圖1A。KEGG結果表明,IL-17信號通路可能是復方澤漆顆粒治療銀屑病的關鍵通路,見圖1B。

注:A:差異表達mRNA火山圖;B:KEGG通路富集氣泡圖。

3.2 Ps患者治療前后皮膚組織c-FosmRNA、c-JunmRNA水平比較激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)是IL-17的下游基因,其家族蛋白(c-Fos、c-Jun)水平降低可導致Ps的發生。高通量測序結果顯示,與健康組比較,Ps患者皮膚組織c-FosmRNA、c-JunmRNA水平降低(P<0.001);與治療前比較,Ps患者治療后c-FosmRNA、c-JunmRNA水平升高(P<0.05),見圖2。

注:與健康組比較,**P<0.001;與Ps患者治療前比較,# P<0.05。

3.3 各組小鼠皮膚組織c-Fos、c-Jun蛋白表達水平比較與空白組比較,模型組小鼠皮膚組織 c-Fos、c-Jun表達水平降低(P<0.001);與模型組比較,復方澤漆顆粒組、甲氨蝶呤組小鼠皮膚組織c-Fos、c-Jun表達水平升高(P<0.05),見圖3。

注:與空白組比較,**P<0.001;與模型組比較,# P<0.05。

3.4 各組小鼠皮膚組織c-FosmRNA、c-JunmRNA水平比較與空白組比較,模型組小鼠皮膚組織c-FosmRNA、c-JunmRNA表達水平下調(P<0.001);與模型組比較,復方澤漆顆粒組、甲氨蝶呤組小鼠皮膚組織c-FosmRNA、c-JunmRNA表達水平上調(P<0.05),見圖4。

注:與空白組比較,** P<0.001;與模型組比較,#P<0.05。

3.5 各組小鼠皮膚表皮層病理學變化比較HE染色結果顯示,與空白組比較,模型組小鼠表皮層明顯增厚,伴有表皮角化過度、表皮突規則向下延伸、棘層增厚;與模型組比較,復方澤漆顆粒組、甲氨蝶呤組小鼠表皮層和棘層變薄,表皮角化程度減輕,見圖5。

圖5 各組小鼠皮膚組織HE染色圖片(×400)

4 討論

中醫學尚無Ps病名,依據其臨床癥狀,將其歸屬于“白疕”范疇。近代皮膚外科專家趙炳南認為本病多因素體血熱或郁久化熱,生風化燥,日久熱結血瘀,客于肌膚,因此提出“從血論治”[9]。復方澤漆顆粒以澤漆、白花蛇舌草、大青葉為君藥,板藍根涼血清熱,雞血藤養血活血,土茯苓清熱利濕,半枝蓮清熱解毒,黃芩、龍膽草清熱燥濕,貫眾清氣分血,莪術破血行氣、消血瘀,諸藥合用可有效清除體內熱毒,達到清熱涼血、解毒散瘀的目的[6]。

研究表明,IL-17與角質形成細胞相互作用介導炎癥反應,從而參與Ps的病理改變。IL-17與IL-17受體或特定的膜結合蛋白相互作用,誘導下游形成核因子κB激活劑1(nuclear factor kappa B activator 1,ACT1)-腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6,TRAF6)復合物,導致AP-1家族蛋白水平降低,從而促使Ps發生[10-11]。AP-1家族是一個復雜的轉錄因子家族,由c-Jun、Jun B、Jun D、c-Fos、FosB、Fra-1、Fra-2等構成[12],其中c-Fos和c-Jun是主要成員,他們在哺乳動物中形成異源二聚體。研究表明,銀屑病進行期皮損組織中c-Fos和c-Jun表達明顯下降,導致角質形成細胞增殖、分化不全及表型異常;在恢復期c-Fos和c-Jun蛋白表達升高[13-14]。另外,c-Jun升高可抑制角質形成細胞增殖[15],c-Fos降低可影響真皮間充質干細胞的增殖能力[16]。c-Fos、c-Jun降低在IL-17通路介導的Ps病理過程中發揮重要作用。

綜上所述,本研究采用高通量測序技術發現 IL-17 信號通路可能是復方澤漆顆粒治療Ps的關鍵通路,c-Fos和c-Jun可能是復方澤漆顆粒治療Ps的關鍵靶點。通過動物實驗初步驗證復方澤漆顆?？赡芡ㄟ^上調皮膚組織c-Fos、c-Jun表達水平從而治療Ps。